本發(fā)明屬于煙草制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)煙草薄片中果膠的兩步降解法。
背景技術(shù)：
造紙法煙草薄片（paper-processreconstitutedtobacco）是一種煙草資源再生利用的產(chǎn)品。它是利用一些煙草廢棄料、邊角料，如煙梗、煙葉碎片、煙末等為原料，經(jīng)過(guò)浸提、濃縮、分離、打漿、磨漿、抄造、烘干、加香工藝過(guò)程，制成煙葉薄片，用作卷煙填充物。造紙法煙草薄片，不僅在改善煙葉產(chǎn)品結(jié)構(gòu)強(qiáng)度、燃燒性能及降低卷煙的煙氣煙堿和焦油量等方面具有優(yōu)勢(shì)，同時(shí)還能降低煙葉單耗，節(jié)約生產(chǎn)成本，可以說(shuō)是煙草工業(yè)近年最重要的成果之一。而近年來(lái)，生物技術(shù)與造紙法煙草薄片技術(shù)在生產(chǎn)中的結(jié)合應(yīng)用，不僅發(fā)揮了造紙法煙草薄片的工藝優(yōu)勢(shì)，而且利用生物技術(shù)有選擇地改變煙草化學(xué)成分，明顯改善了煙草薄片的品質(zhì)。
研究表明，煙草原料中的纖維素、木質(zhì)素、果膠和蛋白質(zhì)在高溫下均會(huì)產(chǎn)生芳烴類(lèi)化合物。其中果膠是一種膠體性物質(zhì)，沉積在初生細(xì)胞壁和胞間層，并與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及一些蛋白質(zhì)相互交聯(lián)。果膠在熱解過(guò)程中主要生成甲醇等有害物質(zhì)。果膠的去除不僅能夠減少這類(lèi)物質(zhì)的生成，而且還能夠改變煙草細(xì)胞結(jié)構(gòu)，讓細(xì)胞變的更松散透氣，有利于提高煙草燃燒能力，減少熱解的發(fā)生。
現(xiàn)有技術(shù)中，針對(duì)煙草薄片中果膠類(lèi)物質(zhì)的降解主要是采用傳統(tǒng)的果膠酶進(jìn)行的。但是由于煙草薄片中果膠結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，而現(xiàn)有技術(shù)中的果膠酶普遍存在對(duì)于煙草薄片中果膠降解針對(duì)性不強(qiáng)、降解不夠充分、降解過(guò)程難以控制的缺陷，因而急需探討新的果膠酶及其在煙草薄片加工中的應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于提供一種利用特定菌株發(fā)酵制備的果膠酶，利用該果膠酶，通過(guò)采用“兩步法”可較好降解煙草薄片中果膠成分，從而改善煙草品質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下所述。
一種蜂蜜曲霉發(fā)酵制備的果膠酶，通過(guò)如下生產(chǎn)步驟制備獲得：
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中28~32℃活化培養(yǎng)2~3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號(hào)為40926的蜂蜜曲霉，該菌株為可公開(kāi)獲得菌株；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時(shí)具體可采用劃線法接種；
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，28~30℃、120~180r/min搖床培養(yǎng)36~48h左右（優(yōu)選30℃、160r/min搖床培養(yǎng)48h左右），制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基配方為：果膠3g/l，酵母粉15g/l，feso40.2g/l，mgso40.2g/l，kh2po42g/l，ph=6；制備種子液時(shí)，具體裝液量具體例如為：100/250ml錐形瓶；
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28~30℃、120~180r/min搖床培養(yǎng)3~16h（優(yōu)選30℃、160r/min搖床培養(yǎng)12h左右）以進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，接種量具體可按4%體積分?jǐn)?shù)比例進(jìn)行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠23.18~56.82g/l、酵母粉0.98~6.02g/l，ph=5；優(yōu)選配方為：果膠50g/l、酵母粉2.0g/l，ph=5；
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測(cè)定酶活后即可作為果膠酶進(jìn)行應(yīng)用。
所述蜂蜜曲霉發(fā)酵制備的果膠酶采用“兩步法”應(yīng)用在煙草薄片加工過(guò)程，具體而言，用于降解浸取液和漿料的中果膠成分。
具體使用時(shí)，以上述步驟（4）所制備粗酶液直接應(yīng)用為例，將果膠酶粗酶液稀釋0~50倍后，
二級(jí)浸取液以干重計(jì)，按二級(jí)浸取液（干重）：果膠酶粗酶液=1g：1~5ml的比例，將浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，40~50℃、酶解3~9h；
漿料以干重計(jì)，按漿料（干重）：果膠酶粗酶液=1g：1~5ml的比例，將漿料與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，40~50℃、酶解3~9h；
優(yōu)選處理?xiàng)l件為，將所述果膠酶粗酶液稀釋10倍，
二級(jí)浸取液以干重計(jì)，按二級(jí)浸取液（干重）：果膠酶粗酶液=1g：3ml的比例，50℃、酶解6h；
漿料以干重計(jì)，按漿料（干重）：果膠酶粗酶液=1g：3ml的比例，50℃、酶解6h。
一種針對(duì)煙草薄片中果膠的兩步降解法，具體包括如下步驟：
（1）制備粗酶液，按照上述步驟（1）至步驟（4）制備粗酶液，并稀釋0~50倍后備用；
（2）按現(xiàn)有工藝進(jìn)行煙草薄片的制備，對(duì)煙草薄片加工過(guò)程中的二級(jí)浸取液和漿料分別采用步驟（1）中所制備粗酶液進(jìn)行酶解處理；處理方式為：
二級(jí)浸取液以干重計(jì)，按二級(jí)浸取液（干重）：果膠酶粗酶液=1g：1~5ml的比例，將浸取液與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，40~50℃、酶解3~9h；
漿料以干重計(jì)，按漿料（干重）：果膠酶粗酶液=1g：1~5ml的比例，將漿料與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，40~50℃、酶解3~9h。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線是：將特定菌種首先進(jìn)行發(fā)酵，篩選優(yōu)化最佳發(fā)酵條件，獲得最高果膠酶酶活的粗酶液，然后將粗酶液采用“兩步法”用于煙草薄片工藝生產(chǎn)線上，以降低其浸取液和漿料中果膠含量，通過(guò)優(yōu)化處理工藝，獲得最佳降解效果，從而改善煙草品質(zhì)。
初步試驗(yàn)表明，本發(fā)明采用特定菌種發(fā)酵所得粗酶液的酶活最高可達(dá)2432.63u/ml，具有較好的應(yīng)用潛力。進(jìn)一步用于煙草薄片生產(chǎn)線后，可將煙草薄片中果膠含量由2.00%降低到1.52%，降解率達(dá)到24.00%。將處理后煙草薄片用于卷煙后，進(jìn)一步的感官抽吸評(píng)價(jià)表明，添加有酶解后煙草薄片的卷煙樣品相較于未處理的樣品，卷煙煙氣更加細(xì)膩，甜潤(rùn)感有所增強(qiáng)且刺激性減輕，香氣量增加，雜味減少，勁頭足，且燃燒性更好，從而較好的改善了煙草的吸食品質(zhì)。
需要解釋的是，本申請(qǐng)中所述“兩步法”主要是指分別對(duì)煙草薄片加工過(guò)程中的浸取液和漿料中果膠進(jìn)行降解處理?？傮w而言，與現(xiàn)有煙草薄片加工工藝配合較為緊密，且適應(yīng)性較好，因而具有一定地推廣應(yīng)用價(jià)值。
附圖說(shuō)明：
圖1為本申請(qǐng)所述采用造紙法的煙草薄片（再造煙葉）加工工藝流程示意圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說(shuō)明。在介紹具體實(shí)施例前，就下述實(shí)施例中果膠含量測(cè)定、果膠降解率的計(jì)算方法簡(jiǎn)要介紹如下。
果膠含量測(cè)定
下述實(shí)施例中對(duì)于煙草薄片中的果膠含量采用咔唑比色法測(cè)定，具體測(cè)定步驟如下：
1、樣品預(yù)處理，取待測(cè)樣品（酶解處理后或未處理煙草薄片），研碎，過(guò)250目篩，稱(chēng)取10g（精確到0.001g）樣品于250ml錐形瓶中，加入150ml加熱至沸騰的0.05mol/l的hcl溶液，裝上冷凝器，于90℃水浴中加熱回流1h，冷卻后把濾液移入250ml容量瓶中，加入2mol/l的naoh中和至ph=4，搖勻，收集濾液即得總果膠提取液，備用；
2、以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，咔唑比色法測(cè)定果膠含量，取步驟a中所得總果膠提取液1ml于含有6ml濃硫酸的試管中，搖勻；
85℃水浴加熱15min；冷卻，加入0.15%咔唑無(wú)水乙醇溶液0.3ml，搖勻，暗置30min；530nm下測(cè)吸光度；
3、根據(jù)咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線和公式，求得待測(cè)液果膠含量；
所述公式為：果膠（%）=c×v×k×100/(w×106)；
其中，c：對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的果膠提取稀釋液的果膠含量（μg/ml)，v：果膠提取液原液體積（ml），k：果膠提取液稀釋倍數(shù)，w：樣品質(zhì)量（g），106：質(zhì)量單位換算系數(shù)；
所述咔唑比色法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法為：
首先準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1000g半乳糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用ph為3的鹽酸定容；
然后分別取0、1、2、3、4、5、6、7ml于8個(gè)100容量瓶中，用ph為3的hcl定容，得到濃度為0、10、20、30、40、50、60、70μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
最后以上述方法測(cè)定，然后繪制咔唑比色法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
果膠降解率計(jì)算
下述實(shí)施例中果膠降解率按以下公式計(jì)算：
ei=[（c0－ci）/c0]×100%；
其中，ei：果膠的降解率，c0：空白對(duì)照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；ci：酶處理的煙草薄片中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；空白對(duì)照樣和酶處理的煙草薄片中果膠含量測(cè)定均按上述咔唑比色法進(jìn)行測(cè)定。
酶活力檢測(cè)方法
參照miller(1959)方法，取0.4ml的l%果膠溶液于試管中，加入1.0ml的ph=5的0.04mol/lna2hpo4-0.02mol/l檸檬酸緩沖液，45℃水浴平衡5min；
加入0.1ml適當(dāng)稀釋的酶液，45℃反應(yīng)30min（空白對(duì)照組以煮沸失活的酶液代替），加入3.0mldns溶液終止反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻，定容至15ml，于分光光度計(jì)540nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度，得到反應(yīng)體系中半乳糖醛酸的量；
酶活力單位：1ml酶液在45℃、ph5.0的條件下，每min分解底物產(chǎn)生lμg半乳糖醛酸的酶量定義為1單位聚半乳糖醛酸酶(pg)酶活。以u(píng)/ml表示；
酶活力計(jì)算公式：u=(c實(shí)驗(yàn)-c對(duì)照)*n*1000*(v總/v酶)/t；
n—酶液稀釋倍數(shù)，v總—反應(yīng)總體積，v酶—酶液體積，t—反應(yīng)時(shí)間（min）。
實(shí)施例1
本實(shí)施例所提供的利用蜂蜜曲霉發(fā)酵所制備的果膠酶，通過(guò)如下生產(chǎn)步驟制備獲得。
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中30℃活化培養(yǎng)3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號(hào)為40926的蜂蜜曲霉；本實(shí)施例中所用菌株從對(duì)應(yīng)保藏單位購(gòu)買(mǎi)獲得；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時(shí)具體采用劃線法接種；
所述pda培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，具體為：馬鈴薯提取液1.0l，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，ph自然；
所述馬鈴薯提取液制備方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1.0l煮沸30min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補(bǔ)足至1.0l，121℃滅菌即可。
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，30℃、160r/min搖床培養(yǎng)48h，制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基配方為：果膠3g/l，酵母粉15g/l，feso40.2g/l，mgso40.2g/l，kh2po42g/l，ph=6；制備種子液時(shí)，具體裝液量為：100/250ml錐形瓶。
從活化培養(yǎng)基中挑取菌株時(shí)，具體按如下方法進(jìn)行：
用打孔器在活化培養(yǎng)基平板上靠近菌株生長(zhǎng)邊緣的位置取兩塊0.5cm2的、長(zhǎng)滿(mǎn)新生菌絲的接種塊，再接種于種子培養(yǎng)基中；
還需解釋的是，在搖床發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后后，可加入滅菌的磁珠和適量的玻璃珠，使用磁力攪拌器攪拌2h以使將培養(yǎng)物打碎，便于作為種子液接種用于進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)擴(kuò)增使用。
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、160r/min搖床培養(yǎng)12h以進(jìn)一步發(fā)酵培養(yǎng)；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，接種量具體按4%體積分?jǐn)?shù)比例進(jìn)行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠50g/l、酵母粉2.0g/l，ph=5。
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測(cè)定酶活后即可作為果膠酶進(jìn)行應(yīng)用。
測(cè)定表明，本實(shí)施例所制備粗酶液酶活為2432.63u/ml。
實(shí)施例2
將實(shí)施例1所制備粗酶液采用“兩步法”分別作用于河南中煙煙草薄片工藝生產(chǎn)線上的二級(jí)浸取液和混合漿兩個(gè)位置（工藝位置如圖1所示），用于降解浸取液和漿料中的果膠成分。
具體使用方法為，將實(shí)施例1中所制備果膠酶粗酶液（酶活為2432.63u/ml，理論而言，實(shí)施例1中所制備任意酶活的粗酶液均可用于降解果膠應(yīng)用，但為確定較好降解條件及對(duì)煙草實(shí)際改善效果，因而僅以實(shí)施例1所制備的酶活為2432.63u/ml的粗酶液為例進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)缓髮⑾♂尯蟠置敢焊鶕?jù)不同物料配比（二級(jí)浸取液（干重g）和漿料質(zhì)量(g)分別與粗酶液體積(ml)之比）（所述干重為將浸取液在低溫狀態(tài)下烘至無(wú)明顯液體揮發(fā)即可）設(shè)計(jì)，40℃~50℃條件下，酶解3~9h；
酶解結(jié)束后，將粗酶液中的果膠酶進(jìn)行失活處理，待進(jìn)一步制成成品煙草薄片后進(jìn)而測(cè)定樣品中的果膠含量。
同樣操作條件下，加入失活酶液（將粗酶液煮沸失活）作為對(duì)照組，最終計(jì)算果膠降解率。
實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，為獲得最佳的降解率，發(fā)明人采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的方法，選用l9(34)正交表對(duì)果膠降解條件（粗酶液稀釋倍數(shù)（a）、物料配比（b）、酶解溫度（c）、酶解時(shí)間（d））進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)并進(jìn)行差異顯著性分析。
具體正交實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)如下：
具體果膠降解結(jié)果如下表所示：
由極差分析可知，各個(gè)因素對(duì)果膠降解率的影響由大到小依次為：稀釋倍數(shù)>反應(yīng)時(shí)間>反應(yīng)溫度>料液比。4種因素對(duì)果膠降解率的最優(yōu)組合是a2b2c3d3，即：粗酶液稀釋10倍、料液比1:3、反應(yīng)溫度50℃、處理時(shí)間6h，與試驗(yàn)最優(yōu)值結(jié)果相符。在此條件下煙草薄片中果膠降解率達(dá)到最大，為24.36%。
為進(jìn)一步檢測(cè)酶解處理后煙草薄片對(duì)于煙草吸食效果的改進(jìn)程度，以上述最佳酶解處理?xiàng)l件處理后制成的煙草薄片為例，發(fā)明人對(duì)其進(jìn)行了實(shí)際卷煙抽吸實(shí)驗(yàn)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過(guò)程簡(jiǎn)要介紹如下。
將最佳酶解條件處理后制成的煙草薄片，之后切絲，然后置于恒溫恒濕箱內(nèi)平衡（相對(duì)濕度(60±5)%，溫度(22±2)℃）48h；
按煙絲重量15%（即稱(chēng)取0.12g樣品）與平衡后85%的煙絲（云煙87c3f）均勻混合后按現(xiàn)有技術(shù)制備抽吸用卷煙，此即為試驗(yàn)組卷煙。
相同條件及相同方法下采用滅活酶處理的同一批次煙草薄片所制備的卷煙記為對(duì)照組，以蒸餾水處理的同一批次煙草薄片所制備的卷煙組記為空白組。
將各組卷煙樣品（每支煙只總重0.80±0.01g）在溫度(22±2)℃、相對(duì)濕度(60±5)%的恒溫恒濕箱中平衡24h后，依據(jù)國(guó)家現(xiàn)行成品煙評(píng)析標(biāo)準(zhǔn)gb5606.4-2005對(duì)卷煙進(jìn)行質(zhì)量評(píng)吸鑒定和評(píng)價(jià)。
具體評(píng)價(jià)結(jié)果如下表所示：
從上述評(píng)價(jià)結(jié)果可以看出，酶解處理后的煙草薄片添加于卷煙后，可使卷煙的香氣更加細(xì)膩，煙氣透發(fā)性更好，同時(shí)能夠增加甜潤(rùn)感且減輕刺激性，口感發(fā)澀程度減小，余味純凈舒適，勁頭足，且燃燒性更好，卷煙的吸食品質(zhì)得到了較好改善。