一種藤黃微球菌株及其用途的制作方法

本發明屬于微生物學技術領域，具體來說涉及一種藤黃微球菌，同時還涉及該菌株在解離釋放高硫煤矸石中磷方面的用途。

背景技術：

以煤炭為主要能源的國家，大多煤炭資源豐富、品種齊全、分布廣泛，煤炭對經濟的發展起到舉足輕重的作用。在煤炭開采和加工中，會產生20-25%的煤矸石，目前僅中國廢棄的煤矸石就有數十億噸。根據煤中含量硫的高低，可將煤分為低硫煤和高硫煤，硫含量在煤炭中的變化的幅度很大，最高為8%，最低為0.12%。煤矸石的暴露堆放，經雨水沖淋后，部分有害物質被溶解，并隨雨水流進土壤、地表水體或地下水體，造成其嚴重的污染。被污染的地表水體中的水質會逐漸酸化，當用來養殖或澆灌植物時，會對畜牧業和植被造成不可逆的損害，且破壞水生生態環境。當淋溶水隨雨水流進土壤時，打破了土壤中重金屬的平衡，也破壞了土壤的養分，并影響土壤中微生物的代謝活動，且這些有害物質的存在，不僅阻礙了植物根系的發育和生長，還會在植物有機體內積蓄，通過食物鏈危害人體健康。

煤矸石中含有很多豐富的營養元素，有很多事植物生長所必需的。礦物中有一些微生物可以分解礦物，從而解離出其中的元素，由于這些細菌來源于大自然，本身對環境無害，且分解過程和分解產物無害，對環境無污染，是綠色環保的。用微生物細菌分解煤矸石，解離出其中的有效成份，開發煤矸石的新用途，是煤矸石資源化應用的重要途徑。

技術實現要素：

本發明的目的在于克服上述缺點而提供的一株能高效分解高硫煤矸石釋放磷的藤黃微球菌。

本發明的另一目的在于提供該藤黃微球菌在解離釋放高硫煤矸石中磷方面的用途。

本發明的一種藤黃微球菌(micrococcusluteus)gzu-mi01，其形態特征：菌種在lb培養基上的菌落外觀形態：金黃色，中凹臺狀圓形，不透明，邊緣整齊，表面光滑濕潤，有光澤，菌落大小約為2mm。該菌為革蘭氏陽性四聯球菌。

該菌株菌于2017年03月16日保藏于中國典型培養物保藏中心(cctcc)，保藏號為：cctccno：m2017126，名稱：藤黃微球菌gzu-mi01(micrococcusluteusgzu-mi01)。

本發明的藤黃微球菌gzu-mi01的分離，包括以下步驟：

1.分離篩選

1)初篩

采集煤矸石山上的礦樣，采用稀釋法，而后接種于無機磷固體培養基平板，待長出之后，通過首先觀察菌落外觀形態，再進行平板劃線分離提純法，最后進行革蘭氏染色來初篩菌株。

2)復篩

活化初篩得到的菌株并進行培養，在一定條件下，進行解離高硫煤矸石試驗，通過測定解離后煤矸石中的有效磷含量，從而篩選出解磷效果好的菌株。

2.菌株的培養

難溶性無機磷液體培養基：葡萄糖10g，(nh4)so40.5g，nacl0.3g，kcl0.3，mgso4·7h2o0.3g，feso4·7h2o0.03g，mnso4·h2o0.03g，ca3(po4)210g，蒸餾水1000ml，ph=7.0-7.2。

難溶性無機磷固體培養基：在難溶性無機磷液體培養基中加瓊脂15g-20g。

lb液體培養基：蛋白胨5g、氯化鈉5g、牛肉膏1g、酵母膏2g、ph=7.4，蒸餾水1l。

lb固體培養基：在液體lb液體培養基中加瓊脂15g-20g。

3.三種保種方式

1）將需要保存的菌株，劃線于lb固體培養基平板上或斜面試管中，30℃培養18-24h，置于4℃冰箱中，保存一個月。

2）將在平板上已長好的菌株用滅菌的20%的甘油液體培養基沖洗，而后保存于-20℃的冰箱中，可保存一年。

3）將在平板上已生長良好的菌株，加入30%的脫脂奶，混勻后傾倒入無菌安瓿管中，用無菌脫脂棉塞住管口，放入-20℃冰箱預凍3-4h，再抽真空，熔封管口，放入-80℃的冰箱中保存，該方法可長期保存。

4.gzu-mi01菌株的生長曲線

在適宜的培養條件下，細菌的生長繁殖將經歷延遲期，對數期，穩定期和衰亡期。采用分光光度法測定細菌的生長曲線，以培養時間為橫坐標，以菌體生長速率或菌數的對數為縱坐標繪制生長曲線。通過測定生長曲線，可以得知細菌在不同時間段的生長情況。

5.gzu-mi01菌株的分子生物學鑒定

通過對菌株進行16srrna克隆，然后測序，再將該序列與ncbi細菌庫進行比對，找出與它同源性最近的屬，并通過一系列生化實驗，最終確定該株菌的種。

本發明的另一目的在于提供該藤黃微球菌在解離釋放高硫煤矸石中磷方面的用途。

本發明與現有技術相比,具有明顯的有益效果,從以上技術方案可知:從廢棄的煤矸石樣品中分離，篩選，提純，獲得高效分解煤矸石中磷的菌株，本發明具有很好的應用前景。用細菌處理廢棄的煤矸石，是一種平和的、綠色化工藝，能有效地緩解煤矸石對環境帶來的危害，還可以讓煤矸石變廢為寶，充分利用其中的有效資源。如果將煤矸石制備成復合肥料施于土壤，不僅可以緩解土壤中缺磷的問題，而且還可以避免使用化肥帶來的環境問題，比如土壤板結。與目前應用化學方法處理煤矸石相比，對環境更友好。

附圖說明

圖1.gzu-mi01菌株生長曲線

圖2.gzu-mi01菌株菌落外觀圖

圖3.gzu-mi01菌體形態圖

圖4.pcr擴增反應體系和擴增反應條件

圖5.gzu-mi01菌株基于部分16srrna基因序列建立的系統進化樹

圖6.幾種細菌高硫煤矸石解離結果

具體實施方式

藤黃微球菌gzu-mi01的分離，包括以下步驟：

1.功能菌株gzu-mi01菌株的分離與篩選

1）樣品采集

（1）樣品采自于某含硫煤矸石山上已風化煤矸石，然后將采集的樣品裝入塑料樣品采集袋中。

（2）將采集的樣品破碎。

（3）篩分，收集過100目的樣品。

（4）將樣品放入4℃的冰箱備用。

2）功能菌株的篩選

（1）準確稱取1g樣品于滅菌的250ml的錐形瓶中，加入99ml無菌水。

（2）然后在170r/min，37℃左右的搖床中振蕩30min。

（3）對照組是加入100ml無菌水于250ml的錐形瓶中。

（4）半個小時以后，取上清液逐級稀釋至10^-3，10^-4，10^-5，10^-6，10^-7。

（5）每種濃度分別取100ul涂布于3個無機磷固體培養基上，空白為涂布無菌水的平板。

（6）將平板放于30℃左右的恒溫培養箱中3-4天。

（7）將外觀特征不同的單菌落劃線接種于無機磷固體培養上。

（8）待長出后，通過初步外觀形態觀察以及顯微形態觀察，觀察菌株是否純化，沒有純化則多進行幾次，直到成為單一菌株，同時區別出不同的菌株。

（9）將純化的菌株，進行革蘭氏染色。

（10）對純化的初篩的細菌進行培養，在將其處理高硫煤矸石，通過測定其中的有效磷含量，含量越高則細菌的分解效果越好，從而篩選出解磷效果好的菌株。

2.功能菌株的生長曲線的繪制

1）種子液的制備。取該菌株一接種環接種于lb液體培養基中，在30℃條件下，培養至對數期。

2）接種。取上述種子液的10ml接種于裝有200ml的液體lb培養基中，混勻后分別取5ml混合液分別裝于上有標記的18支無菌試管中。

3）培養。將已接種的試管置37℃，170r/min的搖床中培養，分別培養相應的時間取出。

4）測量。用未接種的lb液體培養基做空白，在600nm波長下與待測樣一起進行光電比濁。

測定結果如圖1，從圖中可知，0-10h為延滯期，10-28h為對數期，28h-38h為穩定期，38h以后為衰亡期。

3.功能菌株的鑒定

1）菌落外觀形態

如圖2，從圖中可知該菌株在lb固體培養基上呈現金黃色，中凹臺狀圓形，不透明，邊緣整齊，表面光滑濕潤，有光澤，菌落大小約為2mm。

2）革蘭氏染色，菌體顯微形態

如圖3，從圖中可知該菌株為革蘭氏陽性四聯球菌。

3）菌株鑒定

（1）細菌dna的提取

挑取純化的菌株的單菌落至裝有lb液體培養基的錐形瓶中進行培養，得到純菌種發酵液后，以細菌基因組提取試劑盒(離心柱型，天根生化科技北京有限公司)提取dna，以其作為模版進行聚合酶鏈式反應(polymerasechainreaction,pcr)，使用taqdna聚合物擴增16srrna，用2f(5′-agagtttgatcctggctcaggatga-3′)，1492r(5′-tacggctacct

tgttacgacttagc-3′)的通用引物進行擴增，pcr擴增反應體系和擴增反應條件如圖4所示。

以1×tbe緩沖液配制1.0%瓊脂糖凝膠，加入40μlpcr擴增產物，加8μl2000bpdnamarker，在電壓110v，電流70ma，電泳45min，觀察凝膠成像結果。

（2）同源性比對

將聚合酶鏈式反應擴增產物經凝膠回收試劑盒純化，送交測序公司(上海立菲生物技術有限公司)測序，將測得的序列在ncbi(美國國立生物技術信息中心)上利用standardnucleotideblast進行比對，并利用clustalw、mega5.05等軟件基于鄰接法(neighborjoiningmethod)進行系統發育分析，構建系統發育樹（圖5），以獲得菌種的分類信息。從圖中可知，gzu-mi01的細菌與micrococcussp.japan-tut1210(ab188213.1)聚在同一個分支上，序列同源性達99%，gzu-mi01鑒定為微球菌屬(micrococcussp.)。

（3）生理生化實驗

通過一系列生化實驗，參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》（第8版）和《常見細菌系統鑒定手冊》（東秀珠等，1999），經鑒定該菌株為藤黃微球菌。

4.菌株對高硫煤矸石的解離能力的測定

采用同一來源高硫煤矸石，作gzu-mi01菌株與兩株傳統菌株—巨大芽孢桿菌和硅酸鹽細菌對比解離試驗，比較它們的解磷效果。首先在影響煤矸石解離的四個主要因素：粒徑大小，體系ph值，解菌量和體系的培養時間，作單因素試驗，分別尋找最佳條件，再通過設計正交實驗尋找gzu-mi01、巨大芽孢桿菌、硅酸鹽細菌在最佳解離煤矸石條件，并比較對高硫煤矸石的解離效果，結果如圖6。

從圖6中可以看出，gzu-mi01解離高硫煤矸石的效果明顯于巨大芽孢桿菌和硅酸鹽細菌。

序列表

<110>貴州大學

<120>一種可以解離釋放高硫煤矸石中磷的菌株

<130>1

<160>1

<170>patentlnversion3.3

<210>1

<211>1400

<212>dna

<213>藤黃微球菌（micrococcusluteus）

<400>1

catgcaagtcgaacgatgaagcccagcttgctgggtggattagtggcgaacgggtgagta60

acacgtgagtaacctgcccttaactctgggataagcctgggaaactgggtctaataccgg120

ataggagcgccgaccgcatggtgggtgttggaaagatttatcggttttggatggactcgc180

ggcctatcagcttgttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgacgggtagccggcctg240

agagggtgaccggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcag300

tggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacgg360

ccttcgggttgtaaacctctttcagtagggaagaagcgaaagtgacggtacctgcagaag420

aagcaccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttatccg480

gaattattgggcgtaaagagctcgtaggcggtttgtcgcgtctgtcgtgaaagtccgggg540

cttaaccccggatctgcggtgggtacgggcagactagagtgcagtaggggagactggaat600

tcctggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccgatggcgaaggcaggtc660

tctgggctgtaactgacgctgaggagcgaaagcatggggagcgaacaggattagataccc720

tggtagtccatgccgtaaacgttgggcactaggtgtggggaccattccacggtttccgcg780

ccgcagctaacgcattaagtgccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaa840

ggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgcggattaattcgatgcaacgcgaa900

gaaccttaccaaggcttgacatgttctcgatcgccgtagagatacggtttcccctttggg960

gcgggttcacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagt1020

cccgcaacgagcgcaaccctcgttccatgttgccagcacgtaatggtggggactcatggg1080

agactgccggggtcaactcggaggaaggtgaggacgacgtcaaatcatcatgccccttat1140

gtcttgggcttcacgcatgctacaatggccggtacaatgggttgcgatactgtgaggtgg1200

agctaatcccaaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaag1260

tcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgt1320

acacaccgcccgtcaagtcacgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcctaacccttg1380

tggggagccgtcgaaggtga