煙粉虱MED隱種高溫耐受相關基因特異性探針及其應用的制作方法

本發明涉及基因工程領域，具體地涉及煙粉虱med隱種高溫耐受相關基因特異性探針及其應用。

背景技術：

煙粉虱(bemisiatabaci(gennadius))屬節肢動物門，昆蟲綱，半翅目，粉虱科，小粉虱屬，又稱棉粉虱或甘薯粉虱。

煙粉虱的最適發育溫度為26～30℃，發育臨界溫度在10.8～12.5℃之間，致死高溫區在37～42℃之間。17℃和35℃是煙粉虱正常生長發育的最低和最高的溫度極限。較強的溫度逆境適應能力是煙粉虱在世界范圍內廣泛分布的原因。隨著溫室效應的增加，全球氣溫正逐年增高，煙粉虱較強的溫度逆境適應能力使其能逐漸擴大保護地面積，這為其抵御溫度逆境、延續種群提供給了場所。

通過基因的mrna原位雜交可以解析基因在煙粉虱中定位和表達模式，有助于更深入了解目的基因的作用機制。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種煙粉虱med隱種高溫耐受相關基因的特異性探針。

本發明的再一目的是提供上述煙粉虱med隱種高溫耐受相關基因的特異性探針的應用。

根據本發明的具體實施方式，煙粉虱med隱種高溫耐受相關基因btdnmt3，該基因cdna全長核苷酸序列如seqidno.1所示，其編碼的氨基酸序列如seqidno.2所示。btdnmt3基因的表達直接降低了med隱種對高溫耐受性的能力。

根據本發明的具體實施方式，所述煙粉虱med隱種高溫耐受相關基因的特異性探針通過以引物f：tccaaacacatttcgtcaag和r：tcgcaaataagaactactcctc擴增煙粉虱med隱種高溫耐受相關基因btdnmt3的cdna序列而得。

本發明還提供了上述特異性探針在原位雜交中的應用。

根據本發明的具體實施方式，使用上述煙粉虱btdnmt3基因的特異性探針進行原位雜交的方法包括以下步驟：

(1)根據btdnmt3的cdna序列設計btdnmt3特異的探針序列，以cdna為模板，設計的f和r引物進行普通pcr產物擴增，f：tccaaacacatttcgtcaag

r：tcgcaaataagaactactcctc；

(2)合成btdnmt3的mrna原位雜交的探針，并將探針標記上地高辛；

(3)檢測btdnmt3的mrna探針的原位雜交。

本發明的有益效果是：本發明的mrna探針可以與組織中btdnmt3基因的mrna發生特異性的結合，從而方便準確的觀察到組織中btdnmt3基因mrna水平的變化。本發明的btdnmt3的探針序列，對btdnmt3基因mrna的顯示有明確的特異性，實現了對btdnmt3基因mrna水平的顯示作用。可以將本發明的特異性探針直接用于成蟲進行原位雜交，省去了制作切片步驟，可以降低實驗的復雜性，減少實驗步驟，且具有較高的敏感度，有利于更方便快捷的檢測目的基因在蟲體的定位表達。

附圖說明

圖1顯示根據本發明實施例的煙粉虱btdnmt3基因在雄蟲中的mrna原位表達的示意圖，箭頭所指位置是生殖部位。

圖2顯示根據本發明實施例的煙粉虱btdnmt3基因在雌蟲中的mrna原位表達的示意圖，箭頭所指位置是生殖部位。

具體實施方式

實施例1：煙粉虱med隱種btdnmt3基因全長cdna序列克隆

分別取不同溫度脅迫條件下煙粉虱成蟲200頭放入1.5ml的離心管，液氮冷凍后利用研磨棒將其研成粉末，然后提取rna，-80℃保存以備用。以cdna為模板，利用以下引物，pcr擴增煙粉虱med隱種btdnmt3基因的中間片段。

btdnmt3-f：ctactgctaaactccattcgc

btdnmt3-r：ctctgaaacacggtagtccc

根據所獲得的煙粉虱med隱種btdnmt3基因的中間片段序列，設計5’race和3’race特異性引物，pcr擴增btdnmt3基因的5’和3’端序列：

5’raceinnerprimer:ggaacctctgaaacacggtagtccccaa

5’raceouterprimer:ttgtgacacgcagtgacttcagtgataggt

3’raceinnerprimer:taaccaccaatccaaattccttgcggc

3’raceouterprimer:tggtttggggactaccgtgtttcagagg

獲得btdnmt3基因的cdna序列全長,得到btdnmt3基因4512bp序列，所得的基因具有如seqidno.1所示的核苷酸序列，包含653個核苷酸，該基因所編碼的酶具有如seqidno.2所示的氨基酸序列。

實施例2：btdnmt3基因的表達特性分析

對btdnmt3進行不同組織的表達譜分析，實時熒光定量pcr結果表明，btdnmt3在頭部、胸部和腹部中均有表達，且在腹部顯著高表達。

對btdnmt3進行不同發育階段的表達譜分析，實時熒光定量pcr結果表明，btdnmt3在卵期、一齡、二齡、三齡、四齡、偽蛹、成蟲中具有表達。成蟲之前，在卵期高表達，后表達量逐漸降低，到成蟲再次高表達。

飼喂btdnmt3基因dsrna的煙粉虱med隱種的擊倒時間顯著低于飼喂dsegfp組和蔗糖組的擊倒時間(p<0.05)；同時在ncbi(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)blast顯示，所飼喂的靶序列片度為btdnmt3基因特有的序列，由此確保了干擾效果為煙粉虱med隱種的目的btdnmt3基因所產生，因此，說明btdnmt3基因在煙粉虱med隱種高溫耐受性中起著關鍵作用。

實施例3原位雜交

1、煙粉虱btdnmt3基因的特異性mrna原位雜交探針

(a)以cdna為模板，設計的f和r引物進行普通pcr產物擴增，f：tccaaacacatttcgtcaag；r：tcgcaaataagaactactcctc，

并對產物進行切膠回收與純化，用pgem-teasy感受態細胞，對純化后的pcr產物進行克隆并測序。將測序序列進行比對分析，所得克隆片段為目的基因的片段；

(b)挑取經測序驗證的陽性克隆，按照axyprep質粒dna小量試劑盒中的說明進行操作，提取重組質粒；

(c)對重組質粒進行酶切，采用的酶是sacⅱ。取酶切產物加入苯酚：氯仿：異丙醇混合物(25:24:1)，劇烈震蕩1min后，4℃條件下12000rpm離心10min；轉移上清至無核酸酶的離心管中，加1/10體積的3m醋酸鈉，加2倍體積的冰無水乙醇輕輕混勻，-20℃靜置2.5小時后，4℃條件下14000rpm離心30min；棄上清液，用1ml80％的乙醇洗滌沉淀，反復顛倒洗滌沉淀，4℃條件下14000rpm離心10min；棄乙醇，風干沉淀，加入depc-h2o，溶解沉淀，獲得線性化質粒。

(2)將純化后的產物標記上非放射性標記物-地高辛。

(3)將探針純化。

加2uldnasei，37℃反應15min，去除未反應完全的dna模板；再加0.8ul0.5medta(ph＝8.0)終止反應；加1/10體積的3m醋酸鈉，加2.5倍體積(125ul)冰冷的無水乙醇，-70℃冰箱放置過夜，取出后，4℃條件下14000rpm離心10min；棄上清液，用1ml75％的乙醇洗滌沉淀，反復顛倒洗滌沉淀，4℃條件下14000rpm離心10min；棄上清液，風干沉淀，加入depc-h2o，溶解沉淀，獲得純化后的目的探針。

(4)檢測btdnmt3的mrna探針的原位雜交

(4-1)樣本搜集：在顯微鏡下分別挑取煙粉虱雌雄成蟲置于事先加入200ul1×pbs緩沖液的1.5ml無核酶的離心管中，用槍頭輕輕地反復吸打沖洗，然后吸出1×pbs緩沖液，將蟲體留于管中；

(4-2)取材后蟲體的固定：加入1ml卡諾氏固定液，在4℃條件下固定12h；

(4-3)蟲體的漂洗：移走上一步驟中的液體，保留蟲體于離心管中。加入200ul的50％乙醇進行搖洗，洗三次，每次5min；

(4-4)移走上一步驟中的液體，加入200ul的1×pbs-1％tritonx-100溶液，30℃搖洗30min；

(4-5)蟲體的褪色：移走上一步驟中的液體，加入1ml的6％h2o2的乙醇溶液，室溫下褪色2h；隨后，移走上一步驟中的液體，加入200ul的50％乙醇進行搖洗，洗三次，每次5min；

4-(6)蟲體的透化：移走上一步驟中的液體，加入200ul蛋白酶k，在56℃水浴條件下透化30min；隨后，移走上一步驟中的液體，加入200ul的50％乙醇進行搖洗，洗三次，每次5min；

(4-7)蟲體的再固定：移走上一步驟中的液體，加入1ml的4％多聚甲醛固定液固定液，在4℃條件下固定30min；隨后，移走上一步驟中的液體，加入200ul的50％乙醇進行搖洗，洗三次，每次5min；

(4-8)蟲體的預雜交：移走上一步驟中的液體，加入200ul的預雜交緩沖液，在55℃條件下預雜交15min；

(4-9)蟲體的雜交：移走上一步驟中的液體，加入300ul事先預熱的雜交液(探針濃度為5ng/ul),55℃℃避光孵育過夜。

(4-10)雜交后清洗：移走上一步驟中的液體，將蟲體置于一系列用2×ssc溶液配制的不同濃度的預雜交液進行處理，且在雜交溫度下進行。具體過程如下：分別于預雜交液：2×ssc＝2:1、1:1、1:2的濃度配比下的溶液中各處理15min；后于2×ssc溶液中處理10min；

(4-11)蟲體的封閉：移走上一步驟中的液體，加入200ul按照1:5000的比例用anti-dig-ap于1×blockingreagent中的封閉液，在4℃條件下封閉過夜；

(4-12)移走上一步驟中的液體，加入200ul的1×pbs進行搖洗，洗三次，每次30min；隨后，移走上一步驟中的液體，加入200ul的ap緩沖液，靜置2次，每次10min；

(4-13)蟲體的顯色：移走上一步驟中的液體，在黑暗條件下，加入300ul的hnpp/fastred：ap＝1:1：100顯色液，室溫顯色30min；

(4-14)封片：待顯色后，移走顯色液，終止反應，加入200ul的1×pbs進行搖洗，洗三次，每次5min；

(4-15)固定拍照：將蟲體用80％甘油固定，于digitalmicroscopevhx-2000下進行觀察并拍照。

由圖1、圖2可見btdnmt3在煙粉虱胸部和腹部均有表達，且在腹部靠近生殖部位表達量較強。

<110>中國農業科學院植物保護研究所

<120>煙粉虱med隱種高溫耐受相關基因特異性探針及其應用

<160>2

<210>1

<211>4512

<212>dna

<213>煙粉虱

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