一種高產不飽和脂肪酸重組工程菌株及其構建方法與流程

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及一種高產不飽和脂肪酸重組工程菌株及其構建方法。

背景技術：

許多不飽和脂肪酸因其廣泛的生理活性和其在人類健康、營養方面的重要作用越來越受人們關注；多肽藥物又因其半衰期短、易被酶降解而限制了應用。

微生物油脂的合成過程與動植物幾乎相似，最主要的部分就是脂肪酸的合成，主要有兩種胞質酶系催化，乙酰coa羧化酶和脂肪酸合酶復合體，以乙酰coa為碳源經過多次碳鏈延長合成飽和脂肪酸，或再經過去飽和作用合成不飽和脂肪酸。在去飽和過程中主要由各種去飽和酶負責催化，是合成長鏈不飽和脂肪酸的關鍵，能在脂肪酸碳鏈上引入c＝c雙鍵，提高脂肪酸的不飽和度，酵母中廣泛存在脂肪酸去飽和酶。

而合成不飽和脂肪酸的酶分為兩種，甲基定向和羧基定向的脂肪酸去飽和酶。甲基定向的脂肪酸去飽和酶從甲基端固定的碳原子處引入碳碳雙鍵，被稱為ω-去飽和酶；羧基定向的脂肪酸去飽和酶從羧基端固定的碳原子處引入碳碳雙鍵，被稱為δ(delta)-去飽和酶，也稱為“front-end”去飽和酶。δ9-去飽和酶將第一個碳碳雙鍵引入飽和脂肪酸中，第二個碳碳雙鍵由δ12和δ6-去飽和酶負責引入，δ15去飽和酶則負責引入第三個雙鍵。

在細胞合成18c飽和脂肪酸后，硬脂酸經硬脂酰-coa去飽和酶去飽和得到油酸；油酸經δ12-去飽和酶催化生成亞油酸，經δ15-去飽和酶合成α-亞麻酸(ala)；亞油酸經δ6-去飽和酶催化生成γ-亞麻酸gla。其中，δ6-去飽和酶是gla合成途徑中的關鍵酶，第一次克隆出δ6-去飽和酶是1993年從藍藻中分離克隆得到的，第一次通過生物技術獲得gla是在1996年在土豆中表達藍藻的δ6-去飽和酶基因生產gla。gla在人體中進一步脫氫延長形成花生四烯酸(aa)、前列腺素類和白三烯類等生理活性物質，對人體有重要生理意義，因而近年人們對δ6-脂肪酸脫氫酶基因的研究熱度較高，也取得了較大進展。

雖然已經有多篇報道表明，表達外源δ6-脂肪酸脫氫酶在酵母中會使gla含量增加，但是迄今為止，尚未出現利用基因工程構建可以高產γ-亞麻酸(gla)的酵母菌菌株的報道。

技術實現要素：

針對以上所述現有技術存在的不足，本發明的第一目的是提供一種高產不飽和脂肪酸重組工程菌株。

本發明的第二目的是提供所述高產不飽和脂肪酸重組工程菌株的建方法。

為解決上述的技術問題，本發明采用如下技術方案：一種高產不飽和脂肪酸重組工程菌株，將δ6-去飽和酶(d6d)整合到工程菌的基因組中。

優選的，所述工程菌可以是酵母菌，所述酵母菌是釀酒酵母。所述釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)cgmmcc2.1445。

優選的，所述酵母菌是粘紅酵母。

所述δ6-去飽和酶(d6d)有刺孢小克銀漢霉的d6d基因的分離與擴增得到的。

一種高產不飽和脂肪酸重組工程菌株構建方法,其包括的步驟如下：

(1)表達載體ppgk1z-rd-me的抽提；

(2)連接pgk1基因和d6d基因；

(3)pgk1-d6d片段與表達載體載體的雙酶切反應、連接。

表達載體ppgk1z-rd-me的抽提的方法的步驟如下：

(1)將含有ppgk1z-rd質粒的大腸桿菌dh5α接種到裝有5mllb-amp培養基中，于37℃下250rpm振蕩培養過夜；

(2)吸取1.5ml過夜菌液于離心管中，4℃下12000rpm離心1分鐘，棄上清；

(3)用濾紙吸干離心管中的液體培養基，將菌體沉淀懸浮于200μlstet緩沖液中，用渦旋混合器充分混勻；

(4)加入4ml新配制的溶菌酶溶液，混勻后于室溫下靜置5分鐘；

(5)用漂子架住離心管，置于沸水浴中，精確記時45秒，取出后立刻12000rpm離心5分鐘；

(6)用無菌牙簽挑取離心管中的沉淀物棄去，離心管的上清液中加入8ml5％ctab，用混合器混勻后，13000rpm離心5分鐘，棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體；

(7)加入1.2mnacl300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的預冷乙醇，充分混勻后，13000rpm離心15分鐘，棄上清液；

(8)取1ml70％冷乙醇，緩慢淋洗離心管內壁，13000rpm離心5min，棄上清液，用濾紙吸干管壁上的液體，置室溫中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mlte緩沖液中，混合器混勻，于-20℃保存備用。

連接pgk1基因和d6d基因的引物為：

pgk1-bamhiprimer1：

5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)

pgk1-xhoiprimer2：

5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtagatgtcgcctattatt-3′

(xhoi)

d6d-xhoiprimer1：

5′-tctgctttcttcgctccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)

d6d-xhoiprimer2：

5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)。

工程菌與d6d基因片段的摩爾比要控制在1:3-10。

所述高產不飽和脂肪酸重組工程菌株用于作為外源親脂類分子、多肽或化合物的藥物引入的運載體。

所述高產不飽和脂肪酸重組工程菌株用于作為外源親脂類分子、多肽或化合物的功能性食品引入人體的運載體。

外源親脂多肽藥物可以是α-msh或者多肽h22lp。h22lp是實驗室前期篩選得到的廣譜趨化因子受體us28拮抗肽。us28作為人類巨細胞病毒(hcmv)編碼的4個七跨膜趨化因子受體之一，是一個廣譜的cc類炎癥趨化因子受體，在hcmv感染的細胞中對β趨化因子的結合和鈣流信號誘導起重要作用。我們通過對us28進行跨膜結構域和結合模擬位的預測，尋找出其n端與趨化因子激動的部位，合成相應部位的多肽，最終篩選出能阻斷us28與其對應的cc類趨化因子相互作用、具有更少免疫原性和更強活性以用來作為拮抗劑的小分子先導物h22lp，經前期實驗證明h22lp可以通過直接與病毒顆粒作用來達到抑制hcmv的效果。

本發明具有如下有益效果：成功構建了外源基因d6d表達載體ppgk1z-rd-d6d，實現外源d6d基因在粘紅酵母gm4菌株內的高效表達，經雙酶切鑒定，重組質粒上的目的片段插入方向正確；將重組質粒導入粘紅酵母中，經轉化菌株pcr鑒定，重組質粒成功導入粘紅酵母中并插入到粘紅酵母的基因組中，實現了d6d的穩定、長久表達；實時熒光定量pcr表明d6d的表達水平提高了2倍左右；經氣相色譜法分析，轉化菌株中的gla較野生菌株提高了3.3倍多。

附圖說明

圖1是粘紅酵母整合表達載體ppgk1z-rd-d6d的構建的技術路線圖；

圖2是菌落形態圖觀察照片；

圖3是pgk1(a)和d6d(b)基因的pcr擴增條帶圖；

圖4是粘紅酵母轉化菌株gm4-d6d的插入片段d6d的pcr檢測圖(其中1、2、3道為重組菌株，4、5、6道為空載體菌株)；

圖5是重組質粒ppgk1z-rd-d6d雙酶切鑒定圖(以ppgk1z-rd做對照，其中1道為ppgk1z-rd-d6d，2道為ppgk1z-rd)；

圖6是粘紅酵母d6d基因表達水平圖。

具體實施例

為了更好地闡述本發明內容，下面用若干較佳的具體實施例進行說明。但這些具體實施例只是為了說明本發明的內容，而不是對本發明內容進行限制。

2.1實驗材料與儀器說明

2.1.1菌種

粘紅酵母(rhodotorulaglutinis)gm4為經常規手段篩選并保存；

釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)2.1445購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(cgmmcc)；

刺孢小克銀漢霉(cunninghamellaechinulata)mian6；

大腸桿菌(escherichiacoli)dh5α。

2.1.2質粒

表達載體ppicz-rd，構建并保存。

2.1.3培養基及主要試劑

(1)ypd培養基(1l)：

酵母浸出物(yeastextract)10g

蛋白胨(peptone)20g

葡萄糖(dextrose)20g

蒸餾水1000ml

溶解后1×10⁵pa滅菌20min，使用固體培養基時另添加瓊脂20g(agar)。

(2)ypd-zeocin培養基(1l)：

ypd培養基另外加濃度為50μg/ml的zeocin。

(3)luria-bertani(lb)培養基(1l)：

胰蛋白陳(typtone)10g

酵母提取物(yeastextract)5g

nacl10g

將上述材料加蒸餾水950ml，用naoh溶液調節ph至7.0-7.2，加水至1l，1×10⁵pa滅菌20min，使用固體培養基時另添加瓊脂(agar)20g。

(4)lb-ampicillin培養基(g/l)：

lb培養基另外加濃度為100μg/ml的氨芐西林。

(5)低鹽lb-zeocin培養基：

胰蛋白陳(typtone)10g

酵母提取物(yeastextract)5g

nacl5g

將上述材料加蒸餾水950ml，用naoh溶液調節ph至7.0-7.2，加水至1l，1×10⁵pa滅菌20min，另外添加濃度為50μg/ml的zeocin，使用固體培養基時另添加瓊脂(agar)20g。

(6)potatodextroseagar(pda)培養基(g/l)：

土豆浸提液200g，葡萄糖20g，瓊脂(agar)20g，溶解后1×105pa滅菌20min，使用液體培養基時無需加瓊脂。

(7)stet緩沖液：

tris-hcl：

12.11gtris溶于60ml無菌水，濃鹽酸調ph值為8.0，

edta：

na2edta18.61g，溶于60ml無菌水，ph調節至8.0，

取tris-hcl溶液12.5ml，edta溶液25ml，trionx-10020g，8％的蔗糖溶液150ml充分混合并定容到250ml即得。

(8)te緩沖液：

10.0mmtris-hcl，1.0mmedta，ph調至7.5。

(9)10％sds(十二烷基硫酸鈉)：

10gsds溶于90ml去離子水，ph調至7.2。

(10)質粒提取液

溶液i：50mmol/l葡萄糖(dextrose)、10mmol/ledta、25mmol/ltris-hcl(ph8.0)，高壓滅菌，4℃保存；

溶液ii：0.2mol/lnaoh(來源于10mol/l的母液稀釋)、1％sds，現用現配；

溶液iii：kac29.4g、醋酸(aceticacid)11.5ml、ddh2o28.5ml，4℃保存；

(11)10xdnabuffer鏈接緩沖液配制

配制好的的緩沖液保存于-20℃。

(12)tricinesds-page電泳試劑

a.正極緩沖液(10x)：

稱取242.28gtris，溶解于750ml去無菌去離子水中，再用1.0mol/l的鹽酸將ph調至8.9，加水至1l。

b.負極正極緩沖液(10x)：

稱取121.14gtris，179.16gtricine，10gsds溶解于650ml去無菌去離子水中，加入去無菌去離子水中至終體積1l。

c.凝膠緩沖液(3x)：

稱取363.0gtris，3.0gsds，溶解于600ml，無菌離子水中，再用1.0mol/l的鹽酸將ph調至8.5，再加水稀釋至1000ml。

d.固定液：

用量筒量取500ml甲醇，100ml冰醋酸，量取0.1mol醋酸銨，加無菌去離子水定容到1000ml。

e.染色液：

稱量馬斯亮藍g-250200mg，溶解于100ml95％的乙醇中，加入200ml85％的磷酸，加水定容到1000ml，棉花過濾。

f.脫色液：

量取醋酸100ml，乙醇50ml，加無菌去離子水定容到1000ml，搖勻。

g.樣品緩沖液：

量取0.5mol/ltris-hcl(ph6.8)2ml，巰基乙醇1ml，無水甘油2ml，稱取sds0.4g，溴酚藍0.02g，ph值調節至7，加無菌去離子水配成20ml。

h.ab-3儲存液(49.5％t，3％c)：

稱取19.2g丙烯酰胺，0.6g甲叉雙丙烯酰胺，溶解定容止于40ml無菌去離子水，過濾。

i.ab-6儲存液(49.5％t，3％c)：

稱取18.6g丙烯酰胺，1.2g甲叉雙丙烯酰胺，溶解定容止于40ml無菌去離子水，過濾。

j.16％分離膠

k.10％夾層膠

l.4％濃縮膠

其它試劑：

2.1.4主要儀器

2.2.1目的基因的分離與擴增

2.2.1.1釀酒酵母pgk1基因的分離與擴增

1、分離：

(1)釀酒酵母接種于50ml/250mlypd液體培養基中，30℃，180rpm培養至od660達到3時離心(12000r/min，5min，4℃)，棄上清，收集菌體；

(2)無菌水沖洗菌體兩次，離心后用冷的無菌水重懸菌體，菌懸液轉移至含有液氮和1g礬土的研缽中研磨破碎菌體細胞；

(3)將破碎的菌體細胞轉移至5mldna提取緩沖液中(50mmtris,10mmmgcl2,50mmnacl，1％(wt/vol)sds，ph7.4)的離心管中；

(4)經過反復的苯酚/氯仿抽提以及乙醇沉淀步驟，釀酒酵母dna被分離出來。

2、pcr擴增：

根據pgk1基因序列，設計引物。

正向引物5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)

反向引物5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtag-3′(xhoi)

pcr反應體系為：

pcr反應條件：

取5μlpcr擴增產物待經2％瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.2.1.2刺孢小克銀漢霉d6d基因的分離與擴增

1、分離：

刺孢小克銀漢霉總rna的提取操作流程參考wan和zhang等人的方法[47]。

(1)刺孢小克銀漢霉在pda液體培養基中于28℃，240rpm/min生長3天，菌絲通過過濾收集，并用磷酸鹽緩沖液沖洗；

(2)加入液氮研磨后迅速轉入已加有適量trizol(invitrogen)的離心管中來提取總rna；

(3)用oligotexmrnaminikit(qiagen)從總rna中提取mrna。

2、pcr擴增：

根據已公布的刺孢小克銀漢霉d6d基因序列(genbankaccessionnumber：dq177498)，設計引物。

d6d引物：

正向引物5′-ccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)

反向引物5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)

3、反轉錄(rt)反應：

(1)每次rt反應中，按下表加入各組分：

(2)70℃放置5分鐘，然后迅速置于冰上5分鐘；

(3)順次加入如下組分：

(4)37℃反應1小時。

(5)75℃孵育15分鐘終止反應，保存于-20℃或直接用于下游實驗。

4、pcr反應：

pcr反應體系為：

pcr反應條件：

取5μlpcr擴增產物待經2％瓊脂糖凝膠電泳分析。

2.2.1.3凝膠電泳與pcr產物回收

1、凝膠電泳：

(1)制備2％瓊脂糖凝膠：稱取2g瓊脂糖，加入100ml1×tae電泳緩沖液，微波爐加熱，直至完全融化，加入1.5μl10mg/ml的eb，搖勻；

(2)將瓊脂糖凝膠液冷卻至70℃左右，倒入已放好的制膠槽內，冷卻直至成凝膠，將凝膠及膠槽取出，放置于電泳槽內，加入1xtae電泳緩沖液直至浸沒凝膠；

(3)把上樣緩沖液(溴酚藍)混合到dna樣品，用移液槍將樣品加入到凝膠板的小槽內；

(4)加樣后，立即通電進行電泳，電壓120v，當溴酚藍將至凝膠頂端時，停止電泳；

(5)取出凝膠，用含有0.5μg/ml的eb/1xtae溶液染色30min，再用蒸餾水清洗15min；

(6)在紫外燈下觀察，觀察到條帶后，采用凝膠成像系統拍照保存。

2、pcr產物回收：

使用紫外光顯影出目的dna條帶，用切片刀切割相應的瓊脂帶，置入離心管中；

(1)加入bindingbufferii(7～4μl/1mg瓊脂凝膠)，于60℃水浴搖勻，直至完全溶解；

(2)將溶解的瓊脂凝膠放進uniq-10柱子中5min,用收集管收集濾液，8000rpm常溫離心15min

(3)棄去收集的廢液，取下uniq-10柱，入600μlwashsolution，8000rpm離心2min；

(4)重復步驟(3)；

(5)取出uniq-10柱放于新的離心管中，在柱子膜中央加入40μlelutionbuffer，50℃中放置5min；

(6)室溫下12000rpm離心1min，液體即為回收dna，-20℃凍存備用。

2.2.2表達外源d6d整合載體ppgk1z-rd-d6d的構建

2.2.2.1整合載體ppgk1z-rd-d6d的構建路線圖

利用同源重組原理設計d6d基因整合表達載體，構建技術路線見圖1：

2.2.2.2表達載體ppgk1z-rd-me的抽提

ppgk1z-rd質粒為本實驗室構建并保存的，按照以下步驟抽提質粒：

(1)將含有ppgk1z-rd質粒的大腸桿菌dh5α接種到裝有5mllb-amp培養基中，于37℃下250rpm振蕩培養過夜；

(2)吸取1.5ml過夜菌液于離心管中，4℃下12000rpm離心1分鐘，棄上清；

(3)用濾紙吸干離心管中的液體培養基，將菌體沉淀懸浮于200μlstet緩沖液中，用渦旋混合器充分混勻；

(4)加入4ml新配制的溶菌酶溶液，混勻后于室溫下靜置5分鐘；

(5)用漂子架住離心管，置于沸水浴中，精確記時45秒，取出后立刻12000rpm離心5分鐘；

(6)用無菌牙簽挑取離心管中的沉淀物棄去，離心管的上清液中加入8ml5％ctab，用混合器混勻后，13000rpm離心5分鐘，棄上清液，用濾紙吸干離心管中的液體；

(7)加入1.2mnacl300ml，充分溶解沉淀物，再加入750ml的預冷乙醇，充分混勻后，13000rpm離心15分鐘，棄上清液；

(8)取1ml70％冷乙醇，緩慢淋洗離心管內壁，13000rpm離心5min，棄上清液，用濾紙吸干管壁上的液體，置室溫中使核酸沉淀自然干燥5-10min；

(9)沉淀物溶于50mlte緩沖液中，混合器混勻，于-20℃保存備用。

2.2.2.3重疊pcr連接pgk1和d6d

為了實現外源基因d6d在強啟動子pgk1的帶動下高效表達，我們用overlappcr將強啟動子pgk1基因和d6d基因片段連接，以保證兩個基因片段之間無其他序列，從而避免因其他基因的引入糙造成目的基因表達異常。

用于pgk1和d6d的overlappcr引物如下：

pgk1-bamhiprimer1：

5′-cgcggatcctatttagattcctgacttcaactc-3′(bamhi)

pgk1-xhoiprimer2：

5′-tatccgctcgagtgttttatatttgttgaaaaagtagatgtcgcctattatt-3′(xhoi)

d6d-xhoiprimer1：

5′-tctgctttcttcgctccgctcgagatgtcagggcaaactcgag-3′(xhoi)d6d-xhoiprimer2：

5′-catgccatggatcatctaaaacatcttttgagag-3′(ncoi)

分別以pgk1-bamhiprimer1、pgk1-xhoiprimer2和d6d-xhoiprimer1、d6d-xhoiprimer2分別擴增pgk1和d6d，5個循環后回收pgk1和d6d片段，以回收的pgk1和d6d片段為共同模板，pgk1-bamhiprimer1和d6d-xhoiprimer2為上、下游引物進行overlappcr，得到pgk1-d6d片段。

overlappcr反應體系為：

pcr反應條件：

2.2.2.4pgk1-d6d片段與載體的雙酶切反應、連接

1、將overlappcr產物與ppgk1z-rd分別進行ncoi和bamhi雙酶切

質粒ppgk1z-rdncoi/bamhi雙酶切反應體系：

片段pgk1-d6dncoi/bamhi雙酶切反應體系：

酶切反應在37℃水浴反應3小時。

2、連接反應

酶切反應后,pgk1-d6d片段和載體ppgk1z-rd分別用回收試劑盒回收純化,然后用t4dna連接酶連接雙酶切后的載體ppgk1z-rd和pgk1-d6d片段,構建重組質粒ppgk1z-rd-d6d。

連接反應反應體系如下:

16℃水浴過夜反應,載體與外源dna片段的摩爾比要控制在1:3-10。

2.2.3重組質粒ppgk1z-rd-d6d電轉化粘紅酵母感受態細胞

2.2.3.1粘紅酵母感受態的制備

1、挑取酵母單菌落接種在5mlypd液體培養基，于30℃，250rpm振蕩培養過夜；

2、以1％接種量轉接至100mlypd液體培養基，于30℃，250rpm振蕩培養至細胞od600≈1.4；

3、菌液于4℃，3000g離心5min沉淀細胞，棄上清，用100ml無菌水重懸；

4、重復步驟三；

5、4℃，3000g離心2min沉淀細胞，棄上清，用20ml冰預冷的1m山梨醇重懸細胞；

6、4℃，3000g離心2min沉淀細胞，棄上清，用200μl1m山梨醇重懸細胞，用于轉化；

2.2.3.2質粒線性化

將約10μg重組質粒ppgk1z/rd/d6d用saci進行單酶切,酶的用量、酶切時的溫度,參照廠家說明書,完全酶切所用的時間要特別注意,既不能部分酶切,亦不能將質粒消化掉,這對電轉的效率有著十分重要的作用。

酶切體系如下所示:

2.2.3.3電轉化

將線性化好的重組質粒電轉化至粘紅酵母gm4。

1、將80μl己制備好的感受態細胞與20μl(約10μg)已線性化好的待轉化質粒dna混合,加入到0.2cm已預冷的電轉化杯中；

2、將裝有混合液的電轉化杯冰浴5min；

3、調整好電轉儀的參數:電壓1.5kv，電容25uf，電阻200ω，電擊持續時間約為5ms左右；

4、電擊結束后，立即向轉化杯中加入1ml預冷的1m山梨醇溶液,用槍輕微吸打混勻,然后將其轉至滅過菌的離心管中,30℃靜置lh，然后加入1ml新鮮的ypd培養基，30℃，200rpm搖1小時；

5、室溫下3000rpm，離心4min，用200μlddh2o重懸菌體；

6、將消液涂布于ypd平板(含50μlzeocin)，置于30℃培養箱中培養2-3d,直到長出單菌落為止。

2.2.3.4重組粘紅酵母的pcr檢測

1、挑取ypd抗性平板上長勢較好的單菌落轉接到ypd液體培養基中，30℃，250rpm振蕩培養至od600大于2；

2、取1ml菌液12000rpm離心2min，棄上清，加入100μlte緩沖液重懸菌體，水浴煮沸5-10min，立即置于-20℃冰箱凍存15min，室溫下靜置使菌懸液溶解，12000rpm離心5min，取上清液5μl為模板進行pcr檢測。

反應體系如下：

pcr反應條件

2.2.3.5質粒的酶切驗證

經菌液pcr初步驗證后，提取正確陽性克隆中的質粒，用ncoi和bamhii分別對重組質粒進行雙酶切鑒定，反應溫度為37℃。

酶切反應體系如下：

2.2.3.6轉化子穩定性檢測

將粘紅酵母轉化子接種于40mlypd液體培養基中，30℃，250rpm振蕩培養24h-36h。取1ml菌液用無菌水分別稀釋到10^-2,10^-3,10^-4，各取200μl不同稀釋度的稀釋液分別涂布于普通ypd平板和ypd-zeocin抗性平板，計算菌落數，分別記為總菌數和帶有整合質粒的菌落數。以1％接種量轉接至ypd液體培養基，30℃，250rpm振蕩培養，以24h為10世代，共培養50個世代。每隔10世代進行一次平板計數。

以下式計算質粒穩定性：

穩定性(％)＝帶有整合質粒的菌落數÷總菌數×100％

2.2.4轉化子d6d表達水平測定

用實時熒光定量pcr來檢測d6d在轉化菌株中的表達水平。野生菌株gm4和轉化菌株gm4-d6d分別在ypd培養基中發酵24h、48h、72h后收集，提取野生菌株和轉化菌株的總rna，方法參照前面2.2.1.3；然后經過反轉錄得到cdna，方法參照2.2.1.3。將合成后的cdna稀釋30倍，用于實時熒光定量pcr。

d6d的實時熒光定量pcr引物為：

f:5′-atgtcagggcaaactcgag-3′

r:5′-atcatctaaaacatcttttgagag-3′

以上述稀釋好的cdna為模版，按照熒光定量試劑盒sybrprimescripttmrt-pcrkit指導進行。

熒光定量pcr擴增的反應體系為：

pcr擴增條件為：

同時對real-timepcr產物進行sybr熔解曲線分析，每個試樣平行做4次反應，重復試驗2次，并參考pfaffl(2001)的方法進行數據分析。

2.2.5轉化菌株gm4-d6d的脂肪酸組成分析

1、菌株gm4-d6d總脂肪酸的提取

(1)收集在ypd液體培養基培養至穩定期的gm4-d6d菌株，離心后用蒸餾水清洗兩遍，5000g于4℃離心5min收集菌體后烘干至恒重，重量后放于研缽中研磨成粉末，用濾紙包好菌粉再次烘干至恒重；

(2)將濾紙包裹的菌粉放于抽提筒中，注入無水乙醚浸沒樣品，在70度左右的恒溫水浴中回流抽提8h左右，乙醚中無油為抽提結束，除去溶劑后的油脂待用；

(3)向提取的油脂加入1ml2％(wt/vol)硫酸-甲醇，60℃酯化2h；

(4)冷卻后加入1ml己烷，渦旋10min萃取脂肪酸甲酯；

(5)取上述萃取了脂肪酸甲酯的己烷800μl加入到玻璃瓶中進行gc分析。

2、gc分析

用bruker450-gc儀器配氫火焰離子化(fid)檢測器和毛細管色譜柱hp-innowax(30m×0.25mm)。柱溫升溫程序為：150℃(1min)，10min升至230℃，并在230℃保持2min，分流比為10:1，對照脂肪酸甲酯標準品的保留時間，對不同脂肪酸進行定性定量分析。

結果證明

2.3.1粘紅酵母的菌落形態

粘紅酵母gm4在孟加拉平板上生長3天后，其形態如圖2所示。菌落平均直徑在3～5mm，顏色為紅色或橘紅色，光澤，表面光滑且邊緣整齊，呈圓形凸起。

2.3.1pcr擴增檢測目的片段

通過設計特定引物對摸底基因pgk1和d6d進行pcr擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳分析，圖3中(a)顯示在800bp左右擴增出目的條帶，圖3中(b)顯示在13000bp左右擴增出目的條帶。

將重組質粒經過電轉化法導入粘紅酵母感受態細胞，對粘紅酵母的細胞裂解液進行pcr檢測，以目的基因d6d的特異性引物進行pcr擴增，通過瓊脂糖凝膠電泳分析，圖5顯示1、2、3通道(重組菌株)在13000bp左右擴增出目的條帶，陰性對照(空載體菌株，即野生粘紅酵母菌株gm4，沒有重組質粒轉化)則無條帶。說明重組質粒pgk1z-rd-d6d成功轉入粘紅酵母并插入到粘紅酵母基因組中。

重組菌gm4-d6d經過培養后，提取質粒，經過ecori和hindiii雙酶切后電泳成像，結果如圖4，可看到在2100bp和3100bp左右有條帶(通道1)，酶切后的片段大小與所插入的目的基因片段大小相符，說明重組質粒上的目的基因片段的插入方向正確。

2.3.2重組質粒穩定性檢測

為了檢測重組質粒ppgk1z-rd-d6d的遺傳穩定性，我們對轉化菌株在非選擇壓力下搖瓶培養60世代，沾取菌液于zeocine抗性平板上涂布、培養，計算菌落數。結果如表2-1所示，顯示轉化的粘紅酵母菌株在連續培養60世代后，穩定性仍然可以達到99.31％，表明在非選擇壓力下，粘紅酵母中的質粒具有良好的遺傳穩定性。

表2-1重組質粒的穩定性檢測

2.3.3轉化粘紅酵母菌株d6d的表達分析

實時熒光定量pcr分析d6d基因轉錄水平的結果見圖6，轉化菌株的d6d表達水平為野生菌株的2倍左右，野生菌株d6d轉錄水平在培養72小時后降到較低水平，而轉化菌株在其生長和γ-亞麻酸表達階段，其d6d的轉錄水平一直都高于野生菌株。d6d的高轉錄水平可以可以為γ-亞麻酸的和合成提供所需的足夠的酶，從而使γ-亞麻酸的合成量維持在較高的水平。

2.3.4γ-亞麻酸的積累研究

為了過表達d6d基因的粘紅酵母轉化菌株是否會產生較高水平的gla，實驗過程中對其脂肪酸成分進行了測定及分析，發現轉化菌株的gla含量顯著增高，由原來的3.12％提高到10.36％，同時gla合成的底物亞油酸的含量明顯降低，由此可以看出，與野生菌株相比，轉化菌株可以積累更多的gla。

表2-2轉化菌株和野生菌株的脂肪酸組成

本發明中，δ6-脂肪酸去飽和酶是合成長鏈多不飽和脂肪酸的限速酶，分別在n-3途徑中催化ala脫氫生成sda和n-6途徑中的油酸(la)脫氫生成gla。在γ-亞麻酸的生物合成過程中，△6-脂肪酸去飽和酶將la的第六位碳原子脫氫轉化成gla。經過研究者們不斷努力，已經有不少gla代謝關鍵酶的編碼基因被克隆并且實現功能驗證，有的基因還被利用到脂肪酸代謝途徑修飾中，并取得理想效果。如laoteng等成功分離mucorrouxii中的δ6-脂肪酸去飽和酶，發現其于植物的δ6-脂肪酸去飽和酶有高度的相似性，并使其在釀酒酵母中成功得以表達；helu等人發現在豆豉的發酵過程中會有大量的gla產生，因此分離出高產gla的根霉菌，并從中克隆得到δ6-脫飽和酶基因，將其表達于釀酒酵母中可導致gla的積累；王萍等人將刺孢小克銀漢霉菌中的δ6-脂肪酸去飽和酶表達于橘林油脂酵母中，使其gla的含量占總脂肪酸的1.2％。而本實驗中，經過脂肪酸分析，發現轉化菌株中的la明顯低于野生菌株，這也可以從側面反應出la經d6d催化進一步合成了gla，從而使轉化菌株中la的含量降低，gla的含量增多。

粘紅酵母是一株高產油脂的穩定菌株，常備用來生產微生物油脂和不飽和脂肪酸、類胡蘿卜素等。本實驗室前期篩選到一株產脂能力較強的粘紅酵母，其脂含量可以高達22.54％。在本實驗中，我們利用了本實驗室前期的粘紅酵母表達質粒構建工作，成功構建整合表達載體ppgk1z-rd-d6d，該載體上含有粘紅酵母的兩個rdna片段以及釀酒酵母的強啟動子pgk1，以rdna為整合位點實現目的基因的穩定高拷貝表達，從而將外源刺孢小克銀漢霉菌的d6d基因整合到粘紅酵母的染色體上，使其能夠穩定、高效表達，結果顯示傳代60代后，質粒仍能穩定存在于轉化株內，并且粘紅酵母轉化菌株的d6d表達水平明顯高于野生菌株，其gla的產量也明顯提高。

總的來說，本發明成功構建了外源基因d6d表達載體ppgk1z-rd-d6d，經雙酶切鑒定，重組質粒上的目的片段插入方向正確；將重組質粒導入粘紅酵母中，經轉化菌株pcr鑒定，重組質粒成功導入粘紅酵母中并插入到粘紅酵母的基因組中，實現了d6d的穩定、長久表達；實時熒光定量pcr表明d6d的表達水平提高了2倍左右；經氣相色譜法分析，轉化菌株中的gla較野生菌株提高了3.3倍多。

上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。