雙特異性磷酸酶在人重組FGF21蛋白活性檢測中的應用的制作方法

本發明屬于雙特異性磷酸酶(dusp4)應用技術領域，具體涉及一種雙特異性磷酸酶在人重組fgf21蛋白活性檢測中的應用。

背景技術：

2型糖尿病嚴重威脅人類健康，其新藥研制一直是科研和開發領域的熱點，尤其以蛋白類藥物開發更為引人注目。在眾多的候選蛋白中，成纖維細胞生長因子21(fgf21)是一個研發熱點。研究發現，fgf21重組蛋白可降低肥胖和2型糖尿病患者的血脂、減輕體重、降低血糖、顯著減輕2型糖尿病及其并發癥。在藥物研發中，建立一個穩定高效的藥物效果檢測體系是評價候選藥物的關鍵，因此，建立一個客觀評價fgf21重組蛋白治療糖尿病效果的檢測體系也是fgf21研發中的一個重要環節。

目前，普遍采用的fgf21活性檢測方法是細胞的葡萄糖攝取測定：該方法通過葡萄糖的類似物2-脫氧葡萄糖來測定，2-脫氧葡萄糖攝入細胞后被己糖激酶磷酸化為6-磷酸-2-脫氧葡萄糖，6-磷酸-2-脫氧葡萄糖無法進入后續代謝步驟，因而會在細胞中聚集，直接成比例地反映細胞的葡萄糖攝入水平：該方法檢測過程中一是使用放射性物質標記2-脫氧葡萄糖，對于實驗防護和環境保護要求較高；另外檢測方法中使用熒光檢測方法測定6-磷酸-2-脫氧葡萄糖的水平，該方法價格昂貴，不利于高通量篩選使用，同時該檢測還受到己糖激酶活性的影響，在酶活性發生變化時不能很好地反映葡萄糖攝取能力變化。因此，研發新的fgf21功能檢測的體系不僅可彌補葡萄糖攝取測定的不足，而且有望獲得更為簡便可靠的檢測方法，這對于客觀評價fgf21重組蛋白效果具有重要意義。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種雙特異性磷酸酶在人重組fgf21蛋白活性檢測中的應用，為判斷人重組fgf21蛋白活性提供了新的思路，解決了現有檢測方法成本昂貴、對環境要求高的問題。

本發明所采用的技術方案是，雙特異性磷酸酶在人重組fgf21蛋白活性檢測中的應用。

本發明的特征在于，

雙特異性磷酸酶的基因表達水平與人重組fgf21蛋白的添加濃度的關系為：雙特異性磷酸酶基因表達水平隨人重組fgf21蛋白的添加濃度的增加而增大。

本發明所采用的另一個技術方案是，用于判斷人重組fgf21蛋白活性的雙特異性磷酸酶，其特征在于，所述的雙特異性磷酸酶的引物序列為：

上游引物：5’-cctgcttaaaggtggctatgaga-3’；

下游引物：5’-agtacttgcgctcaggagga-3’。

本發明的特征還在于，

雙特異性磷酸酶表達被人重組fgf21蛋白上調，且呈劑量依賴性升高。

雙特異性磷酸酶為脂肪細胞內的雙特異性磷酸酶。

本發明的有益效果是：本發明通過人重組fgf21蛋白處理脂肪細胞，采用定量反轉錄聚合酶鏈式反應(qrt-pcr)檢測脂肪細胞的基因表達，從而確定脂肪細胞雙特異性磷酸酶表達水平可成為fgf21活性檢測的新指標，操作過程簡單，對環境的要求低，有很好的實用價值。

附圖說明

圖1是本發明細胞轉變為成熟脂肪細胞的顯微圖片；

圖2是本發明定量pcr觀察dusp4和beta-actin基因的擴增曲線圖；

圖3是本發明pcr產物的溶解曲線；

圖4是本發明人重組fgf21對dusp4基因表達的影響圖；

圖5是本發明人重組fgf21對dusp4基因表達的的量效關系圖；

圖6是本發明人重組fgf21受體抑制劑對fgf21作用的抑制效應圖。

具體實施方式

本發明基于脂肪細胞dusp4基因表達的人重組fgf21蛋白活性檢測方法，下面結合附圖和具體實施方式對本發明進行詳細說明。

一、細胞培養和處理：小鼠前體脂肪細胞細胞種植于12孔培養板中，在37℃孵箱培養，所用培養液為普通培養液即dmem培養液，其中加入體積分數10％的新生牛血清，每2天更換新鮮培養液；當細胞生長至接觸抑制2天后，更換到誘導培養液，誘導培養液為dmem培養液，其中加入體積分數10％的新生牛血清、0.3iu/ml胰島素、20μmol/l地塞米松和20μmol/l羅格列酮，處理2天后；更換到胰島素培養液，胰島素培養液為dmem培養液，其中加入體積分數為10％的新生牛血清和0.3iu/ml胰島素，繼續培養2天后；更換到普通培養液中繼續培養，細胞經誘導后可見細胞內脂滴沉積，向脂肪細胞轉化，每2天更換新鮮培養液，6天后細胞用于fgf21處理。如圖1所示，細胞經誘導分化后全部出現脂滴沉積，轉變為成熟的脂肪細胞。

在脂肪細胞培養液中分別加入不同濃度0ng/ml、1ng/ml、3ng/ml、10ng/ml、30ng/ml、100ng/ml、300ng/ml、1000ng/ml人重組fgf21蛋白，處理12小時后，3t3-f422脂肪細胞用于rna提取。

二、脂肪細胞rna提取和反轉錄：將12孔板中的培養液去除干凈，每孔加入350μl裂解液rl，用細胞研磨棒研磨裂解，再將所有溶液轉移至過濾柱cs中12000rpm離心2min，收集濾液；再向濾液中加入350μl70％乙醇，混勻并轉入吸附柱cr3中12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入80μldnasei工作液，室溫放置15min；向吸附柱cr3中加入350μl去蛋白液rw1，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室溫靜置2min，12000rpm離心1min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3放回收集管中；重復向吸附柱cr3中加入500μl漂洗液rw，室溫靜置2min，12000rpm離心2min，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱cr3置于室溫放置5min以徹底晾干殘余的漂洗液；將吸附柱cr3轉入rnase-free離心管中，加入50μlrnase-freeddh2o，室溫放置2min，12000rpm離心2min，得到rna溶液。

酶標儀檢測rna濃度與純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測rna質量。在八連管中依次加入2μl5xgdnaeraserbuffer，再分別加入1μlgdnaeraser，再分別加入1μgtotalrna，最后用rnasefreedh2o補足至10μl，混勻，室溫反應5min。在各管中分別加入以下試劑，4μl5xprimescriptbuffer2，4μlrnasefreedh2o，1μlprimescriptrtenzymemixi，1μlrtprimermix，總反應體系為20μl，混勻。反應條件為37℃15min，85℃，5s。反應完成后將cdna存于4℃備用，長期保存時轉入-20℃。

三、dusp4表達水平的檢測：dusp4基因表達水平采用定量pcr方法檢測，以beta-actin基因的表達作為參考基因。在八連管中依次加入6μldh2o，2μl模板cdna，2μldusp4引物，10μlsybrpremixextaqii(2x)，總反應體系為20μl，混勻。

反應條件是：第一步是94℃、5min，第二步是94℃、30s，56℃、30s，72℃、1min循環進行40次，第三步是進行加溫溶解擴增產物，獲得溶解曲線。

dusp4引物序列是：

上游引物：5’-cctgcttaaaggtggctatgaga-3’；

下游引物：5’-agtacttgcgctcaggagga-3’。

beta-actin的引物序列是：

上游引物：5’-cgttggcatccacgaaacta-3’；

下游引物：5’-ggtgctgggaggtacaggg-3’。

以beta-actin基因表達為參考，對實驗結果進行表達水平分析：如圖2所示，隨著擴增次數的增加，dusp4和beta-actin基因的拷貝數在一定擴增次數后呈指數增加，最后到達平臺期；如圖3所示，溶解曲線表現單峰，說明擴增產物的特異性強；如圖4所示，人重組fgf21(美國peprotech公司產品，濃度100ng/ml)處理細胞12小時可顯著增加脂肪細胞內dusp4的表達(**表示統計學分析p<0.01，n＝6)；如圖5所示，dusp4表達隨人重組fgf21(美國peprotech公司產品，處理細胞12小時)濃度的增加而增加，表現為良好的量效關系；如圖6所示，進行了4組實驗，一組為對照組即空白組，二組加入人重組fgf21蛋白，三組加入人重組fgf21蛋白抑制劑azd4547，四組同時加入人重組fgf21蛋白和抑制劑azd4547，結果表明，人重組fgf21受體抑制劑azd4547(美國mce公司產品，濃度10nmol/l)處理后顯著抑制fgf21對dusp4表達的作用(**表示統計學分析p<0.01，n＝6)。

四、擴增特異性的鑒定：把定量pcr擴增產物進行dna測序，dusp4測序結果如下：

“cctgcttaaaggtggctatgagaggttttcttctgaatacccagaattctgctctaaaaccaaggccctggccgccatcccaccccctgtacctcccagca”。

擴增片段大小為103bp，與美國國家生物技術信息中心報道的dusp4mrna(序號：nm176933.4)的554-656堿基序列完全一致。

根據以上實驗結果發現，雙特異性磷酸酶(dualspecificityphosphatase4，dusp4)表達被人重組fgf21上調，且呈劑量依賴性升高，脂肪細胞dusp4表達水平可成為fgf21活性檢測的新指標。