禾谷孢囊線蟲的Ha?62292蛋白、編碼基因及其應用的制作方法

本發明屬于生物技術領域，涉及一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白、編碼基因及其應用。

背景技術：

禾谷孢囊線蟲(heteroderaavenae)是一種固著型植物內寄生線蟲，主要危害小麥大麥燕麥等禾本科植物的根系，造成嚴重的產量損失，分布廣泛。目前已經在我國的河南、安徽、山東、青海、寧夏、陜西等13個省市地區發現和報道(蘇致衡,黃文坤,鄭國棟,張宏嘉,劉淑艷,彭德良.北京地區小麥禾谷孢囊線蟲病發生動態調查.植物保護,2013,(01):116-120.)(趙洪海,楊遠永,彭德良,劉峰.小麥禾谷孢囊線蟲在山東省的分布新報道和發生特點淺析.青島農業大學學報(自然科學版),2011,(04):261-266.)(趙杰,鈕緒燕,張管曲,彭德良,康振生.陜西省中南部地區小麥禾谷孢囊線蟲的發生與分布.西北農業學報,2011,(06):181-185.)(黃文坤,葉文興,王高峰,龍海波,歐師琪,彭德良.寧夏地區禾谷孢囊線蟲的發生與分布.華中農業大學學報,2011,(01):74-77.)(陳新,周洪友,馬璽.內蒙古中西部地區小麥禾谷孢囊線蟲的發生分布.植物保護,2009,(05):114-117.)(侯生英,彭德良,王愛玲,黃文坤,耿貴工,張貴.青海省小麥孢囊線蟲病調查初報.青海大學學報(自然科學版),2008,(05):84-86.)(楊傳廣,吳慧平,檀根甲,王月英.安徽省小麥孢囊線蟲田間分布及危害調查.植物保護,2008,(02):107-110.)。該種線蟲適應低溫，通常在冬季之前就可開始侵染，侵染后的幼蟲在寄主體內過冬，并在第二年開春后繼續侵染和發育，一年只發生一代(向桂林,宋志強,梁旭東,胡小斌,亓竹冉,王暄,李紅梅.禾谷孢囊線蟲的田間侵染規律及垂直分布研究.麥類作物報,2013,(04):789-794.)。

由于禾谷孢囊線蟲寄主范圍窄、侵染周期長、研究背景不明，其致病機制研究相對較落后。隨著效應蛋白作為病原物致病機制的關鍵因素的持續研究開發，禾谷孢囊線蟲相關研究也得到進一步增長(彭德良.重要植物線蟲致病相關基因研究進展.中國植物病理學會.中國植物病理學會2006年學術年會論文集.中國植物病理學會:,2006:10.)。隨著基因表達和功能研究相關技術的成熟，rna表達定量、定位分析、rnai等均可應用到禾谷孢囊線蟲中(黃文坤,彭德良,彭煥.rna干擾技術在植物寄生線蟲中的應用.農業生物技術學報,2009,(01):170-175.)。借鑒于其它植物寄生線蟲的研究方法，禾谷孢囊線蟲效應蛋白的研究已取得長足的進步，例如內切葡聚糖酶、細胞壁擴展蛋白、膜聯蛋白等一些具有明顯促進寄生作用的效應蛋白在禾谷孢囊線蟲中被發現(龍海波.小麥禾谷孢囊線蟲β-1，4-內切葡聚糖酶和細胞壁擴展蛋白基因的克隆及功能分析.中國農業科學院,2012.)，并且這些被發現的基因可應用于寄主介導的rna干擾或異位表達以抑制病原線蟲的侵入危害。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白及其編碼基因，從表達時間上來看，主要集中在侵染前二齡、侵染后二齡第1天。而從表達部位來看，其主要集中在食道腺細胞中。實驗表明該基因在禾谷孢囊線蟲寄生致病過程中發揮重要作用，可作為植物抗線蟲工程的靶標基因。

一種來源于禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白，其氨基酸序列如seqidno：1所示。

編碼禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白的基因。

編碼禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白的基因，其核苷酸序列如seqidno：2所示。

禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白在禾谷孢囊線蟲防控中的應用。

所述應用為將ha-62292蛋白作為禾谷孢囊線蟲的寄主防御反應的誘導劑，用于激活寄主免疫反應增強對線蟲抗性，或者獲得在寄主中的ha-62292蛋白的受體蛋白，轉移到不含有該種受體蛋白的寄主中以獲得抗性。

本發明的序列表ha-62292蛋白，長度為218個氨基酸；如seqidno：1所述；編碼該蛋白的基因長度為654個核苷酸，其序列如seqidno：2所示。上述蛋白來源于禾谷孢囊線蟲，但來源于其它孢囊線蟲甚至根結線蟲的此蛋白也屬于本發明保護范圍。此蛋白可通過生物技術直接人工合成，先合成其編碼基因，連接到表達載體后再導入生物體內表達得到。

上述編碼基因的雜交探針、dsrna、重組表達載體、干擾載體、重組病毒、轉基因細胞系、轉基因植物或組織、重組菌也屬于本發明的保護范圍。雜交探針和dsrna列于序列表中序列3和序列4、5、6、7，其中dsrna片段有四個，表達載體和干擾載體的構建建立在相應的啟動子區基礎上，具體可為單獨或者多個組合使用的誘導型、增強型、組成型、組織特異型，并且伴隨有合適的篩選標記，例如抗性、化學發光或染色、熒光。轉化目標生物可以是細菌、真菌、植物或動物細胞系。

ha-62292蛋白在禾谷孢囊線蟲病害防控中的應用。

蛋白質的功能應用研究常用rna干擾、體內異位表達等基于編碼基因操作的方法，本發明使用rna干擾有效影響了基因的表達水平，并且在線蟲的寄生致病能力方面表現出差異。此差異建立在對禾谷孢囊線蟲敏感的寄主上，例如大麥goldenpromise。

ha-62292基因的應用主要包括

(d1)在線蟲不同發育階段表達水平變化

(d2)在線蟲不同組織部位表達水平

孢囊線蟲不同階段其表達的蛋白質有差異，并且反映在編碼基因的轉錄水平上。在涉及到對寄主的寄生致病和抗逆方面，往往在寄生過程的前期表達，而與自生發育相關的蛋白質，其編碼基因很可能在后期表達。此外編碼基因在線蟲的轉錄表達部位也與其應用有關，例如食道腺細胞中表達的蛋白很可能與寄生植物有關，而在頭感器或者表皮中表達則可能與尋找寄主或者抑制寄主免疫反應有關。本發明提供的ha-62292基因，從表達時間上來看，主要集中在侵染前二齡、侵染后二齡第1天。而從表達部位來看，其主要集中在食道腺細胞中。

本發明涉及到的寄主品種包括但不限于大麥goldenpromise，也可為其它感病麥類作物，例如小麥和燕麥。本發明通過基因沉默，將針對ha-62292基因設計的dsrna片段(如seqidno：4、5、6)分別導入禾谷孢囊線蟲體內，結果顯示，4個dsrna片段rna干擾后線蟲侵入根內的數量相比對照明顯上升，推測此基因可能與激活寄主免疫反應有關。

根據基因沉默結果推測，該基因編碼的蛋白可能在被寄主識別后激活相應的免疫反應，而該基因也可能屬于無毒基因。無毒基因表達產物在寄主中往往有固定的受體，該受體行使抗病作用，可通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等蛋白互作研究技術挖掘受體蛋白和其編碼基因，再將編碼基因轉化至不含該種受體的感病寄主中獲得對相應線蟲的抗性。本發明對于孢囊線蟲致病機理研究以及抗線蟲植物制備具有重大價值。

附圖說明

圖1為發育表達定量分析，結果顯示，ha-62292基因表達主要集中在侵染前二齡和侵染后二齡第1天，數據收集自三次獨立重復。

圖2為侵染前二齡幼蟲組織表達定位，結果顯示，ha-62292基因表達主要集中在食道腺細胞中。

圖3為rna干擾顯示ha-62292基因表達被干擾后二齡幼蟲侵入根內的數量統計圖，結果表明，被干擾后二齡幼蟲侵入根內的數量明顯上升。

具體實施方式

以下實施例中所用到的試劑如無特別說明均為國產分析純，所用方法如無特別說明均按照試劑盒使用說明書進行，涉及到rna的實驗所用試劑耗材均經過depc處理。

實施例1：ha-62292蛋白及其編碼基因的分離

使用trizol(ambion)試劑盒提取禾谷孢囊線蟲總rna，dnasetreatmentandremovalreagents(ambion)處理后使用iiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr反轉錄試劑盒(invitrogen)合成cdna。并以此cdna為模板，pcr擴增基因序列，所用試劑為maxdnapolymerase高保真酶(takara)，引物序列為：5'-gatttgttgtccgcagtgcctttg-3'，5'-gccaaaggcactgcggacaacaaa-3'。將擴增得到的片段純化后連接測序。測序結果顯示其包含有序列表中seqidno：2所示的開放閱讀框，編碼seqidno：1的蛋白質序列，并分別將該蛋白質序列和基因序列命名為ha-62292蛋白和ha-62292基因。

實施例2：ha-62292基因的發育表達變化

酶解法收集不同發育階段的禾谷孢囊線蟲，使用trizol(ambion)試劑盒提取總rna，dnasetreatmentandremovalreagents(ambion)處理后使用iiifirst-strandsynthesissystemforrt-pcr反轉錄試劑盒(invitrogen)合成cdna。并以此cdna為模板，real-timepcr檢測不同階段表達水平變化，所用pcr試劑為selectmastermix(appliedbiosystems)，引物為5'-ctacaaagcggcgggaaat-3'，5'-atgcaccagaataatctgaacagc-3'，內參基因為gapdh，內參基因引物為5'-agcggcacagaacatcatcc-3'，5'-ggtcctccgtgtagcccaaa-3'。結果表明此基因表達水平主要集中在侵染前二齡、侵染后二齡第1天。

實施例3：ha-62292基因的組織表達定位

以禾谷孢囊線蟲線蟲cdna為模板，maxdnapolymerase高保真酶(takara)和引物5'-cttcttgctcattgccctaa-3'、5'-aaattctcgcccatccct-3'pcr擴增，回收純化得到的擴增片段，并以此為模板，pcrdigprobesynthesiskit(roche)和反義引物作單引物擴增，以擴增產物為雜交探針。雜交方法參考文獻dej.m.boeryy,geertsmant,ericl.davis,thomasj.baum(1998)in-situhybridizationtomessengerrnainheteroderaglycines.journalofnematology30:309-312.雜交結果顯示，此基因表達定位在禾谷孢囊線蟲的食道腺細胞中。

實施例4：ha-62292基因rna干擾

以禾谷孢囊線蟲cdna為模板，maxdnapolymerase高保真酶(takara)和下表引物擴增，將擴增產物純化并以此為模板，hiscribet7quickhighyieldrnasynthesiskit(neb)試劑盒做體外轉錄，megaclear^tmkitpurificationforlargescaletranscriptionreactions(ambion)純化轉錄得到的dsrna后-80℃保存備用。

按照下表配制浸泡體系，無dsrna體系為陰性對照

浸泡條件為黑暗16℃緩慢搖動36h。浸泡后接種大麥，每個50ml離心管中3棵大麥，接種線蟲400，實驗重復至少3次，接種后的大麥培養在16度光照培養箱中。接種后第8天酸性品紅染色統計根中線蟲數量。結果顯示，4個dsrna片段rna干擾后線蟲侵入根內的數量相比對照明顯上升，推測此基因可能與激活寄主免疫反應有關。

sequencelisting

<110>中國農業科學院植物保護研究所

<120>禾谷孢囊線蟲的ha-62292蛋白、編碼基因及其應用

<130>pp17066-zwb

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<213>ha-62292蛋白序列

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<213>ha-62292基因序列

<400>2

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<213>ha-62292基因雜交探針序列

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<213>ha-62292基因rna干擾dsrna片段序列1

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<212>dna

<213>ha-62292基因rna干擾dsrna片段序列3

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<213>ha-62292基因rna干擾dsrna片段序列4

<400>7

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