禾谷孢囊線蟲Ha?63744蛋白、編碼基因及其應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域，涉及一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-63744蛋白、編碼基因及其應用。

背景技術：

小麥是我國三大重要糧食作物之一，在保障我國糧食安全方面具有舉足輕重的作用。2015年我國小麥播種面積和產量分別占全國糧食作物的14.51％和20.95％。禾谷孢囊線蟲(cerealcystnematodes，簡稱ccns)是植物內寄生線蟲，ccn在世界范圍內38個國家發生危害，主要危害小麥(t.aestivum),大麥(hordeumvulgare)，燕麥(avenasativa)及牧草等重要禾谷類作物。我國自從1991年首次在湖北被發現以來，在不到30年的時間內，已經在我國包括河南，河北，西藏，新疆等16個省市地區發現[pengdl,nicoljm,lih,hous,lih,chens,map,lih,andrileyit.currentknowledgeofcerealcystnematode(heteroderaavenae)onwheatinchina.in'cerealcystnematodes:status,researchandoutlook.'editeredbyitriley,jmnicolandaadababat.2009:29-34]。ccn在我國80％的小麥產區均有發生，涵蓋了我國主要小麥產區,尤以黃淮麥區危害最嚴重，危害面積達6000余萬畝，年產量損失在23％-50％以上，嚴重地塊減產達73％-89％，甚至毀種絕收，而且有不斷加速蔓延趨勢[pengdl,nicoljm,lih,hous,lih,chens,map,lih,andrileyit.currentknowledgeofcerealcystnematode(heteroderaavenae)onwheatinchina.in'cerealcystnematodes:status,researchandoutlook.'editeredbyitriley,jmnicolandaadababat.2009:29-34；彭德良,subbotins,moensm.小麥禾谷孢囊線蟲(heteroderaavenae)的核糖體基因(rdna)限制性片段長度多態性研究.植物病理學報.2003,33(4):323-329；趙洪海，楊遠永，彭德良，劉峰.小麥禾谷孢囊線蟲在山東省的分布新報道和發生特點淺析.青島農業大學學報.2011,28(4):17-22]。目前，對小麥禾谷孢囊線蟲致病機理仍不清楚，缺乏經濟有效的防治方法，雖然作物輪作及生防菌的應用具有一定的防治作用，但是不夠經濟有效，而化學殺蟲劑容易對土壤造成污染，引起環境問題。因此，針對我國小麥禾谷孢囊線蟲的嚴重危害，開展ccn內源靶標基因，應用于線蟲防控具有重要意義，并能夠深入解析ccn致病和成災機理，開發安全高效的防治方法，具有重要的理論價值和實際意義。

技術實現要素：

本發明提供一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-63744蛋白，該蛋白在線蟲食道腺表達，在禾谷孢囊線蟲的寄生后三齡時期、四齡幼蟲時期表達量較高。實驗表明該基因在禾谷孢囊線蟲寄生致病過程中發揮重要作用，可作為植物抗線蟲工程的靶標基因。

一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-63744蛋白，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

編碼禾谷孢囊線蟲的ha-63744蛋白的基因,其核苷酸序列如seqidno：2所示。

ha-63744基因特異的dsrna片段，其核苷酸序列如seqidno：3所示。

所述的禾谷孢囊線蟲ha-63744蛋白在線蟲防控中的應用。

所述應用，將權利要求3所述的dsrna片段取食到禾谷孢囊線蟲體內，抑制禾谷孢囊線蟲發育，從而防控禾谷孢囊線蟲侵染寄主。

禾谷孢囊線蟲的ha-63744蛋白，其序列如seqidno：1所示，編碼該蛋白的基因序列如seqidno：2所示。植物內寄生線蟲的食道腺由3個大的分泌細胞組成，兩個亞腹食道腺細胞，一個背食道腺細胞，能夠表達，編碼產生分泌蛋白，在線蟲侵入、建立并維持取食位點的過程中起重要作用。食道腺與食道腔相連，通過復雜的瓣膜閥門，控制分泌蛋白胞外分泌，通過口針釋放到植物體內。本發明提供的ha-63744基因，在線蟲食道腺表達，在禾谷孢囊線蟲的寄生后三齡時期、四齡幼蟲時期表達量較高。

含有該基因的表達載體或轉基因個體包括重組表達載體、干擾載體、重組病毒、dsrna、轉基因細胞系、轉基因植物或組織、重組菌。含有ha-63744的基因的重組表達載體包括雙元農桿菌載體，病毒載體，細菌表達載體及酵母表達載體等。含有ha-63744基因的載體構建過程中，可以單獨或者多個組合使用誘導型、增強型、組成型、組織特異型啟動子。載體可以包括抗生素或抗化學試劑的抗性篩選標記，也可以含有產生顏色變化的酶，比如gus，或者發光標記蛋白，例如紅色或綠色熒光蛋白，便于后續轉化子的篩選。構建的載體可以轉化細菌，真菌及單雙子葉植物，具體可以為大腸桿菌，酵母，煙草，擬南芥及小麥，大麥。

本發明保護ha-63744蛋白在抑制孢囊線蟲對植物的寄生與危害，和/或抑制孢囊線蟲對植物的致病性，和/或抑制孢囊線蟲發育中的應用。抑制ha-63744基因表達的物質具體可為以抑制ha-63744基因表達的干擾載體、病毒載體，以及rna。所述寄主植物具體可為小麥和大麥，例如小麥溫麥19，大麥goldenpromise。

利用dsrna處理沉默ha-63744基因后，小麥根部的禾谷孢囊線蟲數量明顯低于對照，表明該基因在禾谷孢囊線蟲寄生致病過程中發揮重要作用，可作為植物抗線蟲工程的靶標基因。本發明對于孢囊線蟲致病機理研究以及抗線蟲植物制備具有重大價值。

附圖說明

圖1為ha-63744基因pcr擴增結果，擴增片段大小為558bp。

圖2為ha-63744基因在禾谷孢囊線蟲2齡幼蟲中原位雜交分析。a：反義鏈雜交分析結果表明ha-63744基因由食道腺細胞分泌；b：正義鏈雜交分析結果為負對照。

圖3為通過rt-qpcr檢測ha-63744基因在5個齡期中的發育表達。相對表達分析的方法為2^-δδct法，內參基因為β-actin。侵染前2齡幼蟲(prej2)的表達量設定為100％。prej2:侵染前二齡幼蟲；j2,j3和j4:分別為2齡，3齡及4齡幼蟲；f:雌成蟲。

圖4為平均每各處理禾谷孢囊線蟲雌蟲數量的統計結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。本申請人的試驗材料均可以對公眾發放。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。

實施例1、ha-63744蛋白以及ha-63744基因的發現

1、收集線蟲幼蟲蟲體(約5000頭)，使用depc處理水洗2-3次，轉入1.5ml離心管，加入1mltrizol(invitrogen)，液氮中速凍30s，37℃水浴30s，重復凍融4-5次，然后在室溫下靜置5min，提取總rna，采用dna-free^tmdnaremovalkit試劑盒去除總rna中殘存的dna，反轉錄得到cdna。

2、以cdna為模板，采用上游引物hafull-f：5’-atgcgcgccatcctcttcct-3’；下游引物hafull-r1：5’-ctaatttgtcggttcattaatctg-3’進行pcr擴增。

上游引物hafull-f：5’-atgcgcgccatcctcttcct-3’；

下游引物hafull-r1：5’-ctaatttgtcggttcattaatctg-3’

擴增體系為10×pcrexbuffer(mg2+)，5μl；dntp(10mm)，4μl；正向引物(10mm)，反向引物(10mm)各1μl；extaq，0.5μl；cdna第一鏈模板，1μl；去離子水，35.5μl，總體積50μl。擴增程序94℃變性5min；接下來34個循環的94℃，30sec，57℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr產物采用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定(圖1)

3、將t載體與步驟2中的pcr擴增產物連接，然后轉化大腸桿菌dh5α，測序。見seqidno：2。測序結果表明，擴增產物中具有序列表的seqidno：2所示的開放閱讀框，編碼序列表的seqidno：1所示的蛋白質。將序列表的seqidno：1命名為ha-63744蛋白，將其編碼基因命名為ha-63744基因。

實施例2、ha-63744基因的原位雜交定位分析

以ha-63744基因克隆載體為模板通過常規pcr擴增靶標序列，以上游引物hah-f：5’-gatgcgcacaaaggagcaag-3’；下游引物hah-r：5’-tctactggtgcactgcttgg-3’，進行pcr反應，體系如下10×pcrexbuffer(mg²⁺)，2μl；dntp(10mm)，1μl；正向引物(10mm)，反向引物(10mm)各1μl；extaq，0.3μl；質粒模板，1μl；去離子水，14.2μl，總體積20μl。擴增程序94℃變性5min；接下來34個循環的94℃，30sec，60℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。pcr產物采用1％的瓊脂糖凝膠電泳分離純化。以不對稱pcr合成地高辛標記的正鏈探針和反鏈探針。以hah-f或hah-r為引物，以步驟1回收的目的片段為模板進行pcr擴增擴增，得到反義探針/正義探針。體系如下10×pcrexbuffer(mg²⁺)，2μl；地高辛標記的dntpmix(10mm)，1μl；正向引物(10mm)或反向引物(10mm)，2μl；extaq，0.5μl；pcr產物(上步驟獲得)，2μl；去離子水，12.5μl，總體積20μl。擴增程序94℃變性5min；接下來34個循環的94℃，30sec，60℃，30sec，72℃延伸1min；最后72℃延伸10min，4℃保存。按照說明書進行原位雜交。結果見圖2。結果顯示，反義探針有雜交信號，雜交信號位于亞腹食道腺。結果表明，ha-63744基因為亞腹食道腺細胞表達基因。

實施例3、ha-63744基因的發育表達分析

參考long等，所述方法[longh,pengh,huangw,wangg,gaob,moensm,andpengd.identificationandmolecularcharacterizationofanewβ-1,4-endoglucanasegene(ha-eng-1a)inthecerealcystnematodeheteroderaavenae.europeanjournalofplantpathology.2013,134:391-400.]，在溫麥19感病小麥根部大量接種ccn二齡幼蟲5d、10d、20d和30d后，采用酶裂解法分離得到侵染后j2、j3、j4和雌蟲，同時收集的侵染前j2和卵。采用磁珠法分別提取6個齡期的mrna，反轉錄成第一鏈cdna作為模板，采用primer5軟件設計ha-63744基因特異性引物上游引物haq-f：5’-tcgcctcaaaagcagttgtc-3’；下游引物haq-r：5’-tctgccaaatcgccattgtc-3’，采用realtimepcr相對定量技術檢測靶基因在不同齡期的表達量，以actin(genbank登錄號jq074059)作為內參基因，采用premixextaq^tm試劑盒(takara)，在abiprism7500熒光定量pcr儀上進行realtimert-pcr檢測，分別進行三次生物學重復實驗，采用2^-△△ct法分析結果，從而明確ha-63744基因在小麥禾谷孢囊線蟲不同發育階段表達特征。

反應體系(20μl)：premixextaq^tm(2×)10μl，roxdye0.4μl，上游引物(10μm)0.4μl，下游引物(10μm)0.4μl，模板1μl，ddh2o補足。反應程序：95℃30s；95℃5s、60℃31s，40個循環；95℃15s、60℃1min、95℃15s。結果見圖3。相對于卵時期的表達量，ha-63744基因在寄生期二齡幼蟲、四齡幼蟲和成熟雌蟲中表達量高。結果顯示，ha-63744基因主要在禾谷類孢囊線蟲寄生后期表達。

實施例4、通過體外rnai沉默ha-63744基因驗證其作為靶標在抗線蟲中的應用。

采用block-it^tmrnaidesigner軟件設計基因特異性引物ha-if：5’-cctttggctggagatgctttg-3’，ha-ir：5’-cgccatcctcttccttaccatg-3’，5′端引入t7啟動子序列taatacgactcactataggg，合成dsrna模板并純化用于下一步實驗。按照hiscribet7quickhighyieldrnasynthesiskit說明書，進行合成ha-63744基因特異的dsrna，針對egfp的dsrna及水處理為對照，采用章魚胺與亞精胺刺激小麥禾谷孢囊線蟲二齡幼蟲攝入dsrna，將新孵化的小麥禾谷孢囊線蟲j2幼蟲浸泡在2mg/ml的dsrna中避光緩慢振蕩36h，無菌水洗滌多次后，接種到預培養10d的感病小麥溫麥19根部。每管種植3株、重復6次。平均每管接種500頭，50d后，分離統計每株根系的白雌蟲量,從而確定靶基因沉默后對ccn侵染和發育的影響。結果表明針對ha-63744的dsrna處理后，與對照相比白雌蟲量下降70.94％(圖4)，可以作為線蟲防控的靶標基因。

sequencelisting

<110>中國農業科學院植物保護研究所

<120>禾谷孢囊線蟲ha-63744蛋白、編碼基因及其應用

<130>pp17065-zwb

<160>3

<170>patentinversion3.3

<210>1

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<212>prt

<213>禾谷孢囊線蟲的ha-63744蛋白

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glyalavalalaalahisglylysglylysaspalahislysglyala

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serseralalysglyasnlyslysaspserlysserproalalyslys

505560

aspalalysglylyslysasplyslysglulysproglualalyslys

65707580

glylysglyalaalathrprolyslysasplyslyssergluasnala

859095

lysalaserproalalysglylyslysthrprothrlysprolysval

100105110

alaserlysalavalvalprolysalagluproalaglnasnglupro

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leualagluaspgluleuleugluasptyrglyileserglyaspglu

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<213>ha-63744蛋白基因

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<213>ha-63744基因特異的dsrna片段

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