用轉基因斑馬魚檢測具乙酰膽堿酯酶抑制活性物質的方法與流程

本發明屬于生物技術領域，涉及一種利用轉基因斑馬魚檢測具乙酰膽堿酯酶抑制活性物質的方法。

背景技術：

乙酰膽堿酯酶是降解乙酰膽堿的水解酶。乙酰膽堿酯酶存在于神經傳導組織和紅細胞膜，在神經細胞突觸和神經肌肉接點-運動終板的發育過程中具有重要作用。乙酰膽堿酯酶抑制劑通過抑制乙酰膽堿水解酶活性阻斷神經之間，神經和肌肉間的信號傳遞，影響神經和運動功能并導致動物癱瘓和死亡。乙酰膽堿酯酶抑制劑被廣泛應用于治療阿爾茨海默病、神經毒劑和殺蟲劑(沙林、vx毒氣、有機磷和氨基甲酸類農藥等)。由于有機磷農藥具有毒性強、毒性效應廣、在環境中可快速降解等特點，被廣泛應用于農業生產和作為室內外殺蟲劑。有機磷和氨基甲酸類農藥的廣泛使用對食物、水和土壤的污染引起了公眾對健康影響的關注，對生態環境安全的擔憂。評價乙酰膽堿酯酶抑制劑類物質對人類健康和環境的影響效應，研究、發明特異性好，高效的檢測乙酰膽堿酯酶抑制劑類物質的方法和技術成為關鍵。

檢測環境中乙酰膽堿酯酶抑制劑的水平已經被廣泛用做土壤、水環境中有機磷農藥的動物暴露水平和導致動物生理效應的評價指標。分析化學技術雖然可以分析、辨別目前食物、生物和環境樣品中多數有機磷和氨基甲酸類化學物質，但是這些技術需要特殊的分析儀器和專業人員，限制了其應用范圍。同時絕大多數有機磷類農藥在環境中快速降解，經過幾小時或者數天后有機磷農藥的濃度會低于儀器的檢測限，直接影響分析結果。檢測乙酰膽堿酯酶活性的電化學裝置不但需要制備靈敏性高的乙酰膽堿酯酶，而且乙酰膽堿酯酶抑制劑會導致感應器中乙酰膽堿酯酶活性的不可逆性抑制，影響電化學感應器的重復使用。基于細胞活性的檢測方法具有快速、敏感性高的特點，但是不能反映乙酰膽堿酯酶抑制劑在生物體內代謝的相關信息，同時細胞對不同類型的化學物質的生物學效應具有相似性，直接影響乙酰膽堿酯酶抑制劑檢測的特異性。

斑馬魚具有個體小、養殖費用低、生長周期短、產卵量大、胚胎透明和體外發育等優點，被廣泛用于遺傳、發育、環境毒理和人類疾病等方面的研究。用斑馬魚評價環境化學污染物的毒性效應的標準方法已經建立并得到廣泛應用(oecd203,oecd236,iso7346)，但是這些標準方法檢測污染物毒性效應的敏感性較低，特異性不高。通過基因重組技術，構建表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚已經被廣泛應用于研究發育過程中基因調控，藥物的作用位點和安全性評價等領域。表達熒光蛋白的轉基因魚不但能用于研究化學物質誘導的靶基因的表達活性，還可以半定量分析化學物質在組織和器官的累積量，為化學物質毒性的生物學效應評價提供了一種敏感性高，重復性和特異性好的方法。一些對環境中一種或者一類化學物質敏感性高，特異性強的表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚已經被用于評價環境中重金屬和有機化學污染物的毒性效應和機理研究。目前所有構建的轉基因魚不能或不適合用于檢測環境樣品中具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化學物質。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種利用轉基因斑馬魚檢測具乙酰膽堿酯酶抑制活性物質的方法。

首先，本發明提供了一種利用轉基因斑馬魚檢測待測物質是否為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質的方法。

本發明所提供的利用轉基因斑馬魚檢測待測物質是否為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質的方法，具體可包括如下步驟：

(a1)向轉基因斑馬魚的培養體系中加入不同濃度的待測物質，使培養體系中所述待測物質的濃度呈現一定的濃度梯度，經過24-72小時(如44-48小時)暴露，檢測所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值，記錄經不同濃度的所述待測物質暴露誘導的轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值；

所述轉基因斑馬魚為轉基因斑馬魚a或轉基因斑馬魚b；

所述轉基因斑馬魚a為向受體斑馬魚中轉入修飾后的bacdna，經過同源重組后得到的；所述修飾后的bacdna是將斑馬魚bacdna中的hspb11基因的外顯子部分替換為含有熒光蛋白編碼基因的片段后得到的；

所述轉基因斑馬魚b為向受體斑馬魚中轉入含有目的dna片段的重組質粒后得到的，所述目的dna片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游調控序列、熒光蛋白編碼基因及抗性篩選標記基因；

(a2)如果經過不同濃度的所述待測物質暴露后，存在至少一個濃度使得所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值顯著高于本底值，則所述待測物質為或候選為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質；反之，則所述待測物質不為或候選不為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質；

所述本底值為沒有加入所述待測物質的所述轉基因斑馬魚培養體系中培養的轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值。

步驟(a1)中，用所述轉基因斑馬魚的培養體系檢測所述待測物質時，用同一常數稀釋因子(如＝2)稀釋所述待測物質為不少于5個濃度，濃度范圍應包括使所述轉基因斑馬魚的胚胎100％死亡的最高濃度和不會對所述轉基因斑馬魚的胚胎造成任何可見影響的最低濃度。

其中，培養體系中所述待測物質的5個濃度梯度的設置，以“只要步驟(a2)中存在使得所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值顯著高于所述本底值的所述待測物質的濃度，就一定不能全部錯過”為標準。這一標準主要是針對所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值會隨著所述待測物質的濃度劑量關系曲線呈拋物線的待測物質而言的。

在本發明的一個實施例中，所述待測物質的濃度梯度設置于0.01μm至3mm之間。

在本發明的一個實施例中，所述待測物質具體選自如下：谷硫磷(azinphosmethyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、殘殺威(propoxur)、加蘭他敏(galanthamine)、甲基汞、二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)。

其次，本發明還提供了一種檢測待測水體是否被具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質污染的方法。

本發明所提供的檢測待測水體是否被具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質污染的方法，具體可包括如下步驟：

(b1)用同一常數稀釋因子(如＝2)稀釋所述待測水體為不少于5個濃度，在轉基因斑馬魚培養體系中加入所述不少于5個濃度的所述待測水體，經24-72小時(如44-48小時)后檢測所述轉基因斑馬魚肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值；

所述轉基因斑馬魚為轉基因斑馬魚a或轉基因斑馬魚b；

所述轉基因斑馬魚a為向受體斑馬魚中轉入修飾后的bacdna，經過同源重組后得到的；所述修飾后的bacdna是將斑馬魚bacdna中的hspb11基因的外顯子部分替換為含有熒光蛋白編碼基因的片段后得到的；

所述轉基因斑馬魚b為向受體斑馬魚中轉入含有目的dna片段的重組質粒后得到的，所述目的dna片段自上游到下游依次含有hspb11基因6kb上游調控序列、熒光蛋白編碼基因及抗性篩選標記基因；

(b2)如果步驟(b1)中檢測所得的任何一個濃度導致所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值顯著高于本底值，則所述待測水體被具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質污染或疑似被具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質污染；反之，則所述待測水體未被具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質污染；

所述本底值為沒有加入所述待測水體的所述轉基因斑馬魚的培養體系中培養的所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度值。

其中，所述待測水體可為淡水，也可為海水。

根據本發明的一個實施例，所述待測水體的污染源可選自如下：谷硫磷(azinphosmethyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、殘殺威(propoxur)、加蘭他敏(galanthamine)、甲基汞、二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)。

在上述兩種方法中，對于所述轉基因斑馬魚a來說，所述修飾的bacdna是通過目的dna片段與編號為dkey-30k6的斑馬魚bacdna發生同源重組后得到的；所述目的dna片段包括位于兩端的上下游同源臂序列和位于中間的熒光蛋白編碼基因及抗性篩選標記基因；其中，上游同源臂序列為序列表中序列1，下游同源臂序列為序列表中序列2。對于所述轉基因斑馬魚b來說，所述hspb11基因6kb上游調控序列如序列表中序列5所示。

進一步，對于所述轉基因斑馬魚a來說，所述編號為dkey-30k6的斑馬魚bacdna的genbank登錄號為al844141.7，其中hspb11的genbank登錄號為nm_001099427；所述熒光蛋白編碼基因為綠色或紅色熒光蛋白的編碼基因；所述抗性篩選標記基因為卡那霉素抗性基因。對于所述轉基因斑馬魚b來說，所述熒光蛋白編碼基因為綠色或紅色熒光蛋白的編碼基因；所述抗性篩選標記基因為氨芐青霉素抗性基因。

更進一步，對于所述轉基因斑馬魚a來說，所述綠色熒光蛋白的編碼基因為序列表中序列3的第470-1246位；所述卡那霉素抗性基因為序列表中序列3的第1999-2793位。對于所述轉基因斑馬魚b來說，所述綠色熒光蛋白的編碼基因為序列表中序列6的第100-816位；所述氨芐青霉素抗性基因為序列表中序列6的第2293-3153位。

具體的，對于所述轉基因斑馬魚a來說，所述目的dna片段的序列為序列表中序列3。對于所述轉基因斑馬魚b來說，所述含有目的dna片段的重組質粒為將序列表中序列5所示dna片段插入到序列6所示質粒的酶切位點bamhi和ecori之間后得到的重組質粒。

在上述兩種方法中，所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度顯著高于本底值，更加嚴謹的可為：所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度為所述本底值的1.5倍以上。

在上述兩種方法中，所述轉基因斑馬魚可為轉基因斑馬魚的胚胎或幼魚。

在本發明的一個實施例中，所述轉基因斑馬魚具體為發育至4小時的轉基因斑馬魚的胚胎。

在上述兩種方法中，所述具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質為乙酰膽堿酯酶抑制劑或其它具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質。

在本發明的一個實施例中，所述具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質具體為谷硫磷(azinphosmethyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、殘殺威(propoxur)、加蘭他敏(galanthamine)或甲基汞。

在上述兩種方法中，一次完整的檢測中所涉及的所有所述轉基因斑馬魚的肌肉和/或脊索細胞的熒光強度的測定，全部圖象均使用相同的曝光參數，且保持同樣的熒光采集部位(如采集所述轉基因斑馬魚的第12至18體節，全部圖像呈背面觀)。

用于制備所述轉基因斑馬魚的試劑盒也屬于本發明的保護范圍。

本發明所提供的用于制備所述轉基因斑馬魚的試劑盒，具體可含有前文所述的修飾后的bacdna，或者含有前文所述的含有目的dna片段的重組質粒。

如下(a)或(b)所示應用也屬于本發明的保護范圍。

(a)前文所述的轉基因斑馬魚在如下(a)或(b)中的應用；

(b)受體斑馬魚和所述試劑盒在如下(a)或(b)中的應用；

(a)檢測待測物質是否為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質；

(b)檢測待測水體是否被具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質污染。

本發明構建了tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚，實驗證明其能夠用于評價乙酰膽堿酯酶抑制劑導致斑馬魚體內所產生的生物效應，由于其是一種基于斑馬魚hspb11基因的上游調控序列調控報告基因即熒光蛋白編碼基因表達的檢測方法，因而具有簡單、快速和廉價的特點；另外，對具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化學物質具有特異性和敏感性；且適用于對含有乙酰膽堿酯酶抑制劑的水溶液(含淡水和海水)進行檢測。

附圖說明

圖1為用同源重組方法在包含hspb11基因組序列的bac(dkey-30k6)dna中插入熒光蛋白基因的示意圖。

圖2為斑馬魚胚胎顯微注射及瞬時表達熒光蛋白胚胎的挑選。其中，a為胚胎注射；b為瞬時表達綠色熒光蛋白的6-8小時胚胎；c為瞬時表達綠色熒光蛋白的24小時胚胎。

圖3為穩定表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚構建。其中，a為穩定表達綠色熒光蛋白的48小時胚胎；b為表達綠色熒光蛋白的肌肉細胞(圖a白色方框側面觀)；c為表達綠色熒光蛋白的肌肉和脊索細胞(圖a白色方框背面觀)；d為斑馬魚hspb11mrna24小時胚胎表達區域(原位雜交)；e為表達hspb11mrna的肌肉細胞(圖d黑色方框側面觀)。

圖4為各種化學物質誘導tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚熒光蛋白表達情況(化學物質誘導tg(-6kbhspb11:egfp)的結果與圖4基本一致)。其中，a為表達綠色熒光蛋白的對照胚胎；b為谷硫磷(azinphosmethyl)誘導綠色熒光蛋白表達；c為殘殺威(propoxur)誘導綠色熒光蛋白表達；d為毒死蜱(chlorpyrifos)誘導綠色熒光蛋白表達；e為加蘭他敏(galanthamine)誘導綠色熒光蛋白表達；f為甲基汞誘導綠色熒光蛋白表達；g為二溴乙烷(1,2-dibromoethane)處理胚胎；h為百菌清(chlorothalonil)處理胚胎。全部圖象均使用相同的曝光參數，采集于48小時胚胎的第12至18體節，全部圖像呈背面觀。

具體實施方式

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

斑馬魚系：野生型斑馬魚(ab品系)；轉基因斑馬魚tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)，具體構建方法見實施例1。

化學物質：有機磷農藥谷硫磷(azinphosmethyl，cas86-50-0)，毒死蜱(chlorpyrifos,cas2921-88-2)。乙酰膽堿酯酶抑制劑殘殺威(propoxur,cas114-26-1)，加蘭他敏(galanthamine,cas357-70-0)。重金屬甲基汞(cas115-09-3)。有機溴和氯類農藥：二溴乙烷(1,2-dibromoethane,cas106-93-4)，百菌清(chlorothalonil,cas1897-45-6)。

儀器：顯微注射儀。

斑馬魚培養：水溫28.5℃，14/10小時的日/夜周期，循環水培養。商業飼料和孵化的鹵蟲喂養。

斑馬魚卵收集：雌雄成魚按照1:2比例放置于產卵盒中，收集的受精卵放置于胚胎專用培養液，胚胎培養條件：水溫28.5℃，14/10小時的日/夜周期，72小時開始孵化，胚胎發育階段按照標準確定。

實施例1、轉基因斑馬魚tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)的構建

本發明是基于斑馬魚基因hspb11，genbankid為nm_001099427的表達調控序列，采用同源重組的方法來構建具有和內源性hspb11基因表達區域一致的、調控報告基因—熒光蛋白表達的轉基因斑馬魚。

一、構建由斑馬魚hspb11上游調控序列調控報告基因的tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚

(一)斑馬魚基因hspb11同源重組質粒的構建

1、上下游同源臂序列的擴增

以斑馬魚bac克隆(dkey-30k6，genbank登錄號為al844141.7，sourcebioscience公司產品，貨號為dkey-30k6)為模板，以引物1和引物2進行pcr擴增，得到a片段(ggtacc+序列表中序列1+aagctt)。

引物1：5’-ggtaccgttggaatgctcgctggtta-3’；

引物2：5’-aagcttctcgggcaaagcatcttcag-3’。

以斑馬魚bac克隆(dkey-30k6，genbank登錄號為al844141.7，sourcebioscience公司產品，貨號為dkey-30k6)為模板，以引物3和引物4進行pcr擴增，得到b片段(ccgcgg+序列表中序列2+gagctc)。

引物3：5’-ccgcggcacaatggaatgaaccgcca-3’；

引物4：5’-gagctccgtgagccaaaccaaaccaa-3’。

兩次pcr的反應程序均為：98℃5分鐘；98℃30秒，55℃20秒，60℃4分鐘，30個循環；60℃5分鐘；4℃保存。

所得片段a和片段b即為用于同源重組時的同源臂序列。

2、帶有熒光蛋白基因的同源重組質粒的構建

步驟1經pcr擴增所得片段a和片段b，經過凝膠電泳、片段回收、t4連接酶連接反應分別插入pgem-t載體。經測序驗證后，片段a經過kpni和hindiii酶切，片段b經過saci和sacii酶切，回收、依次連接入包含熒光蛋白、多聚腺嘌呤(polya)、卡那霉素抗性基因的同源重組質粒pcs2-gfp-polya-kanr(全序列見序列4)，并測序驗證，測序驗證正確的質粒命名為pcs2-a+gfp-polya-kanr+b。

重組載體pcs2-a+gfp-polya-kanr+b的結構描述如下：經限制性內切酶kpni和hindiii酶切回收的片段a插入pcs2-gfp-polya-kanr載體中的熒光蛋白序列的5’端的相應酶切位點處，且經saci和sacii酶切回收的片段b插入pcs2-gfp-polya-kanr載體中卡那霉素抗性基因序列的3’端的相應酶切位點處。

(二)經同源重組技術構建插入熒光蛋白基因的包含斑馬魚基因hspb11的bacdna

1、斑馬魚基因hspb11的bac(dkey-30k6)dna的細胞轉化

加入250-500納克(體積不超過5微升)提純的斑馬魚bac(dkey-30k6)dna于42微升電轉化感受態細胞el250中，設置電轉化儀電壓為2.5kv，放入電轉化細胞進行轉化。轉化后的細胞在含有氯霉素的培養板涂板，32℃培養箱培養。挑選生長的細菌，培養、pcr鑒定，確定包含dkey-30k6dna的轉化細胞。

2、用同源重組在包含hspb11基因組序列的bac(dkey-30k6)dna中插入熒光蛋白基因

示意圖如圖1所示。

(1)將步驟一制備的帶有熒光蛋白基因的同源重組質粒pcs2-a+gfp-polya-kanr+b經kpni和saci酶切、電泳、回收的包含同源序列a、綠色熒光蛋白基因、卡那霉素抗性基因和同源序列b的dna，記為“目的dna片段”。“目的dna片段”的序列如序列表中序列3所示，其中第1-440位為片段a，第470-1246位為綠色熒光蛋白的編碼基因，第1289-1423位為sv40polya信號序列，第1999-2793位為卡那霉素抗性基因，第3006-3439位為片段b。

(2)在制備的激活重組酶的電轉化感受態(包含bacdkey-30k6dna)el250細胞中，加入150-500納克“目的dna片段”，以2.5kv電壓進行轉化。轉化后的細胞在氯霉素和卡那霉素的培養基上涂板，挑選，培養，pcr鑒定獲取插入熒光蛋白基因的克隆，提取、純化插入熒光蛋白基因的bacdna，記為“修飾后的bacdna”。

(三)構建由斑馬魚hspb11上游調控序列調控報告基因的tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚

1、斑馬魚胚胎顯微注射插入熒光蛋白基因的hspb11基因重組bacdna

用顯微注射儀在斑馬魚1-2細胞期胚胎的細胞中，注入加入0.1％的酚紅顯示劑的50-150納克/微升的步驟二純化的“修飾后的bacdna”。用斑馬魚胚胎培養液培養注射后的胚胎，胚胎發育過程中挑選發育正常的胚胎，在熒光體視顯微鏡下觀察、挑選表達熒光的胚胎(見圖2)。

2、穩定表達熒光蛋白轉基因斑馬魚的篩選

挑選健康的培養至性成熟(2-3個月)的注射過“修飾后的bacdna”的斑馬魚和正常培養斑馬魚(ab野生型)，按照1:2的雌雄比例進行交配，收集受精卵，培養至24小時，熒光顯微鏡鏡檢鑒定表達熒光的胚胎。用原位雜交技術比較轉基因斑馬魚胚胎表達熒光蛋白的區域和內源性hspb11基因的表達，挑選表達一致的胚胎培養，建成穩定表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚(見圖3)，即為tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚。

二、構建由斑馬魚hspb11上游調控序列調控報告基因的tg(-6kbhspb11:egfp)轉基因斑馬魚

1、上游調控序列的擴增

以斑馬魚bac克隆(dkey-30k6，genbank登錄號為al844141.7，sourcebioscience公司產品，貨號為dkey-30k6)為模板，以引物5和引物6進行pcr擴增，得到6017個堿基的上游調控序列片段(ggatcc+序列表中序列5+gaattc)。

引物5：5’-ggatcctggatacatcgtggggattt-3’；

引物6：5’-gaattctttgctgttgagctgtttgg-3’。

pcr的反應程序均為：98℃5分鐘；98℃30秒，55℃30秒，60℃7分鐘，30個循環；60℃15分鐘；4℃保存。

所得片段為6017個堿基的上游調控序列，記為-6kbhspb11(參見序列表中序列5)。

2、-6kb上游調控序列插入報告基因載體pcs2-gfp-polya-ampr

步驟1經pcr擴增所得上游調控序列片段-6kbhspb11(序列5)經測序驗證后，經過bamhi和ecori酶切，回收、連接入包含熒光蛋白、多聚腺嘌呤(polya)、氨芐青霉素抗性基因的同源重組質粒pcs2-gfp-polya-ampr(全序列見序列6，其中第100-816位為綠色熒光蛋白的編碼基因，第846-980位為sv40polya信號序列，第2293-3153位為氨芐青霉素抗性基因)，并測序驗證，測序驗證正確的質粒命名為pcs2+-6kbhspb11-gfp-polya-ampr。

重組載體pcs2+-6kbhspb11-gfp-polya-ampr的結構描述如下：經限制性內切酶bamhi和ecori酶切回收的-6kb上游調控序列插入pcs2-gfp-polya-ampr的熒光蛋白序列的5’端的相應酶切位點處。

3、斑馬魚胚胎顯微注射插入hspb11基因6kb上游調控序列和熒光蛋白基因的重組質粒

用顯微注射儀在斑馬魚1-2細胞期胚胎的細胞中，注入加入0.1％的酚紅顯示劑的50-150納克/微升的純化的“pcs2+-6kbhspb11-gfp-polya-ampr”dna。用斑馬魚胚胎培養液培養注射后的胚胎，胚胎發育過程中挑選發育正常的胚胎，在熒光體視顯微鏡下觀察、挑選表達熒光的胚胎(見圖2)。

4、穩定表達熒光蛋白轉基因斑馬魚的篩選

挑選健康的培養至性成熟(2-3個月)的注射過“pcs2+-6kbhspb11-gfp-polya-ampr”dna的斑馬魚和正常培養斑馬魚(ab野生型)，按照1:2的雌雄比例進行交配，收集受精卵，培養至24小時，熒光顯微鏡鏡檢鑒定表達熒光的胚胎。用原位雜交技術比較轉基因斑馬魚胚胎表達熒光蛋白的區域和內源性hspb11基因的表達，挑選表達一致的胚胎培養，建成穩定表達熒光蛋白的轉基因斑馬魚(見圖3)，即為tg(-6kbhspb11:egfp)轉基因斑馬魚。

實施例2、乙酰膽堿酯酶抑制劑對tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚熒光蛋白表達的誘導及其特異性分析

一、定量分析化學物質誘導tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚熒光蛋白表達水平

發育至4小時的tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)斑馬魚胚胎，分別用不同濃度的有機磷農藥谷硫磷(azinphosmethyl)，毒死蜱(chlorpyrifos)，乙酰膽堿酯酶抑制劑殘殺威(propoxur)，加蘭他敏(galanthamine)，重金屬甲基汞，有機溴和氯類農藥二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)水溶液處理。采集48小時胚胎的第12至18體節的熒光圖像，全部圖像呈背面觀。通過比較熒光強度來定量分析經過暴露的胚胎和未經暴露的對照胚胎的綠色熒光來評價不同化學物質誘導熒光蛋白表達的濃度效應關系。

結果見圖4為各種化學物質誘導tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚熒光蛋白表達情況(化學物質誘導tg(-6kbhspb11:egfp)的結果與圖4基本一致)。具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化學物質(b為谷硫磷(azinphosmethyl)，c為殘殺威(propoxur)，d為毒死蜱(chlorpyrifos)，e為加蘭他敏(galanthamine)，f為甲基汞)誘導斑馬魚胚胎表達綠色熒光蛋白的熒光強度比a對照胚胎熒光強度增加1.5倍。不具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化學物質(g二溴乙烷(1,2-dibromoethane)，h百菌清(chlorothalonil))不能誘導斑馬魚胚胎表達綠色熒光蛋白的熒光強度的增加。

二、具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質誘導tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚綠色熒光蛋白表達的特異性分析

發育至4小時的tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)斑馬魚胚胎，分別用不同濃度的有機磷農藥谷硫磷(azinphosmethyl)，毒死蜱(chlorpyrifos)，乙酰膽堿酯酶抑制劑殘殺威(propoxur)，加蘭他敏(galanthamine)，重金屬甲基汞，有機溴和氯類農藥二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)水溶液處理。采集48小時胚胎的第12至18體節的熒光圖像，全部圖像呈背面觀。分析具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質誘導tg(-6kbhspb11:egfp)和/或tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚綠色熒光蛋白表達的特異性。

結果顯示：具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化學物質誘導綠色熒光蛋白的表達并呈現濃度效應關系。比較對照組斑馬魚胚胎和化學物質暴露胚胎的熒光強度，0.199μm谷硫磷，4.374μm毒死蜱，51.790μm殘殺威，1043μm加蘭他敏和0.538μm甲基汞分別誘導熒光強度升高1.5倍。沒有乙酰膽堿酯酶抑制活性的二溴乙烷和百菌清不誘導綠色熒光蛋白表達。例如2660μm的二溴乙烷導致28％的胚胎呈現運動功能異常，并沒有誘導綠色熒光蛋白的表達(圖4中g和表1)。同樣導致24％胚胎運動功能異常的0.5μm的百菌清也沒有誘導綠色熒光蛋白表達的活性(圖4h和見表1)，表明具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化學物質具有誘導綠色熒光蛋白表達的特異性。化學物質誘導tg(-6kbhspb11:egfp)的結果與圖4基本一致。

三、tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚胚胎對乙酰膽堿酯酶抑制劑活性的敏感性分析

發育至4小時的tg(-6kbhspb11:egfp)和tg(hspb11:egfp)斑馬魚胚胎，分別用不同濃度的有機磷農藥谷硫磷(azinphosmethyl)，毒死蜱(chlorpyrifos)，乙酰膽堿酯酶抑制劑殘殺威(propoxur)，加蘭他敏(galanthamine)，重金屬甲基汞，有機溴和氯類農藥二溴乙烷(1,2-dibromoethane)和百菌清(chlorothalonil)水溶液處理。采集48小時胚胎的第12至18體節的熒光圖像，全部圖像呈背面觀。分析tg(-6kbhspb11:egfp)和/或tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚胚胎對乙酰膽堿酯酶抑制劑活性的敏感性。

結果顯示：具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的化學物質暴露會導致斑馬魚胚胎呈現非自主性運動，軀干扭曲等運動功能損傷。0.3μm谷硫磷可以導致23％的胚胎呈現運動功能損害，而0.199μm谷硫磷誘導的熒光強度水平超過對照組的1.5倍。120μm的殘殺威導致20％的胚胎出現非自主性運動變化，51.790μm的殘殺威誘導的熒光強度比對照組升高1.5倍。1000μm的加蘭他敏導致35％的胚胎出現運動功能損害，1043μm加蘭他敏誘導胚胎熒光強度升高1.5倍。4μm毒死蜱導致10％的胚胎呈現運動功能損害，4.374μm毒死蜱誘導胚胎熒光強度增加1.5倍。不具有乙酰膽堿酯酶抑制劑活性的二溴乙烷和百菌清雖然造成形態和運動功能的改變，但是并不誘導熒光蛋白表達活性(見表1)。

表1tg(hspb11:egfp)轉基因斑馬魚胚胎評價乙酰膽堿酯酶抑制劑生物效應的特異性和敏感性(tg(-6kbhspb11:egfp)轉基因斑馬魚與表1所示結果基本一致)

注：谷硫磷(azinphosmethyl)、毒死蜱(chlorpyrifos)、殘殺威(propoxur)、加蘭他敏(galanthamine)和甲基汞為具有乙酰膽堿酯酶抑制活性的物質。

<110>中國環境科學研究院

<120>用轉基因斑馬魚檢測具乙酰膽堿酯酶抑制活性物質的方法

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