本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是涉及一種從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶的方法。技術(shù)背景透明質(zhì)酸酶(hyaluronidase，haase)是一種粘多糖內(nèi)切酶，能夠降低體內(nèi)透明質(zhì)酸活性，提高組織中液體滲透能力的酶，在控制癌細(xì)胞侵襲、抑制血管再生、促進創(chuàng)傷修復(fù)等過程中發(fā)揮重要作用。透明質(zhì)酸酶在哺乳動物，無脊椎動物(甲殼類、昆蟲類、蛭類)，致病菌(念珠菌屬candida、鏈霉菌屬streptomyce)，細(xì)菌和噬菌體中廣泛存在，來自于不同生物組織中的大量透明質(zhì)酸酶已被確認(rèn)。haase在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其主要功能為：降低水解透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，ha)相對分子質(zhì)量的同時消ha的黏滯性，增強機體對外來物質(zhì)的通透性。在醫(yī)學(xué)上，haase能夠促進藥物在機體內(nèi)的擴散，因此，重要的藥用價值使得haase在醫(yī)藥領(lǐng)域具有良好的市場前景。不同來源的透明質(zhì)酸酶作用效果不盡相同，目前，已有文獻(xiàn)報道從蜂毒、蝎毒、羊睪丸、牛睪丸、牛肝臟中提取了透明質(zhì)酸酶，然而從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶的文章報道較少。脾臟作為一類家畜副產(chǎn)物，資源豐富，因此，如何實現(xiàn)牛脾臟的高值化利用成為牛副產(chǎn)物加工利用中急需解決的問題。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處而提供一種從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶的方法，該方法將牛脾臟先經(jīng)過一定濃度的生理鹽水浸泡后加入提取液提取搗碎提取，然后離心取上清液加入氯化鈉除雜，再加入鹽鹽析，最后經(jīng)過透析制得精制透明質(zhì)酸酶，本發(fā)明方法用于從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶，簡化了步驟，易操作，透明質(zhì)酸酶提取率高，純度好，酶活力高。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶的方法，所訴方法包括以下步驟：(1)取新鮮牛脾臟，去除表皮包膜后，切成小塊，加入2.0％生理鹽水浸泡25-35min，然后加入提取液，用組織搗碎機搗碎，放入-8℃恒溫箱中，用機械攪拌器攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速500-600r/min，40-60min后，-3℃-0℃靜置1h，取上清液，加入氯化鈉，0℃攪拌30-50min后靜置1-2h，6000r/min離心15min，取上清液，加入鹽，0℃攪拌50-60min，然后靜置8-10h，9000r/min離心10min，取沉淀得透明質(zhì)酸酶粗品；(2)取步驟(1)中的沉淀，裝入透析袋中，放入檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液中，5-7℃透析12-14h，8000r/min離心20min，取上清液，冷凍干燥，得透明質(zhì)酸酶精品。優(yōu)選地，所述方法包括以下步驟：(1)取新鮮牛脾臟，去除表皮包膜后，切成小塊，加入2.0％生理鹽水浸泡30min，然后加入提取液，用組織搗碎機搗碎，放入-8℃恒溫箱中，用機械攪拌器攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速550r/min，50min后，-2℃靜置1h，取上清液，加入氯化鈉，0℃攪拌45min后靜置1.5h，6000r/min離心15min，取上清液，加入鹽，0℃攪拌55min，然后靜置9h，9000r/min離心10min，取沉淀得透明質(zhì)酸酶粗品；(2)取步驟(1)中的沉淀，裝入透析袋中，放入檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液中，6℃透析13h，8000r/min離心20min，取上清液，冷凍干燥，得透明質(zhì)酸酶精品。進一步的，所述的提取液由2-4重量份20％甘油、1-3重量份葡萄糖、130-150重量份檸檬酸、50-70重量份檸檬酸鈉混合制成。進一步的，所述的提取液由3重量份20％甘油、2重量份葡萄糖、140重量份檸檬酸、60重量份檸檬酸鈉混合制成。進一步的，所述的鹽為氯化銨。進一步的，所述的牛脾臟和2.0％生理鹽水、提取液的質(zhì)量比為：1∶1∶2-3。進一步的，所述的牛脾臟和氯化鈉、鹽的質(zhì)量比為：1∶0.3-0.4∶0.8-1.2。進一步的，所述牛脾臟和檸檬酸-氫氧化鈉緩沖液的質(zhì)量比為：1∶0.5。由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有如下有益效果：本發(fā)明將牛脾臟先經(jīng)過一定濃度的生理鹽水浸泡后加入提取液提取搗碎提取，然后離心取上清液加入氯化鈉除雜，再加入鹽鹽析，最后經(jīng)過透析制得精制透明質(zhì)酸酶，具有如下特點：(1)本發(fā)明采用先將牛脾臟用2.0％生理鹽水浸泡，再加入提取液搗碎提取，保存了牛脾臟中透明質(zhì)酸酶的活力，且更利于牛脾臟細(xì)胞的破碎和透明質(zhì)酸酶的提出。此外，本發(fā)明采用將一定配比的甘油、葡萄糖、檸檬酸、檸檬酸鈉混合制得提取液，透明質(zhì)酸酶甘油和葡萄糖作為酶保護劑和穩(wěn)定劑，更好的保證了提取過程中的酶活力，同時和檸檬酸、檸檬酸鈉混合，增加了透明質(zhì)酸酶的提取率。(2)本發(fā)明采用低濃度的氯化鈉去除透明質(zhì)酸酶粗提取液中的雜質(zhì)，然后再用氯化銨鹽析，最后用檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液中透析，采用此操作過程可得到高純度透明質(zhì)酸酶，酶活力進一步提升，此純化步驟簡便，經(jīng)濟性強，更適合大規(guī)模生產(chǎn)。本發(fā)明為了更好的闡述發(fā)明創(chuàng)造的有益效果，還列舉了部分試驗例，旨在說明本發(fā)明的技術(shù)效果，絕不限定本發(fā)明的范圍。工藝參數(shù)研究試驗例1：從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶工藝參數(shù)研究實驗方法：采用3,5-二硝基水楊酸比色定糖法測定透明質(zhì)酸酶的活力。酶解條件為:50℃，時間15min，ph4，于波長540nm測定。以每分鐘引起透明質(zhì)酸酶溶液吸光度上升0.02％的酶量為一個酶活力單位。1.1攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌時間、鹽析時間、透析時間對提取透明質(zhì)酸酶的影響在其他因素不變條件下，考察不同攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌時間、鹽析時間、透析時間對提取透明質(zhì)酸酶的影響，結(jié)果見表1-表4：表1不同攪拌轉(zhuǎn)速對提取透明質(zhì)酸酶的影響攪拌轉(zhuǎn)速(r/min)450500550600650酶活力(u/ml)311.2318.7323.5322.6321.0表2不同攪拌時間對提取透明質(zhì)酸酶的影響攪拌時間(min)3040506070酶活力(u/ml)316.4323.2327.8328.2328.4表3不同鹽析時間對提取透明質(zhì)酸酶的影響鹽析時間(h)7891011酶活力(u/ml)315.4322.5328.9328.2327.3表4不同透析時間對提取透明質(zhì)酸酶的影響透析時間(h)1112131415酶活力(u/ml)315.9321.7326.3325.8325.4從上表中可知，攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌時間、鹽析時間、透析時間增加，透明質(zhì)酸酶活力增加，但是當(dāng)溫度攪拌轉(zhuǎn)速增加到650r/min，攪拌時間到70min，鹽析時間11h，透析時間15h時，透明質(zhì)酸酶活力略有降低，表明此時再提高攪拌轉(zhuǎn)速、攪拌時間、鹽析時間、透析時間對提取透明質(zhì)酸酶已沒有效果，因此，本發(fā)明提取透明質(zhì)酸酶最佳攪拌轉(zhuǎn)速為550r/min，攪拌時間為50min，鹽析時間為9h，透析時間為13h。1.2本發(fā)明提取液對提取透明質(zhì)酸酶的影響1.2.1不同配比提取液對提取透明質(zhì)酸酶的影響配置不同配比的提取液，考察不同配比提取液對提取透明質(zhì)酸酶的影響。試驗組1：1g20％甘油、0.8g葡萄糖、120g檸檬酸、40g檬酸鈉混合制成的提取液；試驗組2：2g20％甘油、1g葡萄糖、130g檸檬酸、50g檸檬酸鈉混合制成的提取液；試驗組3：3g20％甘油、2g葡萄糖、140g檸檬酸、60g檸檬酸鈉混合制成的提取液；試驗組4：4g20％甘油、3g葡萄糖、150g檸檬酸、70g檸檬酸鈉混合制成的提取液；試驗組5：5g20％甘油、4g葡萄糖、160g檸檬酸、80g檸檬酸鈉混合制成的提取液；試驗組6：160檸檬酸、80g檸檬酸鈉混合制成的提取液；試驗組7：6g氯化鈉、160檸檬酸、80g檸檬酸鈉混合制成的提取液；在其他因素不變條件下，考察不同配比提取液對提取透明質(zhì)酸酶的影響，結(jié)果見表5：表5不同配比提取液對提取透明質(zhì)酸酶的影響從上表中可看出，試驗組2-4提取的透明質(zhì)酸酶活力最高，試驗組1和試驗組5為低、高配比，提取效果不佳，因此，按照2-4重量份20％甘油、1-3重量份葡萄糖、130-150重量份檸檬酸、50-70重量份檸檬酸鈉配比的提取液對透明質(zhì)酸酶的提取效果最好；此外，不添加甘油和葡萄糖到提取液中或是用氯化鈉代替甘油和葡萄糖，提取透明質(zhì)酸酶的酶活力均低于試驗組1-5，因此，甘油和葡萄糖加入到提取液中，可以增加透明質(zhì)酸酶的酶活力，更適于提取透明質(zhì)酸酶。1.2.2不同提取液添加量對提取透明質(zhì)酸酶的影響在其他因素不變條件下，考察不同提取液添加量對提取透明質(zhì)酸酶的影響，結(jié)果見表6：表6不同提取液添加量對提取透明質(zhì)酸酶的影響牛脾臟∶提取液1∶1.51∶21∶2.51∶31∶3.5酶活力(u/ml)319.8322.7325.4325.6324.9從上表中可以看出，提取液添加量為1∶2-3時，提取的透明質(zhì)酸酶活力最高，因此，此提取液最佳添加量。1.3本發(fā)明物料添加量對提取透明質(zhì)酸酶的影響在其他因素不變條件下，考察2.0％生理鹽水、氯化銨、氯化鈉的添加量對提取透明質(zhì)酸酶的影響，結(jié)果見表7-9：表7不同2.0％生理鹽水添加量對提取透明質(zhì)酸酶的影響牛脾臟∶2.0％生理鹽水1∶0.81∶11∶1.2不添加生理鹽水酶活力(u/ml)325.3326.6326.6322.4表8不同氯化銨添加量對提取透明質(zhì)酸酶的影響牛脾臟∶氯化銨1∶0.61∶0.81∶11∶1.21∶1.4酶活力(u/ml)323.4325.7327.2326.1325.2表9不同氯化鈉添加量對提取透明質(zhì)酸酶的影響牛脾臟∶氯化銨1∶0.251∶0.31∶0.351∶0.41∶0.45酶活力(u/ml)322.7324.2325.8324.6323.4從上表中可以看出，2.0％生理鹽水添加量為1∶1時最優(yōu)，不添加生理鹽水，則酶活力降低，氯化銨添加量為1∶0.8-1.2時，透明質(zhì)酸酶活力比較高，為最優(yōu)質(zhì)量比，氯化鈉添加量為1∶0.3-0.4時，去除雜質(zhì)的有效率最高，透明質(zhì)酸酶的酶活力較高，為最優(yōu)質(zhì)量比。具體實施方式提取液的制備：300g20％甘油、200g葡萄糖、14.0kg檸檬酸、6.0kg檸檬酸鈉混合制成實施例1：從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶(1)取新鮮牛脾臟100g，去除表皮包膜后，切成小塊，加入2.0％生理鹽水100g浸泡25min，然后加入提取液250g，用組織搗碎機搗碎，放入-8℃恒溫箱中，用機械攪拌器攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速550r/min，50min后，-3℃靜置1h，取上清液，加入氯化鈉35g，0℃攪拌30min后靜置1h，6000r/min離心15min，取上清液，加入鹽100g，0℃攪拌50min，然后靜置9h，9000r/min離心10min，取沉淀得透明質(zhì)酸酶粗品；(2)取步驟(1)中的沉淀，裝入透析袋中，放入50g檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液中，5℃透析13h，8000r/min離心20min，取上清液，冷凍干燥，得透明質(zhì)酸酶精品；測定透明質(zhì)酸酶活力為329.0u/ml。實施例2：從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶(1)取新鮮牛脾臟100g，去除表皮包膜后，切成小塊，加入2.0％生理鹽水100g浸泡30min，然后加入提取液250g，用組織搗碎機搗碎，放入-8℃恒溫箱中，用機械攪拌器攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速550r/min，50min后，-1℃靜置1h，取上清液，加入氯化鈉35g，0℃攪拌40min后靜置1.5h，6000r/min離心15min，取上清液，加入鹽100g，0℃攪拌55min，然后靜置9h，9000r/min離心10min，取沉淀得透明質(zhì)酸酶粗品；(2)取步驟(1)中的沉淀，裝入透析袋中，放入50g檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液中，6℃透析13h，8000r/min離心20min，取上清液，冷凍干燥，得透明質(zhì)酸酶精品。測定透明質(zhì)酸酶活力為329.2u/ml。實施例3：從牛脾臟中提取透明質(zhì)酸酶(1)取新鮮牛脾臟100g，去除表皮包膜后，切成小塊，加入2.0％生理鹽水100g浸泡35min，然后加入提取液250g，用組織搗碎機搗碎，放入-8℃恒溫箱中，用機械攪拌器攪拌，攪拌轉(zhuǎn)速550r/min，50min后，0℃靜置1h，取上清液，加入氯化鈉35g，0℃攪拌50min后靜置2h，6000r/min離心15min，取上清液，加入鹽100g，0℃攪拌60min，然后靜置9h，9000r/min離心10min，取沉淀得透明質(zhì)酸酶粗品；(2)取步驟(1)中的沉淀，裝入透析袋中，放入50g檸檬酸-氫氧化鈉-鹽酸緩沖液中，7℃透析13h，8000r/min離心20min，取上清液，冷凍干燥，得透明質(zhì)酸酶精品。測定透明質(zhì)酸酶活力為329.5u/ml。當(dāng)前第1頁12