一種從富硒大豆中富集高硒蛋白組分的方法與流程

本發明涉及大豆蛋白提取技術領域，具體涉及一種從富硒大豆中富集高硒蛋白組分的方法。

背景技術：

1998年，中國正式實施“國家大豆行動計劃”，積極推動大豆產業的發展。大豆營養豐富，特別是蛋白質中氨基酸組成經fao/who氨基酸評分與動物蛋白相當，按沉降系數可將大豆蛋白分為2s、7s、11s、15s，其在大豆蛋白中所占比例分別為8％、35％、52％、5％，即7s、11s兩種蛋白占比之和接近90％。目前，大豆已成為世界各國的重要食品和發展畜牧業的重要蛋白質資源。因此，對大豆進行合理科學的開發利用具有重要意義。富硒大豆是指大豆中硒含量高于0.02-0.3mg/kg的大豆。1973年，世界衛生組織(who)和國際營養組織確認硒是人和動物體內必需的微量元素之一。大量研究表明很多種疾病都與硒缺乏密切相關，現已確認與硒缺乏相關的疾病達40余種，其中甚至包括癌癥、sars和艾滋病。后續又有諸多文獻報道硒具有提高機體抵御氧化損傷能力、提高機體免疫力、預防腫瘤及降低癌癥發病率等功效。然而，硒資源的分布卻嚴重地不平衡。在中國的1094個縣市中，土壤硒含量達到國際公布正常臨界值(0.1mg/kg)的縣只有1/3。其中含量小于或等于0.02mg/kg的占29％，為嚴重缺硒地區。將大豆蛋白這一重要蛋白資源與硒結合，在增加了大豆產業附加值，同時也有助于解決硒資源分布不平衡的問題。

已有文獻報道大豆中蛋白的分離方法，例如thanh采用tris-hcl緩沖液提取大豆中的11s和7s蛋白；wolf、robertsandbriggs、eldridgeandwolf、koshiyama也先后嘗試不同方法提取大豆蛋白，但他們均未對富硒大豆蛋白提取進行研究，并且關于大豆蛋白中硒提取率的研究尚未有人報道。

技術實現要素：

為了解決上述現有技術存在的問題，本發明提供了一種從富硒大豆中富集高硒蛋白組分的方法，該方法簡單易操作，且可有效地富集高硒蛋白組分，適合于工業化生產。

實現本發明上述目的所采用的技術方案為：

一種從富硒大豆中富集高硒蛋白組分的方法，包括如下步驟：

1、富硒大豆的脫脂：

將干燥的富硒大豆籽粒粉碎，得到富硒大豆粉，按照液料比為1g:20-30ml的比例，將石油醚加入富硒大豆粉中，室溫下密封攪拌浸提脫脂2-4h，脫脂結束后靜置，待沉淀完全后，分離，將所得的沉淀干燥去除石油醚，得到脫脂豆粉；

2、去除脫脂豆粉中的非蛋白組分：

按照料液比為1g:25-35ml的比例，將脫脂豆粉加入0.01-0.05mol/l磷酸氫二鈉溶液中，室溫下攪拌浸提45-90min，浸提結束后，離心分離，取上清液a，即為大豆蛋白溶液；

3、提取11s大豆球蛋白：

向大豆蛋白溶液中加入nacl，使nacl的終濃度為45-55mmol/l，用0.5-1.5mol/l的鹽酸溶液調節ph至6-6.5后，離心分離，得沉淀a和上清液b，沉淀a即為11s大豆球蛋白；

4、去除11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白質組分：

將步驟3所得的上清液b用0.5-1.5momol/l的鹽酸溶液調節ph至5-5.5后，離心分離，得沉淀b和上清液c，沉淀b即為11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白質組分；

5、提取7s大豆球蛋白：

將步驟4所得的上清液c用0.5-1.5momol/l的鹽酸溶液調節ph至4.5-5后，離心分離，得沉淀c，沉淀c即為7s大豆球蛋白。

進一步，將步驟1分離所得的上清液回收石油醚進行循環利用。

進一步，離心分離時離心轉速3000-3500r/min，離心時間為10min。

進一步，步驟3中，加入nacl，使nacl的終濃度為50mmol/l。

進一步，鹽酸溶液的濃度為1mol/l。

進一步，步驟3中，用鹽酸溶液調節ph至6.4。

進一步，步驟4中，將步驟3所得的上清液b用鹽酸溶液調節ph至5.25.

進一步，步驟5中，將步驟4所得的上清液c用鹽酸溶液調節ph至4.8。

與現有技術相比，本發明的優點與有益效果在于：

將富硒大豆進行脫脂處理后，進行以下兩個處理：①在普通大豆蛋白提取方法的基礎上，通過加入nacl，利用鹽溶作用，使7s大豆球蛋白增溶，減少對11s大豆球蛋白的干擾，從而使11s大豆球蛋白得到有效富集；②通過調整ph至5.25，以除去11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白質組分(這部分蛋白是以2s大豆球蛋白和15s大豆球蛋白為主的混合物)，從而使后續的7s大豆球蛋白富集效率得到提升。試驗表明，此種方法得到的11s、7s大豆球蛋白單位質量硒含量分別是脫脂豆粉的3.16倍和2.47倍。

附圖說明

圖1為不同硒含量的富硒大豆中提取得到的11s、7s大豆球蛋白的sds-page凝膠電泳圖譜。

1泳道為富硒大豆蛋白；2-5泳道分別為1#、2#、3#、4#富硒大豆蛋白中提取得到的11s大豆球蛋白組分；6-9泳道分別為1#、2#、3#、4#富硒大豆蛋白中提取得到的7s大豆球蛋白組分

圖2：不同硒含量的富硒大豆提取得到的大豆蛋白的sds-page凝膠電泳圖譜。

1泳道為普通大豆蛋白；2-5泳道分別為1#、2#、3#、4#富硒大豆中提取所得大豆蛋白。

具體實施方式

下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。

實施例1

1、富硒大豆的脫脂：

將干燥的1#富硒大豆(硒含量為3.25±0.09mg/kg)籽粒用粉碎機磨碎至80目，得到富硒大豆粉，稱取50g富硒大豆粉，加入1500ml石油醚中，保鮮膜封口后，置于磁力攪拌器上，室溫下(25℃)攪拌浸提脫脂2h，脫脂結束后靜置，待沉淀完全后，分離，將所得的上清液回收石油醚用于循環利用，將所得的沉淀在通風櫥中鋪開以揮干石油醚，24h后收集，得到脫脂豆粉，標記為1#脫脂豆粉；

2、去除脫脂豆粉中的非蛋白組分：

稱取30g脫脂豆粉，加入1000ml0.02mol/l的磷酸氫二鈉溶液(ph約為8.5)中，室溫攪拌浸提45min，浸提結束后，以3000r/min的轉速離心10min，取上清液a，即為大豆蛋白溶液，標記1#大豆蛋白溶液；

3、提取11s大豆球蛋白：

向大豆蛋白溶液中加入nacl，使nacl的終濃度為50mmol/l，用1mol/l的鹽酸溶液調節ph至6.4后，以3000r/min的轉速離心10min，分離得沉淀a和上清液b，沉淀a即為11s大豆球蛋白，標記為1#11s大豆球蛋白，凍干備用；

4、去除11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白質組分：

將步驟3所得的上清液b用1mol/l的鹽酸溶液調節ph至5.25后，以3000r/min的轉速離心10min，分離得沉淀b和上清液c，沉淀b即為11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白以外的蛋白質組分；

5、提取7s大豆球蛋白：

將步驟4所得的上清液c用1mol/l的鹽酸溶液調節ph至4.8后，以3500r/min的轉速離心10min，分離得沉淀c，沉淀c即為7s大豆球蛋白，標記為1#7s大豆球蛋白，凍干備用。

實施例2-4

實施例2-4的操作同實施例1，唯一不同的是原料富硒大豆不同，分別為2#富硒大豆、3#富硒大豆和4#富硒大豆，2#富硒大豆、3#富硒大豆和4#富硒大豆的硒含量分別為4.98±0.08mg/kg、7.34±0.04mg/kg、9.87±0.12mg/kg。

一、富硒大豆蛋白組分中蛋白含量測定和純度檢測

1、采用凱氏定氮法(gb/t5009.5-2003)測定各蛋白組分的蛋白含量：

經檢測，四種不同硒含量的富硒大豆脫脂得到的脫脂豆粉中蛋白平均含量為43.63±0.1％，提取出的11s和7s大豆球蛋白組分的蛋白平均含量分別為94.03±0.18％和93.73±0.26％，蛋白純度得到了有效提高。

2、采用sds-page法檢測11s和7s大豆球蛋白純度及普通大豆和富硒大豆中其蛋白成分的變化。

檢測方法具體如下：

2.1、配制試劑：

稱取18.17gtris(三羥甲基氨基甲烷)、0.4gsds(十二烷基磺酸鈉)溶于水，用1mol/lhcl溶液調ph至8.8，定容至100ml，為分離膠緩沖液；

稱取6.06gtris、0.4gsds溶于水，用1mol/lhcl溶液調ph至6.8，定容至100ml，得濃縮膠緩沖液；

稱取30gacr(丙烯酰胺)和0.8gbis(甲叉雙丙烯酰胺)，用蒸餾水溶解后定容至100ml，得acr/bis貯備液；

取4ml雙蒸水、1.0ml0.5mol/ltris-hcl(ph6.8)緩沖液、0.8ml甘油、1.6ml10wt％sds溶液、0.4ml巰基乙醇和0.2ml0.1wt％溴酚藍溶液，總體積8ml，混勻，作為樣品緩沖液，于4℃保存；

稱取3.03gtris、14.14ggly(甘氨酸)、1.0gsds溶于水，用hcl溶液調ph至8.3，定容至1000ml，得電極緩沖液；

稱取1g考馬斯亮藍r-250溶于250ml甲醇及100ml冰醋酸中，溶解后定容至1000ml，得染色液；

10wt％過硫酸銨溶液用時現配，采用10％(v/v)醋酸溶液脫色。

2.2、檢測過程：

將實施例1-4提取得到的1#11s大豆球蛋白、2#11s大豆球蛋白、3#11s大豆球蛋白和4#11s大豆球蛋白溶于樣品緩沖液中，配置1mg/ml的1#11s大豆球蛋白樣品液、2#11s大豆球蛋白樣品液、3#11s大豆球蛋白樣品液、4#11s大豆球蛋白樣品液。

將實施例1-4提取得到的1#7s大豆球蛋白、2#7s大豆球蛋白、3#7s大豆球蛋白和4#7s大豆球蛋白溶于樣品緩沖液中，配置1mg/ml的1#7s大豆球蛋白樣品液、2#7s大豆球蛋白樣品液、3#7s大豆球蛋白樣品液、4#7s大豆球蛋白樣品液。

取4ml分離膠緩沖液、6.7mlacr/bis貯備液、5.3mlh2o、0.8ml10wt％過硫酸銨溶液和0.008mltemed(四甲基乙二胺)，混勻，制得濃度為12.5％的分離膠，迅速沿長玻璃板將分離膠加入兩塊玻璃板之間，過程中不能出現氣泡，加到距短玻璃板上邊緣3cm處，立即覆蓋2-3mm水層，待分離膠與水之間形成清晰界面，即為聚合完畢。

取1.25ml濃縮膠緩沖液、0.75mlacr/bis貯備液、3mlh2o、0.015ml10wt％過硫酸銨溶液和0.005mltemed，混勻，制得濃縮膠，吸去分離膠上面的水分，將配置好的濃縮膠注入分離膠之上，立即插入點樣槽模板，待濃縮膠聚合好之后拔出模板，用微量注射器分別吸取5μl標準蛋白樣品液、25μl1#11s大豆球蛋白樣品液、25μl2#11s大豆球蛋白樣品液、25μl3#11s大豆球蛋白樣品液、25μl4#11s大豆球蛋白樣品液、25μl1#7s大豆球蛋白樣品液、25μl2#7s大豆球蛋白樣品液、25μl3#7s大豆球蛋白樣品液、25μl4#7s大豆球蛋白樣品液、25μl1#大豆蛋白溶液、25μl2#大豆蛋白溶液、25μl3#大豆蛋白溶液和25μl4#大豆蛋白溶液，從左至右依次點樣。

加樣完畢后，向兩槽注入上述配制好的電極緩沖液，接通電源，調節電流至15ma，當樣品緩沖液中的指示劑溴酚藍進入分離膠后，加大電流至30ma，電壓恒定在80-100v之間，約2h后，指示劑到達距前沿1-2cm時終止電泳。

取出凝膠后在水中浸泡10min，然后浸入染色液中染色，約45min后將凝膠移入脫色液中脫色，每隔0.5h換一次脫色液，待藍色基本脫掉再繼續放在脫色液中浸泡至蛋白條帶清晰為止，采用bandscan軟件分析蛋白條帶。

2.3、檢測結果：

結果如圖1和圖2所示，從圖1可以看出，四種不同硒含量的富硒大豆提取的11s大豆球蛋白的亞基分子量均在35kda以下，7s大豆球蛋白的亞基分子量在50kda以上。經bandscan軟件分析，四種不同硒含量的富硒大豆提取的11s大豆球蛋白、7s大豆球蛋白的平均純度分別為89.14％、91.20％，由此可見，本發明方法分離得到的11s大豆球蛋白和7s大豆球蛋白的純度很高。

從圖2可以看出，普通大豆和不同硒含量的富硒大豆的蛋白條帶基本一樣，由此可見，普通大豆和富硒大豆中其蛋白成分基本一致。

二、富硒大豆及其蛋白中硒含量測定

測定方法：

分別稱量0.5000g1#脫脂豆粉、2#脫脂豆粉、3#脫脂豆粉、4#脫脂豆粉、1#11s大豆球蛋白、2#11s大豆球蛋白、3#11s大豆球蛋白、4#11s大豆球蛋白、1#7s大豆球蛋白、2#7s大豆球蛋白、3#7s大豆球蛋白和4#7s大豆球蛋白于錐形瓶中，向各錐形瓶中分別加入10ml混合酸(v硝酸:v高氯酸＝9:1，硝酸濃度為65-68wt％，高氯酸濃度為70-72wt％)，冷消化12h后放置在電熱板上，在180下℃加熱消化，直至出現白煙，且消化液呈透明無色或微黃色，待消化液冷卻后，加入4ml6mol/lhcl溶液，再加水定容至50ml，將所得的溶液取5ml移入試管中，加入2.5mll0wt％鐵氰化鉀(k3[fe(cn)6])溶液和5ml6mol/lhcl溶液，混合均勻，用原子熒光光譜儀儀器進行檢測。

原子熒光光譜儀儀器參數及操作條件如下：原子化溫度800℃，分析線196.0nm，燈電流8ma，流速為1.2l/min，光譜通帶0.4nm，載氣為高純氮氣。

測定結果：

測定結果如表1所示：

表1不同硒含量富硒大豆提取的11s和7s大豆球蛋白組分的硒含量(mg/kg)

從表1可以看出，對于不同硒含量的富硒大豆，與脫脂豆粉相比，提取出的11s和7s大豆球蛋白組分中硒含量均得到了有效提高。