一種原代培養犬臍帶來源的間充質干細胞的方法與流程

本發明涉及生物工程技術領域，特別涉及一種原代培養犬臍帶來源的間充質干細胞的方法。

背景技術：

間充質干細胞(mesnchymalstemcells，mscs)是一類具有多向分化能力的成體干細胞，在特定條件下可定向分化為肌肉、軟骨、血管、內皮和神經等多種細胞，是目前最具有臨床應用前景的一類成體干細胞，已有多項研究證明其在心血管疾病、血液疾病、關節損傷等疾病的治療中具有顯著作用。而臍帶來源的間充質干細胞具有材料易得、免疫原性低的優點，并且在疾病治療中避免了倫理和道德上的爭議，具有廣闊的市場前景。犬作為日漸受人們歡迎的寵物，其疾病的治療技術發展迅速，然而對于如關節炎、神經損傷和腎臟損傷等疾病目前仍無有效治療藥物，間充質干細胞的治療為此提供了一個新的思路。

目前，對人類間充質干細胞的研究較為深入，但對犬臍帶間充質干細胞的研究卻鮮有報道。為深入研究犬臍帶間充質干細胞在重大疾病治療上的應用，高效的分離和培養方法顯得尤為重要。

技術實現要素：

為了克服常見方法分離間充質干細胞過程中的缺點和不足，本發明提供一種分離和培養犬臍帶間充質干細胞的方法，為其體外培養、建系和應用奠定基礎。

為了解決上述技術問題，本發明是通過以下技術方案實現的：

一種原代培養犬臍帶來源的間充質干細胞的方法，包括以下步驟：

1)新生犬臍帶的采集：

在幼犬剛從母體生出時用無菌器械剝離胎衣，剪取臍帶，立即將臍帶放入含10％雙抗溶液的pbs緩沖溶液中；

2)從臍帶中分離出富含間充質干細胞的膠質組織：

剪開臍帶被膜，暴露出中間的管狀結構，剔去動脈和靜脈，剩余不含血液的中空乳白色管即為所需的管狀組織；

3)清洗和剪碎組織塊：

將分離到的管狀組織依次分別置于含10％、5％、1％雙抗溶液的pbs緩沖溶液中浸泡5分鐘，然后轉移到容器中，用組織剪將其剪至1mm³大小；

4)膠原酶消化：

向含有組織塊的容器中加入約10倍體積的1％ⅰ型膠原酶，置于37℃培養箱中消化12h以上；

5)擴增培養：

將消化后的液體用臍帶間充質干細胞培養液稀釋后過200目篩網，1200rpm離心5分鐘，棄上清，加臍帶間充質干細胞培養液吹打均勻后轉移至培養皿中，以5％co2濃度、37℃環境于培養箱中培養。

進一步，還包括步驟：6)培養24h和72h后分別進行臍帶間充質干細胞培養液換液，并根據間充質干細胞生長狀況進行傳代。

其中，步驟5所述的臍帶間充質干細胞培養液由體積比為88％的人臍帶間質干細胞完全培養基、10％的胎牛血清、1％的雙抗溶液、1％的谷氨酰胺溶液組成。

本發明的有益效果是：

(1)本發明中間充質干細胞來源于新生犬臍帶，來源廣泛，材料易得，使后期該細胞的大量生產和臨床應用成為可能；

(2)本發明操作簡單、重復性好，從中可獲得較少的雜細胞和無污染的純凈間充質干細胞；

(3)本發明使用的膠原酶消化方法溫和，對細胞的損害較少，能獲得大量的具有較強增殖能力的間充質干細胞，可用于后續該細胞的建系、干細胞特性與治療疾病等。

附圖說明

圖1是實施例4所得的生長曲線圖；

圖2是實施例5所得的鑒定結果圖；

圖3是實施例6所得的分化結果圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式結合附圖對本發明作進一步詳細說明。但本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。

實施例1：(膠原酶法)

1)新生犬臍帶的采集：

在幼犬剛從母體生出時用無菌器械剝離胎衣，剪取臍帶，立即將臍帶放入含10％雙抗溶液的pbs緩沖溶液中；

2)從臍帶中分離出富含間充質干細胞的膠質組織：

剪開臍帶被膜，暴露出中間的管狀結構，剔去動脈和靜脈，剩余不含血液的中空乳白色管即為所需的管狀組織；

3)清洗和剪碎組織塊：

(3-1).將分離到的管狀組織置于含10％雙抗的pbs緩沖溶液中浸泡5分鐘，用鑷子取出；

(3-2).將步驟(3-1)中取出的管狀組織置于含5％雙抗的pbs緩沖溶液中浸泡5分鐘，用鑷子取出；

(3-3).將步驟(3-2)中取出的管狀組織置于含1％雙抗的pbs緩沖溶液中浸泡5分鐘，用鑷子取出；

(3-4).將步驟(3-2)中取出的管狀組織轉移到無菌100ml小燒杯中，用組織剪剪至1mm³大小；

4)膠原酶消化：

加入約10倍體積的1％ⅰ型膠原酶，置于37℃培養箱中消化12h以上，至基本沒有肉眼可見組織塊；

5)擴增培養：

用臍帶間充質干細胞培養液稀釋后過200目篩網，1200rpm離心5分鐘，棄上清，加臍帶間充質干細胞培養液吹打均勻后轉移至培養皿中，以5％co2濃度、37℃環境于培養箱中培養。

本實施例中所使用的試劑包括：

pbs緩沖溶液的配制配方為：

人臍帶間質干細胞完全培養基購于cyagen公司，商品號為：huxuc-03011-440，根據使用說明將其配成臍帶間充質干細胞培養液，配方為：

雙抗溶液、血清均購于hyclone公司

ⅰ型膠原酶購于sigma公司。

實施例2：(胰蛋白酶法)

本實施作為對照例之一，其培養方法與實施例1的區別在于：

步驟4)加入約5倍體積的0.25％胰蛋白酶，37℃水浴鍋中消化30min，不時搖晃，使消化液與組織塊充分反應。

所述胰蛋白酶購于hyclone公司。

實施例3：(組織塊法)

本實施作為對照例之一，其培養方法與實施例1的區別在于，步驟4)和5)：

4-1)將剪細的臍帶組織塊切面朝下均勻鋪于t25培養瓶底，然后底面朝上置于5％co2、37℃培養箱中培養30min；

4-2)取出培養瓶，加入1ml臍帶間充質干細胞培養液(剛好沒過瓶底，避免讓組織塊懸浮)，底面朝下置于5％co2、37℃培養箱中培養2h；

4-3)取出培養瓶，再加入2ml臍帶間充質干細胞培養液，完全浸沒組織塊，底面朝下置于5％co2、37℃培養箱中培養。

實施例4：繪制細胞生長曲線

(1)從實施例1～3中分別取生長良好的第三代犬間充質干細胞，用0.25％胰蛋白酶消化后制成細胞懸液；

(2)將細胞稀釋至3×10⁴/ml接種至24孔板中，每孔0.5ml，置于含5％co2，37℃培養箱中培養；

(3)每天同一時間隨機抽取3孔細胞，用胰蛋白酶消化制成懸液后計數，每孔計三次取平均值；

(4)連續計數八天，根據計數結果，以細胞密度為縱坐標(個/ml)，時間為橫坐標，繪制得到如圖1所示的生長曲線圖。

實施例5：免疫熒光鑒定：

(1)從實施例1～3中分別選取生長良好的第三代間充質干細胞，接種在明膠包被過的培養板上，使細胞貼壁12h，棄去培養基，用含5％fbs的pbs洗滌2次；

(2)加入4％多聚甲醛室溫固定30分鐘，去掉固定液，用含5％fbs的pbs洗滌3次，每次5分鐘；

(3)加入透化劑(0.2％triton×100)，冰上孵育20分鐘，棄去后用含5％fbs的pbs洗滌3次，每次5分鐘；

(4)加入封閉液(含10％fbs的pbs)，37℃封閉1h，去掉封閉液，用含5％fbs的pbs洗滌3次，每次5分鐘；

(5)分別加入cd44、cd34、cd90三種表面標記蛋白的一抗，4℃避光孵育過夜，棄去液體后用含5％fbs的pbs洗滌3次，每次5分鐘；

(6)分別加入fitc標記的相對應的二抗，4℃避光孵育30分鐘，棄去液體，用含5％fbs的pbs洗滌3次，每次5分鐘；

(7)加入1μg/mldapi避光復染5分鐘，棄去液體，用含5％fbs的pbs洗滌3次，每次5分鐘；

(8)加入抗熒光淬滅劑，在倒置熒光顯微鏡下觀察染色結果并拍照得到如圖2所示的鑒定結果圖。

實施例6：選取生長狀態良好的細胞進行成脂和成骨誘導分化

本實施例所需的試劑包括：

犬臍帶間充質干細胞成骨誘導分化培養基配方：

犬間充質干細胞成脂誘導分化培養基配方：

(一)誘導成脂分化步驟：

(1)取按照實施例1方法制備的犬臍帶間充質干細胞，待其培養至80％融合時，用胰蛋白酶消化后制成細胞懸液；

(2)將細胞密度調整至2×104/cm²，加到六孔板中，每孔加2ml細胞懸液；

(3)置于37℃、5％co2條件下培養細胞，每3天換一次液；

(4)細胞達到100％匯合時，棄去孔內的培養基，用pbs沖洗2次，每孔加入2mla液；

(5)培養三天后，棄去原培養液，用pbs沖洗2次，每孔加入2mlb液

(6)培養24小時后，棄去原培養液，用pbs沖洗2次，每孔加入2mla液

(7)重復步驟(5)和(6)3-5次，最后將細胞養在b液中7天，每3天換一次液；

(8)油紅o染色分析：棄去孔中培養液，用pbs清洗2次，加入2ml4％甲醛溶液固定細胞30分鐘；然后棄去液體，pbs清洗2次，用1ml油紅o工作液染色30分鐘后用pbs清洗2次，顯微鏡下觀察并拍照。

(二)誘導成骨分化步驟：

(1)犬uc-msc培養至80％融合時，用胰蛋白酶消化后制成細胞懸液；

(2)將細胞密度調整至3×104/cm2，加到六孔板中，每孔加2ml細胞懸液；

(3)置于37℃、5％co2條件下培養24h后棄去原培養液，用pbs清洗2次后加入2ml成骨分化培養液；

(4)以后每3天換一次液，直至2-3周后進行茜素紅染色分析；

(5)茜素紅染色分析：棄去原有培養液，用pbs清洗2次后每孔加入2ml4％甲醛溶液固定30分鐘；然后棄去液體用pbs洗2次，加入1ml茜素紅工作液反應五分鐘后用pbs清洗2次，在光學顯微鏡下觀察并拍照，得到如圖3所示的分化結果圖。