一種檢測鴨源性成分的RPA引物、試劑盒及檢測方法與流程

本發明屬于畜產品安全生物技術領域，具體涉及一種檢測鴨源性成分的rpa引物、試劑盒及檢測方法。

背景技術：

民以食為天，食以安為先，食品是人類社會賴以生存的第一物質基礎。隨著人民生活水平的提高，動物源性食品的消費量在逐年增加。食源性疾病和肉食品的潛在危險性不論在發達國家還是發展中國家都沒有得到有效控制，畜禽類肉食品的質量與安全問題已經成為一個全球性的問題。

從核酸分子水平上對動物進行物種鑒定、物種起源和多樣性評估以及對動物源性食品進行檢驗研究，是目前動物源性成分研究的最有效手段。目前已頒布的標準只有3項地方標準是關于鴨源性成分的檢測，主要采用的是常規定性pcr法和實時熒光pcr法對鴨動物源性的定性檢測。

其中，基于常規pcr-凝膠電泳法的鴨動物成分定性分析標準有地方標準dbs22/018-2013(畜肉中鴨源性成分)和db22/t2049-2014(鴨源性成分)，基于實時熒光pcr法的動物成分定性分析標準有地方標準db64/t965-2014(雞、鴨源性成分)，但是，目前常規pcr和熒光pcr檢測方法存在操作繁瑣、成本高、單一性等問題。

在畜產品動物源性成分檢測中，迫切需要建立快速簡便的核酸檢測方法，用于市場監管和例行監測。與常規pcr和熒光實時pcr定性檢測方法相比，利用聚合酶重組酶擴增(recombinasepolymeraseamplification，rpa)對動物源性肉及肉制品進行定性高通量檢測，其模仿體內復制機理，反應不需要反復升降溫的解鏈與退火過程，整個反應簡單快速，能夠在15分鐘內進行常溫下的快速目標靶基因的核酸檢測。

rpa方法的關鍵在于擴增引物的設計。pcr引物多半是不適用的，這是因為，rpa引物比一般pcr引物長，通常需要達到30-38個堿基，引物過短會降低重組率，影響擴增速度和檢測靈敏度。因此，rpa的引物設計難度較大。

目前，已報到的鴨源性成分檢測方法中，主要是利用pcr儀在實驗室中進行常規的檢測，這些方法還不能進一步滿足畜產品的快速檢測。國內外目前還沒有利用rpa技術對鴨源性成分的物種特異性的鑒定。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種檢測鴨源性成分的rpa引物、試劑盒及檢測方法，能準確、快速、簡便檢測被檢制品中是否含有鴨源性成分，與現行標準中常規pcr和熒光定量pcr方法比較，具有高度專一性，靈敏度高、擴增速度快、所需時間短、直觀性強的特點，實現常溫下對動物源性肉及肉制品進行快速簡便檢測，滿足政府對市場監管和例行監測。

為了達到上述目的，本發明提供如下技術方案：

用于檢測鴨源性成分的rpa引物，包括正向引物rpa-duck-f和反向引物rpa-duck-r，具體序列如下：

rpa-duck-f：5'-tgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc-3'；

rpa-duck-r：5'-tctatcgcgtattaaatgtataattgcgggac-3'。

一種用于檢測鴨源性成分的rpa檢測試劑盒，其包括所述的rpa引物。

進一步，所述rpa檢測試劑盒，其包含rpa反應體系，該rpa反應體系中各成分的終濃度為：rpa引物的正、反向引物各為0.4-1μmol/l，且，正、反引物的比例為0.5-2：1，dna模板0.4-1.2ng/μl，ph為6.9-7.1的磷酸緩沖液0.10-0.25m，磷酸鎂15-25mmol/l。

一種檢測鴨源性成分的rpa方法，包括：

1)提取待測樣品的dna作為模板；

2)將所述的rpa引物對加入到rpa擴增反應體系中，進行rpa擴增反應；

3)然后通過瓊脂糖凝膠電泳，若得到片段大小為220bp的條帶，則證明所檢樣品中含有鴨源性成分。

進一步，進行rpa擴增反應時，所述rpa反應體系中各成分的終濃度為：rpa引物的正、反向引物各為0.4-1μmol/l，且，正、反引物的比例為0.5-2：1，dna模板0.4-1.2ng/μl，ph為7.05的磷酸緩沖液0.12m，磷酸鎂15-25mmol/l。

優選地，所述rpa反應體系總體積為50μl，其中，濃度為10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2-5μl，濃度為20ng/μl的dna模板加入1-3μl，濃度為0.2m、ph7.05的磷酸緩沖液29.5μl，濃度為250mmol/l磷酸鎂溶液3-5μl，ddh2o補足至50μl。

優選地，所述rpa反應體系中，總體積為50μl，其中，濃度為10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的dna模板加入2μl，濃度為0.2m、ph為7.05的磷酸緩沖液29.5μl，濃度為250mmol/l的磷酸鎂溶液4μl，ddh2o補足至50μl。

進一步，所述rpa擴增反應程序為：恒溫35-40℃，15～25分鐘。

優選地，所述步驟2)中，rpa擴增反應程序為：37℃恒溫反應18分鐘。

通過查閱文獻和用blast軟件分析，以鴨總dna作為模板進行篩選，篩選出鴨線粒體上的基因核酸序列(mtdna)，相比于核dna的線性結構，mtdna的環形結構具有不隨著時間降解的穩定性，這使得線粒體能在極端的食品加工條件中保存下來。此外，每個細胞的細胞核中只有一份ndna存在，而某一細胞線粒體dna存在多個復制體，這使mtdna試驗比ndna檢測更敏感。從另一個角度來看，mtdna長度短，并且不同生物間的mtdna差異很大，高等動物的線粒體dna的典型尺寸約16000個堿基對(bp)。同時，不同于ndna，線粒體dna屬于完全的母系遺傳，沒有組蛋白的結合保護，又缺少dna損傷的修復系統，所以極易發生突變，且突變結果容易保存下來，因此，mtdna的突變率為核dna的10倍以上。本發明利用mtdna良好的特異性，將其作為物種檢測中的目標序列來源。

本發明根據鴨物種的線粒體特異性序列區域(accession:kj833587.1，gi:675023238)設計大量的rpa特異性引物，引物中個別堿基的增減都會對特異性擴增的效果產生影響，從中篩選出一套可快速有效地檢測出鴨源性成分的rpa引物，本發明篩選出的基于鴨線粒體上細胞色素c氧化酶iii基因片段上的rpa引物，擴增時間短，電泳條帶明顯，靈敏度高。

本發明的rpa引物具有如下特點：(1)rpa引物的長度符合30至35個核苷酸的要求；(2)rpa引物5'端的3-5個核苷酸避免聚鳥嘌呤，gc含量在40％～60％之間，堿基隨機分布，并避免重復序列；(3)盡量避免引物內部出現引物間互作、二級結構、發夾結構，減少引物二聚體的形成；(4)鴨源性成分特異性片段為220bp。

基于本發明的rpa引物建立鴨源性成分物種特應性的rpa檢測方法,不需要特殊的儀器，無需像常規pcr或熒光pcr方法那樣循環變溫，適適用范圍廣，檢測時間短，約需15～25分鐘，就能快速檢測被檢制品中是否含有鴨源性成分，檢測結果準確可靠，靈敏度高，大大縮短了實驗進程，簡化了實驗步驟，在肉類產品動物源性成分鑒定中的準確性及快速檢測方面得到了顯著的提高。

與現有技術對比，本發明具有如下有益效果：

1)利用本發明的rpa引物對進行快速檢測，以鴨物種基因組dna為模板時，可以得到明顯的特異性片段為220bp的電泳條帶，而其他物種(羊、牛、雞和豬等)的基因組dna為模板沒有得到電泳條帶，證明其具有高度專一性。

2)利用本發明的rpa引物及檢測方法，將鴨物種基因組dna模板用ddh2o稀釋后，可以檢測到50個拷貝的靶基因，證明該方法具有較高的靈敏度，這是現有技術不能達到的靈敏水平。

3)利用本發明的rpa檢測方法，使被檢制品中鴨源性成分鑒定過程中，提高了準確性，簡化了檢測步驟，所需檢測時間短，使用更加便捷。

附圖說明

圖1為本發明實施例中鴨動物源性成分特異性檢測電泳圖譜；其中，m：dl2000marker；1-3：ntc；4-6：鴨；7-9：牛；10-12：羊；12-15：雞；16-18：豬。

圖2為本發明實施例中鴨動物源性成分檢測的靈敏度擴增電泳圖譜；其中，m：dl2000marker；dna采用鴨基因組dna不同梯度稀釋為：1-3：5000copies；4-6：500copies；7-9：50copies。

具體實施方式

以下結合具體實施例對本發明作進一步說明。

實施例1獲得用于檢測鴨源性成分的rpa引物

通過查閱文獻和用blast軟件分析，以50ng/μl的鴨總dna作為模板進行優化篩選，篩選出鴨線粒體上的基因核酸序列，并進行引物的設計和篩選。

在rpa引物設計時考慮到以下幾個要點：(1)rpa引物的長度一般為30至35個核苷酸；(2)rpa引物5'端的3-5個核苷酸應當避免聚鳥嘌呤，gc含量在40％～60％之間，堿基隨機分布，并避免重復序列；(3)rpa引物設計時盡量避免引物內部出現引物間互作、二級結構、發夾結構，減少引物二聚體的形成。

篩選出的rpa引物具體序列如下：

rpa-duck-f：5'-tgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatc-3'；

rpa-duck-r：5'-tctatcgcgtattaaatgtataattgcgggac-3'。

實施例2一種檢測鴨源性成分的物種特應性的rpa檢測方法驗證

以常見的豬、牛、羊、雞和鴨等作為對象，進行了擴增反應，并利用試紙條進行了檢測，以電泳法為對比進行驗證。

1)分別提取待測樣品dna(豬、牛、羊、雞和鴨)；

rpa擴增

將實施例1中的rpa引物利用twistdx公司開發的rpa試劑盒進行聚合酶重組酶等溫擴增。

擴增反應體系：總體積為50μl，濃度為10μmol/l的rpa引物的正、反向引物各加入2.4μl，濃度為20ng/μl的dna模板加入2.0μl，煮沸再冷卻的純水配制磷酸緩沖液(0.2m，ph7.05)29.5μl，250mmol/l磷酸鎂溶液4μl，ddh2o補足至50μl。

擴增反應程序為：放入pcr儀器或恒溫擴增儀37℃反應18分鐘。

3)產物檢測

將步驟2)的等溫擴增產物進行電泳分析，利用本發明rpa引物，對豬、牛、羊、雞和鴨進行rpa檢測，通過瓊脂糖凝膠電泳，如果得到明顯的特異性條帶，片段長度為220bp，則證明所檢樣品中含有鴨源性成分。

檢測鴨動物源性成分的特異性擴增電泳圖譜如圖1所示，由圖1可以看出，本發明的rpa引物能夠快速準確地鑒定出鴨動物源性成分，其中在含有鴨動物源性成分的樣品中有明顯的擴增條帶，而牛、羊、雞和豬等其他物種的樣品均沒有擴增條帶。

利用本發明rpa引物進行鴨動物源性成分的靈敏度擴增驗證，將樣品用ddh2o分別稀釋至50、500、5000個拷貝，進行靈敏度擴增，擴增電泳圖譜如圖2所示，由圖2可以看出，利用該方法可以檢測到50個拷貝的鴨動物源性成分特異性分子序列，說明用本發明設計的引物鑒定鴨動物源性成分具有較高的靈敏度和準確性，且操作簡單。