本發明屬于植物分子育種學領域，具體涉及一種野生亞麻種子總dna提取方法。
背景技術：
目前植物總dna提取方法有ctab法，sds法，高鹽低ph值法等。亞麻總dna提取常用方法為高鹽低ph法，該方法常以莖葉為提取原材料。由于野生亞麻種子發芽率低，人工條件育苗獲得幼莖需要5個月時間，如果提取原料為多年生野生種，那么獲得所需的提取材料會更加困難，提取工作也受時間的限制。因此利用種子提取dna的方法便可以打破這種限制。由于野生亞麻種皮上的果膠質遠大于莖葉，故而提取難度較莖葉大。故本專利在前人研究基礎之上，著重解決利用野生亞麻種子提取總dna，既達到高濃度、高純度、大量提取的目的，又能克服提取時間的限制，滿足分子生物學實驗的需要。
技術實現要素：
本發明目的是提供了一種野生亞麻種子總dna提取方法。
本發明通過以下技術方案實現：
一種野生亞麻種子總dna提取方法，包括如下步驟：
步驟1、用液氮將研缽和杵預冷，取0.25g野生亞麻種子置于研缽中，迅速研磨至粉末狀，之后向研缽中加入65℃的提取緩沖液10ml，在水浴鍋中繼續研磨至充分混勻，得到野生亞麻種子勻漿；
步驟2、將步驟1制得的野生亞麻種子勻漿用尼龍網兜過濾；
步驟3、將步驟2過濾后的濾液用1.5ml離心管分裝，每個離心管內濾液容積為0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同時輕輕搖動離心管，水浴后將離心管冷卻至室溫后，以轉速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；
步驟4、將步驟3得到的上清液加入0.33體積的5mol/l的醋酸鉀溶液，混勻后置于0℃冰浴保持30min，以轉速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；
步驟5、將步驟4得到的上清液加入0.6倍體積的預冷異丙醇，混勻后的溶液在-20℃條件下靜置2h得到的混合物，利用微提取器吸取懸浮物，使之與管底部果膠質分離，留懸浮物待用；
步驟6、將步驟5得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加50μl超純水混勻后在-20℃條件下靜置8～10h，得到的溶液中加人300μl超純水稀釋，稀釋后加5μlrna酶，混勻后置于水浴鍋中37℃水浴1h，得到溶液待用；
步驟7、將步驟6得到的溶液加入0.6倍體積的預冷異丙醇，混勻后在-20℃條件下靜置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取懸浮物，使之與管底部果膠質分離，留懸浮物待用；
步驟8、將步驟7得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加25～50μl超純水混勻后，得到野生亞麻種子總dna，置于-80℃保存；
步驟9、將步驟8得到的野生亞麻種子總dna利用瓊脂糖檢測條帶完整性及純度，分光光度計檢測濃度。
本發明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟1中所述的提取緩沖液的配方為每1000ml緩沖液中含有100mmol醋酸鈉、50mmol乙二胺四乙酸二鈉、500mmol氯化鈉、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸鈉。
本發明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟2中的尼龍網兜過濾用紗布過濾代替。尼龍網兜過濾可用紗布代替，但會影響產量，如果不要求大量提取，可以用紗布替代。
本發明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟3中的水浴鍋中放置浮漂。
本發明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟4中醋酸鉀溶液的ph值為4.8。
本發明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟5中混勻后的溶液在室溫下靜置8～10h后得到混合物。
本發明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟5中的混合物在室溫下以轉速10000r/min，離心10分鐘，得到沉淀物待用。步驟5中的混合物中沒有沉淀出現，則采用離心分離的方法得到沉淀物，用來代替微提取器吸取沉淀。
本發明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟7中的混合物在室溫下以轉速10000r/min，離心10分鐘，得到沉淀物待用。步驟7中的混合物中沒有沉淀出現，則采用離心分離的方法得到沉淀物，用來代替微提取器吸取沉淀。
本發明所述的野生亞麻種子總dna提取方法，經液氮研磨之后，再用緩沖液研磨，使dna充分溶于緩沖液中而不被破壞，有益效果是加大了dna的產率。而經過過濾的dna提取緩沖液在提取初期就先去掉一部分果膠質，直接降低了dna的粘稠度。本發明步驟簡單，實驗試劑無毒，提取量大，解決了無法獲得或者獲取莖葉材料困難的難題，打破dna提取在時間上限制，只要有種子且需要dna時，隨時可以提取。
附圖說明
附圖1為具體實施方式一野生亞麻種子總dna提取的電泳檢測對比圖。
具體實施方式
具體實施方式一：
一種野生亞麻種子總dna提取方法，包括如下步驟：
步驟1、用液氮將研缽和杵預冷，取0.25g野生亞麻種子置于研缽中，迅速研磨至粉末狀，之后向研缽中加入65℃的提取緩沖液10ml，在水浴鍋中繼續研磨至充分混勻，得到野生亞麻種子勻漿；
步驟2、將步驟1制得的野生亞麻種子勻漿用尼龍網兜過濾；
步驟3、將步驟2過濾后的濾液用1.5ml離心管分裝，每個離心管內濾液容積為0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同時輕輕搖動離心管，水浴后將離心管冷卻至室溫后，以轉速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；
步驟4、將步驟3得到的上清液加入0.33體積的5mol/l的醋酸鉀溶液，混勻后置于0℃冰浴保持30min，以轉速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；
步驟5、將步驟4得到的上清液加入0.6倍體積的預冷異丙醇，混勻后的溶液在-20℃條件下靜置2h得到的混合物，利用微提取器吸取懸浮物，使之與管底部果膠質分離，留懸浮物待用；
步驟6、將步驟5得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加50μl超純水混勻后在-20℃條件下靜置8h，得到的溶液中加人300μl超純水稀釋，稀釋后加5μlrna酶，混勻后置于水浴鍋中37℃水浴1h，得到溶液待用；
步驟7、將步驟6得到的溶液加入0.6倍體積的預冷異丙醇，混勻后在-20℃條件下靜置2h，得到的混合物，利用微提取器吸取懸浮物，使之與管底部果膠質分離，留懸浮物待用；
步驟8、將步驟7得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加25μl超純水混勻后，得到野生亞麻種子總dna，置于-80℃保存；
步驟9、將步驟8得到的野生亞麻種子總dna利用瓊脂糖檢測條帶完整性及純度，分光光度計檢測濃度。
本實施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟1中所述的提取緩沖液的配方為每1000ml緩沖液中含有100mmol醋酸鈉、50mmol乙二胺四乙酸二鈉、500mmol氯化鈉、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸鈉。
本實施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟3中的水浴鍋中放置浮漂。
本實施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟4中醋酸鉀溶液的ph值為4.8。
本實施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，附圖1為本實施方式野生亞麻種子總dna提取的電泳檢測對比圖，其中第1泳道為15000bp的dnamarker，第2、3、4泳道為本方法莖葉提取，第5、6、7、8為本方法種子提取，第9、10、11、泳道為3％ctab法。圖1電泳圖是dna提取液經過稀釋5倍之后上樣獲得的。從電泳圖上可以看出種子總dna的提取量最大，條帶清晰無雜質，提取dna長度位于maker之上，提取的dna較完整，rna添加量適合，無污染，達到分子生物學要求，莖葉的提取量較低，條帶比較模糊，未達到分子生物學要求。3％ctab法沒有檢測出條帶。
具體實施方式二：
一種野生亞麻種子總dna提取方法，包括如下步驟：
步驟1、用液氮將研缽和杵預冷，取0.25g野生亞麻種子置于研缽中，迅速研磨至粉末狀，之后向研缽中加入65℃的提取緩沖液10ml，在水浴鍋中繼續研磨至充分混勻，得到野生亞麻種子勻漿；
步驟2、將步驟1制得的野生亞麻種子勻漿用紗布過濾；
步驟3、將步驟2過濾后的濾液用1.5ml離心管分裝，每個離心管內濾液容積為0.6ml，65℃水浴10min，水浴的同時輕輕搖動離心管，水浴后將離心管冷卻至室溫后，以轉速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；
步驟4、將步驟3得到的上清液加入0.33體積的5mol/l的醋酸鉀溶液，混勻后置于0℃冰浴保持30min，以轉速10000r/min，離心10分鐘，離心后取上清液待用；
步驟5、將步驟4得到的上清液加入0.6倍體積的預冷異丙醇，混勻后的溶液在室溫下靜置2h后得到的混合物，在室溫下以轉速10000r/min，離心10分鐘，得到的沉淀物待用；
步驟6、將步驟5得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加50μl超純水混勻后在-20℃條件下靜置8h，得到的溶液中加人300μl超純水稀釋，稀釋后加5μlrna酶，混勻后置于水浴鍋中37℃水浴1h，得到溶液待用；
步驟7、將步驟6得到的溶液加入0.6倍體積的預冷異丙醇，混勻后在-20℃條件下靜置2h，得到的混合物，在室溫下以轉速10000r/min，離心10分鐘，得到的沉淀物待用；
步驟8、將步驟7得到的沉淀物用無水乙醇洗滌2次后，自然晾干后，加50μl超純水混勻后，得到野生亞麻種子總dna，置于-80℃保存；
步驟9、將步驟8得到的野生亞麻種子總dna利用瓊脂糖檢測條帶完整性及純度，分光光度計檢測濃度。
本實施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟1中所述的提取緩沖液的配方為每1000ml緩沖液中含有100mmol醋酸鈉、50mmol乙二胺四乙酸二鈉、500mmol氯化鈉、2％聚乙烯吡咯烷酮、1.4％十二烷基磺酸鈉。
本實施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟3中的水浴鍋中放置浮漂。
本實施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，步驟4中醋酸鉀溶液的ph值為4.8。
本實施方式所述的野生亞麻種子總dna提取方法，表1列舉了不同方法提取dna的分光光度計檢測結果。
表1不同方式提取dna分光光度計檢測結果對比表
從表1中明確看出，利用種子提取的dna濃度達到217ng/ul，濃度遠遠大于其他方法，該方法od260/od280為1.808，接近理論值1.80，表明提取的dna沒有蛋白質污染，滿足分子生物學的實驗需要。