DNA片段與含有該片段的重組載體、構建重組載體的方法及其應用與流程

文檔序號：11193055閱讀：1865來源：國知局

本發明涉及生物醫藥領域，具體涉及dna片段與含有該片段的重組載體、構建重組載體的方法及其應用。

背景技術：

急性白血病是一種比較常見的血液系統惡性腫瘤，是人類致死的主要原因之一。近年來，隨著聯合化療和造血干細胞移植技術的發展，使得白血病及其它血液系統腫瘤的預后不斷改善，然而由于腫瘤的微小殘留病變(mrd)不能被徹底清除，疾病復發率及死亡率較高。

研究發現，核酸疫苗能夠激發白血病患者特異性免疫應答，清除化療后殘余腫瘤細胞，是有望克服mrd的方法之一。padua等將人類早幼粒細胞白血病的pml-rarα融合基因與破傷風毒素基因的c片段序列融合，證實以融合蛋白為特異性靶點的核酸疫苗可以顯著提高患病動物的生存率。mlaa-34基因是與急性單核細胞白血病(aml-m5)發生密切相關的一個新的抗凋亡分子，mlaa-34基因表達下調能顯著抑制u937細胞在體外的增值，同時會誘發白血病細胞的凋亡，并與aml-m5的低生存率等不良預后密切相關，是急性白血病的新腫瘤標志物及基因免疫治療的靶基因。mlaa-34蛋白是胞內蛋白，如何有效遞呈mlaa-34蛋白至白血病細胞膜表面從而持續誘導機體產生特異性細胞免疫并成為效應細胞毒性t細胞(ctl)的靶向分子，是疫苗能否發揮抗白血病作用的關鍵。hsp70與腫瘤的發生、發展、腫瘤免疫和腫瘤的預后等都有密切關系，其具有抗原遞呈功能，能將腫瘤細胞內的抗原信息傳遞至細胞膜上，進而誘導機體產生特異性抗腫瘤免疫應答，且其誘導的免疫應答可不受mhc限制，可以起到很好的抗腫瘤免疫效應，從而起到殺滅腫瘤細胞的作用。

此外，關于核酸疫苗能否整合到宿主基因組上的安全性問題一直備受關注。研究表明，免疫方式對dna疫苗的整合安全性有很大影響，電穿孔免疫方式會導致基因組整合現象，而肌肉注射和基因槍(genegun)免疫方式較為安全，核酸疫苗的質粒dna是以染色體外附加子的形式存在，而不是整合到宿主染色體dna上。

技術實現要素：

本發明的發明目的之一是提供一組dna片段。

本發明的發明目的之二是提供包括上述dna片段的重組載體。

本發明的發明目的之三是提供構建上述重組載體的方法。

本發明的發明目的之四是提供通過上述重組載體進行基因疫苗的制備。

本發明提供的技術方案為：

dna片段，由序列表中的seqidno.1所示的堿基序列組成。

含有外源多核苷酸的重組載體，包含原始載體以及hsp70-mlaa34融合基因；

其中，所述融合基因包含序列表中的seqidno.1所示的堿基序列組成的dna片段。

優選的是，所述原始載體為pires2-egfp質粒。

構建含有外源多核苷酸的重組載體的方法，包括：

步驟一、利用序列表中的seqidno.2和seqidno.3所示的引物序列通過pcr擴增得到含有seqidno.4所示的堿基序列的hsp-70基因；

利用序列表中的seqidno.5和seqidno.6所示的引物序列通過pcr擴增得到含有seqidno.7所示的堿基序列的mlaa-34基因；

步驟二、以hsp-70基因和mlaa-34基因為模板，利用序列表中的seqidno.2和序列表中的seqidno.6所示的引物序列，通過soe-pcr擴增得到序列表中的seqidno.1所示的hsp70-mlaa34融合基因，并且使其含有ecori和bamhi酶切位點；

步驟三、將步驟二所述的hsp70-mlaa34融合基因構建到原始載體上以得到重組載體。

優選的是，所述原始載體為pires2-egfp質粒。

優選的是，包括如權利要求3所述的重組載體以及u937細胞。

優選的是，其轉染方法包括如下：

取u937細胞進行培養并收集對數生長期的細胞進行接種，另取兩份培養基，在其中一份培養基中加入轉染試劑，在另一份中加入含有hsp70-mlaa34融合基因的重組載體，將兩份培養基混合均勻，將混合均勻后的轉染復合物加入到細胞中，混合均勻，將細胞置于37℃、5％co2的培養箱中培養18～48小時；其中，轉染4～6小時后可換新鮮培養基。

優選的是，所述轉染細胞進行轉染方法包括如下：

步驟a、取u937細胞培養于含10％胎牛血清的rpmi1640培養基中，37℃、5％co2培養，每2～3天換液1次，取對數生長期的細胞進行試驗；

步驟b、收集u937細胞并調整細胞濃度至2×10⁵/ml，接種于96孔細胞培養板中，每孔加u937細胞100μl；

步驟c、用50μl的opti-mem培養基稀釋0.8μg含有hsp70-mlaa34融合基因重組載體，輕輕吹吸3～5次混勻；

步驟d、輕輕顛倒混勻轉染試劑，用50μl的opti-mem培養基稀釋2.0μl的lipofectaminetm3000轉染試劑，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置5分鐘；

步驟e、混合所述步驟c的含有重組載體的培養和所述步驟d的轉染試劑，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置20分鐘，得到轉染復合物；

步驟f、將所述轉染復合物加入到24孔細胞板中，100μl/孔，前后輕搖細胞板混合均勻；

步驟g、將細胞板置于37℃、5％co2培養箱中培養18～48小時；其中，轉染4～6小時后可換新鮮培養基。

使用包括所述的重組載體制備基因疫苗，所述重組載體包含序列表中的seqidno.1所示的堿基序列組成的dna片段。

本發明與現有技術相比較所具有的有益效果：

1、核酸疫苗導入宿主體內后可被抗原提呈細胞或機體組織細胞攝取，在細胞內表達蛋白抗原，刺激機體產生細胞免疫和體液免疫，免疫保護作用好；

2、通過soe-pcr技術在設計引物時，重疊序列可以是基因序列上的任意位點，不需要考慮融合位點及其附近特殊序列，通過特定的重疊互補序列的引物作為橋梁，從而使pcr擴增產物末端形成了相同的重疊鏈，通過重疊鏈的延伸將pcr擴增片段拼接起來，從而將兩個目的基因融合在一起，相比于限制性內切酶的酶切和連接酶的連接更加簡便快捷。

附圖說明

圖1為soe-pcr法擴增hsp70-mlaa34融合基因經1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；其中，1為分子量標記，2為hsp70-mlaa34融合基因，3為hsp70基因，4為mlaa34基因。

圖2為pires2-hsp70-mlaa34重組質粒經1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖；其中，1為分子量標記，2為pires2-hsp70-mlaa34重組質粒，3為雙酶切鑒定結果，4為pcr鑒定結果。

圖3為驗證基因凝膠電泳圖像；其中，1為分子量標記，2為pires2-egfp質粒轉染u937細胞，3為pires2-hsp70-mlaa34重組質粒轉染u937細胞，4為驗證基因轉染u937細胞。

圖4為目的蛋白在u937細胞內表達檢測圖。

圖5為目的蛋白在u937細胞內表達成像分析圖。

具體實施方式

下面結合附圖對本發明做進一步的詳細說明，以令本領域技術人員參照說明書文字能夠據以實施。

本發明中的“重組載體”是指已連接了基因的表達載體，可交互使用“重組質粒”、“重組載體”和“核酸疫苗”。

實驗材料和儀器

1、質粒和細胞

u937細胞購自中科院上海細胞庫；pires2-egfp質粒購自addgene公司。

2、動物

balb/c鼠[無特定病原體(spf)級，雌性，6～8周齡]購自北京維通利華實驗動物技術有限公司

3、試劑、酶與藥品

噻唑藍(mtt)試劑、限制性內切酶(ecorⅰ/bamhⅰ)購自美國neb公司；總rna提取試劑盒、無內毒素質粒提取試劑盒、逆轉錄pcr(rt-pcr)試劑盒、t4dna連接酶、膠回收純化和酶聯免疫吸附試驗(elisa)等試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清、rpmi1640(高糖)培養基購自美國hyclone公司；無水乙醇、氯仿等常規試劑均為國產分析純。

實施例

一、基因重組構建pires2-hsp70-mlaa34重組質粒：

1、引物設計：

根據質粒pires2-egfp多克隆位點情況選取ecorⅰ和bamhⅰ酶切位點進行基因克隆，mlaa-34基因(genbank：ay288977.2)擴增片段理論長度為1014bp，hsp70基因(genbank：nm_005345.5)擴增片段理論長度為1927bp，利用序列表中seqidno.3所示的引物和序列表中seqidno.5所示的引物設計重疊序列ggcggcggcggcggc，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2、重組質粒的構建

步驟一、u937細胞培養于含10％胎牛血清的rpmi1640培養基中，37℃、5％co2，收集u937細胞并調整細胞濃度至2×10⁵/ml，接種于96孔細胞培養板中，每孔加u937細胞100μl作為脾淋巴細胞殺傷活性實驗的靶細胞。

步驟二、hsp-70基因擴增以及基因提取

收集培養的u927細胞，trizol法抽提總rna，逆轉錄合成互補rna(crna)，使用下述引物進行pcr擴增得到序列表中seqidno.4所示的堿基序列的dna片段，即為hsp-70基因：

上游端引物：

5′-gcgaattcatgaaaaaaatgcctttgtttagt-3′(序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列)；

下游端引物：

5′-ggcggcggcggcggctcaaggggccgttttcttcaag-3′(序列表中seqidno.3所示的核苷酸序列)；

pcr反應條件：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s，共30個循環；最后72℃，5min；pcr擴增產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化pcr產物；

步驟三、mlaa-34基因擴增以及基因提取

收集培養的u927細胞，trizol法抽提總rna，逆轉錄合成互補rna(crna)，使用下述引物進行pcr擴增得到序列表中seqidno.7所示的堿基序列的dna片段，即為mlaa-34基因：

上游端引物：

5′-ggcggcggcggcggcatggccaaagccgcggcgatc-3′(序列表中seqidno.5所示的核苷酸序列)；

下游端引物：

5′-cgggatccctaatctacctcctcaatggtg-3′(序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列)；

pcr反應條件：94℃，5min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，60s，共30個循環；最后72℃，5min；pcr擴增產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化pcr產物。

步驟四、soe-pcr法擴增hsp70-mlaa34融合基因：

將回收純化的pcr產物，以mlaa-34基因和hsp-70基因為模板，利用下述引物進行soe-pcr擴增得到序列表中seqidno.1所示的堿基序列的dna片段，即為hsp70-mlaa34融合基因：

上游端引物：

5′-gcgaattcatgaaaaaaatgcctttgtttagt-3′(序列表中seqidno.2所示的核苷酸序列)；

下游端引物：

5′-cgggatccctaatctacctcctcaatggtg-3′(序列表中seqidno.6所示的核苷酸序列)；

soe-pcr反應條件：94℃，5min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，60s，共30個循環；最后72℃，5min；soe-pcr擴增產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳鑒定，用膠回收試劑盒回收純化soe-pcr產物，實驗結果如圖1所示；

步驟五、真核表達載體pires2-hsp70-mlaa34重組質粒的構建：

提取質粒pires2-egfp，與回收的hsp70-mlaa34融合基因片段分別進行ecorⅰ/bamhⅰ雙酶切，37℃，1.5h，酶切產物經瓊脂糖電泳回收純化，利用t4dna連接酶將hsp70-mlaa34融合基因亞克隆至pires2-egfp質粒中，16℃連接過夜，構建pires2-hsp70-mlaa34重組質粒；將連接產物轉化大腸桿菌(e.coli)dh5α感受態細胞，并在卡那霉素抗性lb培養基上涂板培養；將卡那霉素抗性lb培養基上生長的陽性轉化克隆子編號，用接種環挑取克隆子(不要完全挑完)于3ml的lb液體培養基中37℃過夜培養，次日提取pires2-hsp70-mlaa34質粒并進行pcr擴增和酶切鑒定，挑取陽性克隆菌，擴增后提取重組質粒進行pcr及ecorⅰ/bamhⅰ雙酶切鑒定，經1.0％瓊脂糖電泳鑒定，實驗結果如圖2所示。

二、細胞水平檢測

步驟一、細胞培養

取u937細胞培養于含10％胎牛血清的rpmi1640培養基中，37℃，5％co2培養，每2～3天換液1次，取對數生長期的細胞進行試驗。

步驟二、重組載體轉染u937細胞

(1)收集u937細胞并調整細胞濃度至2×10⁵/ml，接種于96孔細胞培養板中，每孔加u937細胞100μl作為脾淋巴細胞殺傷活性實驗的靶細胞；

(2)用50μl的opti-mem稀釋0.8μg重組載體，輕輕吹吸3～5次混勻；

(3)輕輕顛倒混勻轉染試劑，用50μl的opti-mem稀釋2.0μl的lipofectaminetm3000轉染試劑，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置5min；

(4)混合(2)和(3)，輕輕吹吸3～5次混勻，室溫下靜置20min；

(5)轉染復合物加入到24孔細胞板中，100μl/孔，前后輕搖細胞板混合均勻；

(6)將細胞板置于37℃，5％co2培養箱中培養18～48hrs，轉染4～6hrs后可換新鮮培養基。

步驟三、目的基因mrna在u937細胞內表達水平檢測

分別取轉染前和轉染兩天后的u937細胞1×10⁷，加入1ml的trizol試劑，0.2ml氯仿抽提，吸取上清液后用0.5ml異丙醇沉淀rna，再用75％乙醇洗滌沉淀，自然涼干后用depc水溶解并定量；根據逆轉錄試劑盒說明書將總mrna反轉錄為cdna，紫外分光光度計測定其濃度；設計引物為上游引物：5′-ccccatcatcagcggactg-3′(序列表中的seqidno.8所示)，下游引物：5′-cttctgttgggggttcttt-3′(序列表中的seqidno.9所示)，以cdna為模板進行pcr擴增得到驗證基因(序列表中的seqidno.10所示)以確定目的基因在u937細胞內表達，驗證基因為目的基因中的一部分，pcr反應體系包括2.5μl10×buffer，2.5μldntps，1.0μgcdna模板，0.1μltaq酶(5u/μl)，上下游引物各1μl，加ddh2o至25μl；

pcr反應條件為：94℃預變性4min；94℃，30s；62℃，30s,；72℃，30s；循環30次，再72℃延伸10min，pcr擴增產物以1％瓊脂糖電泳，genius凝膠電泳圖像分析系統分析鑒定，實驗結果如圖3所示。

步驟四、目的蛋白在u937細胞內表達水平及蛋白活性檢測(western-blot)

轉染48h后，收集細胞，加入裂解液150μlripa(1％pmsf)，吹打細胞，收集到離心管中，冰浴30min，12000r/min離心10min，提取總蛋白，取上清加入2xsds上樣緩沖液，煮沸5min，離心后取上清做sds-page電泳，電轉移至pvdf膜上，用mlaa-34單克隆抗體作為一抗，辣根過氧化物酶偶聯的羊抗小鼠igg作為二抗，ecl顯色后在生物分子成像儀內成像分析，結果如圖4、圖5所示。

三、整體水平進行檢測

步驟一、重組載體免疫balb/c小鼠

質粒dna大量制備和純化(按試劑盒說明書進行)并用生理鹽水調整至1.0g/l；balb/c鼠40只，隨機分為4組，每組10只；對照組a組、實驗組b、c、d組分別在小鼠兩側股四頭肌內肌內注射空質粒pires2、pires2-mlaa34、pires2-hsp70和pires2-mlaa34-hsp70，每只100μg；小鼠每次接種前24h，均用0.25％布比卡因100μl預處理；在0、2、4周進行3次同樣劑量免疫。

步驟二、脾淋巴細胞懸液的制備

末次免疫后第7天，處死小鼠，置70％乙醇浸泡3～5min，無菌取脾臟，置于不含胎牛血清的rpmi1640培養基中，剪去脂肪及筋膜組織，于200目不銹鋼網篩上研碎，重懸于含5％胎牛血清的hank′s液中，2000r/min離心5min，低滲裂解紅細胞，用含10％胎牛血清的rpmi1640培養基清洗3次，并調整濃度為1×10⁷/ml。

步驟三、脾淋巴細胞殺傷活性的檢測與結果

取步驟二中制備的脾淋巴細胞懸液，倍比稀釋；96孔細胞培養板各反應孔中加脾淋巴細胞100μl，使效靶比分別為50：1、25：1、12.5：1和6.25：1(各設3個復孔)，在37℃，5％co2中孵育24h，測定每組小鼠特異性淋巴細胞殺傷活性；反應結束后，每孔加入20μlmtt工作液，37℃反應4h，棄去mtt反應液，每孔加入二甲基亞楓(dmso)200μl，室溫振蕩10min，酶標儀測定570nm處吸光度值(a570)。脾淋巴細胞殺傷活性(％)＝[1-(反應孔a570-效應細胞對照孔a570)/靶細胞對照孔a570]×100％。

將核酸疫苗分組免疫小鼠后，檢測致敏脾淋巴細胞對u937細胞的殺傷效率，結果見表1；其中，核酸疫苗d組的殺傷效率明顯高于a、b、c組，差異有統計學意義(p＜0.01)；而a、b、c組殺傷效率比較，差異無統計學意義(p＞0.05)。

表1小鼠脾淋巴細胞殺傷活性(％)

*：p＜0.01，與d組比較。

步驟四、細胞因子水平的檢測與結果

將步驟二的脾淋巴細胞懸液加入96孔細胞培養板，每孔100μl(各設3個復孔)，37℃，5％co2培養72h，以純化的mlaa-34蛋白(20μg/ml)刺激抗原；以刀豆蛋白a(cona，10μg/ml)為陽性對照，未用抗原刺激孔為陰性對照，培養48h后收集上清，elisa法檢測細胞因子，包括白細胞介素(il)-2、il-4和干擾素-γ(ifn-γ)水平(嚴格按照試劑盒說明書操作)。

脾淋巴細胞懸液經純化的mlaa-34蛋白刺激后，elisa法檢測脾細胞上清液中細胞因子il-2、il-4和ifn-γ水平，結果見表2；其中，核酸疫苗d組的細胞因子il-2、il-4和ifn-γ水平明顯高于a、b、c組，差異有統計學意義(p＜0.01)。b組和c組上述各細胞因子水平明顯高于a組，差異有統計學意義(p＜0.01)。b組和c組間上述各細胞因子水平比較，差異無統計學意義(p＞0.05)。

表2小鼠脾淋巴懸液細胞因子含量(pg/ml)

*：p＜0.01，與a組比較；#：p＜0.01，與d組比較。

5、統計學處理

采用spss19.0統計軟件進行統計分析，計量資料±s以表示，組間比較采用方差分析，以p＜0.05為差異有統計學意義。

四、結果分析

核酸疫苗制作簡單、應用安全，是白血病免疫治療的策略之一。核酸疫苗導入宿主體內后可被抗原提呈細胞或機體組織細胞攝取，在細胞內表達蛋白抗原，刺激機體產生細胞免疫和體液免疫，免疫保護作用好。在構建核酸疫苗時作者使用了soe-pcr技術，將mlaa-34基因和hsp70基因融合在一起，形成mlaa34-hsp70融合基因。mlaa-34基因與急性單核細胞白血病的發生密切相關，其表達下調能顯著抑制u937細胞在體外的增殖，同時會誘發白血病細胞的凋亡，是理想的急性白血病免疫治療的靶基因。hsp70參與腫瘤基因調控及細胞增殖，具有抗原遞呈功能，能強烈刺激免疫系統針對腫瘤抗原的免疫反應，進而誘導機體產生特異性抗腫瘤免疫應答，以hsp為基礎的腫瘤疫苗是目前腫瘤疫苗研究中的熱點。

soe-pcr技術的關鍵主要在于引物的設計，在設計引物時，重疊序列可以是基因序列上的任意位點，不需要考慮融合位點及其附近特殊序列。通過特定的重疊互補序列的引物作為橋梁，從而使pcr擴增產物末端形成了相同的重疊鏈，通過重疊鏈的延伸將pcr擴增片段拼接起來，從而將兩個目的基因融合在一起，相比于限制性內切酶的酶切和連接酶的連接更加簡便快捷。因此，在融合基因、突變體分子的構建過程中，特別是在人類體細胞敲除、疫苗的研究、多克隆抗體的產生，以及在植物基因工程中具有廣泛的應用。本研究設計引物時采用柔性肽基因ggcggcggcggcggc作為重疊序列，融合蛋白mlaa-34和hsp70之間以柔性肽相連接，保證了兩個蛋白融合表達且正確折疊，mlaa-34和hsp70皆能發揮其獨特功能，從而保證了核酸疫苗的免疫活性。實驗表明，核酸疫苗pires2-mlaa34-hsp70免疫balb/c小鼠后，致敏脾淋巴細胞對白血病細胞具有較強的殺傷效率，明顯高于其他實驗組和對照組，說明核酸疫苗pires2-mlaa34-hsp70能有效地刺激機體產生針對u937細胞的特異性殺傷作用；此外，致敏小鼠脾細胞培養液中細胞因子il-2、il-4和ifn-γ水平明顯增高，說明該核酸疫苗能誘發強烈的體液免疫，增強了機體對腫瘤細胞的免疫應答，具有明顯的免疫保護作用。

盡管本發明的實施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用于各種適合本發明的領域，對于熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發明并不限于特定的細節和這里示出與描述的圖例。

sequencelisting

<110>吉林醫藥學院

<120>dna片段與含有該片段的重組載體、構建重組載體的方法及其應用

<130>1

<160>10

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>2994

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

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<210>2

<211>32

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成，以用作得到hsp-70基因的編碼序列的上游引物

<400>2

gcgaattcatgaaaaaaatgcctttgtttagt32

<210>3

<211>37

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>人工合成，以用作得到hsp-70基因的編碼序列的下游引物

<400>3

ggcggcggcggcggctcaaggggccgttttcttcaag37

<210>4

<211>1938

<212>dna

<213>人工合成

<220>

<223>hsp-70基因的編碼序列

<400>4