本發明屬于生物發酵工程技術領域，具體涉及一種高濃度蟲草多糖的發酵方法。
背景技術：
蛹蟲草為子囊菌亞門ascomycota、肉座菌目hypocreales、麥角菌科
clavicipitaceae、蟲草屬(cordyceps)的模式種。學名為cordycepsmilitaris，又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草、蟲草等，由子座(即草部分)與菌核(即蟲的尸體部分)兩部分組成的復合體，世界性分布但天然資源數量很少。中醫認為，蟲草入肺腎二經，既能補肺陰，又能補腎陽，主治腎虛、腰膝酸痛、病后虛弱、久咳痰血、盜汗等，是唯一的一種能同時平衡、調節陰陽的中藥。大量的現代藥理研究表明蛹蟲草不僅具有特殊的營養價值，而且有明顯的藥用價值。其中蟲草多糖是蟲草體內含量最豐富、最重要的生物活性物質之一，因具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射及提高機體免疫功能、促進腎上腺的作用、增加人體胰島素的分泌、降低糖尿病人的血糖水平等廣泛的藥理作用而倍受關注。蟲草多糖是一種高度分枝的半乳甘露聚糖，能夠活化巨噬細胞刺激抗體產生，促進淋巴細胞轉化，提高血清igg的抗體含量和機體的免疫功能，增強機體自身抗癌抑癌的能力，臨床已用于治療惡性腫瘤。此外，蟲草多糖還能改善呼吸系統，抗心律失常、抗心肌缺血、擴張外周血管、降壓、降血脂、抑制血小板聚集等。目前世界范圍內對蛹蟲草及蟲草多糖的需求增長迅速，而野生的蛹蟲草中蟲草多糖的含量不高，再加上人們的瘋狂采摘，價格日益昂貴，蛹蟲草多糖的廣泛應用受到藥源資源的嚴重制約，而且通過化學合成的途徑工藝復雜且產量極低。采用液體發酵的方法生產蛹蟲草多糖具有生產周期短、勞動力節省、受外部環境影響小等優點，而且研究發現從蛹蟲草子實體、菌絲體及發酵液中得到的蟲草多糖在生化結構上基本是相同的，因此被認為是一種有效的替代從天然蛹蟲草提取多糖的生產方法。但目前蛹蟲草多糖的發酵水平不高，產量偏低限制了其工業化生產的發展。與真菌多糖領域的大量研究相比，國內外對蛹蟲草多糖的研究報道屈指可數，而且多集中在最近幾年，主要集中在發酵及產物提取分離等工藝層面上。
如專利文獻cn101067005(申請號200710052357)，公開了一種用大米生產蟲草多糖方法，其包括配料、接種、培養、獲取蟲草多糖及輻照滅菌后包裝步驟。所述配料中，各原料的配比是：按重量計，大米45.0-49.0％，玉米和豆餅混合粉0.9-2％，營養液49.0-54.1％；營養液配方為土豆180-220g，白糖18-22g，蛋白胨13-18g，磷酸二氫鉀1.5-2.2g，硫酸鎂0.8-1.2g，水900-1100g。目前，尚未有從蛹蟲草多糖生物代謝的角度分析的研究，對蛹蟲草多糖發酵水平的提高有限，發酵周期長，成本高，整體的生產效率較低，發酵生產出的蟲草多糖濃度不夠高，還不能遠滿足現代工業化發酵生產的需要。
技術實現要素：
有鑒于此，本發明提供一種高濃度蟲草多糖的發酵方法，極大的優化了蛹蟲草多糖發酵的工藝條件，有效縮短了發酵周期和生產成本，提高整體的生產效率以及發酵生產出的蟲草多糖的濃度，為現代工業化蟲草多糖的發酵生產的提供有力支持。
本發明的技術方案為：一種高濃度蟲草多糖的發酵方法，包括如下步驟：
（1）將蛹蟲草菌種接種到pd液體發酵培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數10-15%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為：溫度20-25℃，搖床培養2-4天，得種子液；
（2）將步驟（1）制得種子液按5-10%體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度20-25℃的條件下，液體發酵培養1-6天，然后加入活性發酵液，使裂壺藻發酵蛋白產物的濃度為0.15-0.85mg/ml，然后繼續培養2-9天，分離，得到蛹蟲草菌絲體和發酵液；
（3）從步驟（2）制得的發酵液中提取蛹蟲草胞外多糖，從步驟（2）制得的蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內多糖，混合蛹蟲草胞外多糖和蛹蟲草胞內多糖，即得蟲草多糖；
所述步驟（1）中的種子發酵培養基，每升組分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4，2-5顆直徑3-6mm的玻璃珠；
所述步驟（2）中的液體發酵培養基，每升組分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述活性發酵液為裂壺藻發酵產物，其制備方法為：
取經過清洗的裂壺藻原料，設定酶解條件為料液比1∶10（m/v）、纖維素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、溫度55℃、ph4.5、反應時間1.3h，進行酶解，纖維素酶水解結束后，沸水浴滅酶15min，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻纖維素酶水解液；裂壺藻酶解液滅酶活后，調節ph值至6.2-6.6，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min），然后接種體積分數1%的mrs培養基活化的戊糖片球菌液到裂壺藻酶解液，37℃恒溫培養箱靜置，進行發酵；發酵結束后，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻發酵產物，即為制備的活性發酵液。
進一步的，所述步驟（1）中的活化培養條件為：搖床轉速100-160r/min，溫度20-25℃，暗培養活化3-5天。
進一步的，步驟（2）中所述的分離是在15000r/min條件下離心分離5-10min。
進一步的，所述步驟（3）中提取蛹蟲草胞外多糖的方法，步驟如下：
取步驟（2）制得的發酵液，加入4倍體積的95%乙醇，混勻后4℃靜置5h，12000rpm離心10min，取沉淀，用6ml濃度為1mnaoh溶液60℃溶解1h，制得蛹蟲草胞外多糖。
進一步的，所述步驟（3）中提取蛹蟲草胞內多糖的方法，步驟如下：
將步驟（2）制得的蛹蟲草菌絲體65℃烘干，研成粉末，按每克蛹蟲草菌絲體粉末加6ml濃度為1m的naoh溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min離心5min，取上清液，制得蛹蟲草胞內多糖。
海洋微藻作為一類原始而十分重要的海洋生物資源，富含多不飽和脂肪酸、多糖、多肽等多種生物活性物質，現主要用于制備生物能源及水產養殖飼料，關于用于發酵的活性物質制備的報道更為少見。裂壺藻是一類富含多不飽和脂肪酸的微藻，常被用來生產高純度二十二碳六烯酸（docosahexaenoicacid，dha）的保健品、嬰幼兒乳制品添加劑等。裂壺藻經提取多不飽和脂肪酸后所產生的藻渣其蛋白質含量可高達40%以上，然而目前這些藻渣大多被當成飼料或肥料處理，蛋白資源未得到充分開發與利用。將裂壺藻發酵蛋白產物應用于蛹蟲草的液體發酵生產，用以提高蟲草多糖產量等次生代謝產物產量的研究國內外尚未見報道。
本發明的有益效果在于：
1、本發明將裂壺藻發酵蛋白產物應用于蛹蟲草多糖的液體發酵生產，胞內多糖產量可達2.31g/l，胞外多糖產量可達8.37g/l，分別比現有技術提高了1.9倍和7.6倍以上；本發明大大提高了整體蛹蟲草的蟲草多糖有效成分的生產量，具有很好的工業化應用前景；
2、本發明采用液體好氧發酵方法，一般為5-7天，相對于現有技術，產量高，周期短，無需靜置培養及誘導合成產物等過程，生產效率較高，所生產的蛹蟲草多糖可直接用于免疫力調節、抗腫瘤、降血糖等藥物的制備；
3、本發明所述裂壺藻發酵蛋白產物的原料來源廣泛，成本較低，制備方法也相對簡單，可規模提取生產，對蛹蟲草蟲草多糖類物質的發酵生產具有很好的促進和提升效果；
4、本發明所采用的蛹蟲草液體發酵工藝簡單，環保無毒，原材料成本低廉，而且全發酵過程可控，不受外部環境條件限制，適合工業化生產及推廣應用。
5、本發明對液體發酵培養基和種子發酵培養基的配方進行了優化，能夠大幅度提高蛹蟲草多糖的產量。
具體實施方式
下面將結合本發明實施例對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發明保護的范圍。
實施例1
一種高濃度蟲草多糖的發酵方法，包括如下步驟：
（1）將蛹蟲草菌種接種到pd液體發酵培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數15%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為：溫度25℃，搖床培養2天，得種子液；
（2）將步驟（1）制得種子液按10%體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度25℃的條件下，液體發酵培養1天，然后加入活性發酵液，使裂壺藻發酵蛋白產物的濃度為0.85mg/ml，然后繼續培養2天，分離，得到蛹蟲草菌絲體和發酵液；
（3）從步驟（2）制得的發酵液中提取蛹蟲草胞外多糖，從步驟（2）制得的蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內多糖，混合蛹蟲草胞外多糖和蛹蟲草胞內多糖，即得蟲草多糖；
所述步驟（1）中的種子發酵培養基，每升組分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4，2-5顆直徑3-6mm的玻璃珠；
所述步驟（2）中的液體發酵培養基，每升組分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述活性發酵液為裂壺藻發酵產物，其制備方法為：
取經過清洗的裂壺藻原料，設定酶解條件為料液比1∶10（m/v）、纖維素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、溫度55℃、ph4.5、反應時間1.3h，進行酶解，纖維素酶水解結束后，沸水浴滅酶15min，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻纖維素酶水解液；裂壺藻酶解液滅酶活后，調節ph值至6.2-6.6，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min），然后接種體積分數1%的mrs培養基活化的戊糖片球菌液到裂壺藻酶解液，37℃恒溫培養箱靜置，進行發酵；發酵結束后，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻發酵產物，即為制備的活性發酵液。
進一步的，所述步驟（1）中的活化培養條件為：搖床轉速160r/min，溫度25℃，暗培養活化3天。
進一步的，步驟（2）中所述的分離是在15000r/min條件下離心分離5min。
進一步的，所述步驟（3）中提取蛹蟲草胞外多糖的方法，步驟如下：
取步驟（2）制得的發酵液，加入4倍體積的95%乙醇，混勻后4℃靜置5h，12000rpm離心10min，取沉淀，用6ml濃度為1mnaoh溶液60℃溶解1h，制得蛹蟲草胞外多糖。
進一步的，所述步驟（3）中提取蛹蟲草胞內多糖的方法，步驟如下：
將步驟（2）制得的蛹蟲草菌絲體65℃烘干，研成粉末，按每克蛹蟲草菌絲體粉末加6ml濃度為1m的naoh溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min離心5min，取上清液，制得蛹蟲草胞內多糖。
本實施例提供的一種高濃度蟲草多糖的發酵方法，極大的優化了蛹蟲草多糖發酵的工藝條件，有效縮短了發酵周期和生產成本，提高整體的生產效率以及發酵生產出的蟲草多糖的濃度，為現代工業化蟲草多糖的發酵生產的提供有力支持。
實施例2
一種高濃度蟲草多糖的發酵方法，包括如下步驟：
（1）將蛹蟲草菌種接種到pd液體發酵培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數10%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為：溫度20℃，搖床培養2天，得種子液；
（2）將步驟（1）制得種子液按5%體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度20℃的條件下，液體發酵培養6天，然后加入活性發酵液，使裂壺藻發酵蛋白產物的濃度為0.85mg/ml，然后繼續培養2-9天，分離，得到蛹蟲草菌絲體和發酵液；
（3）從步驟（2）制得的發酵液中提取蛹蟲草胞外多糖，從步驟（2）制得的蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內多糖，混合蛹蟲草胞外多糖和蛹蟲草胞內多糖，即得蟲草多糖；
所述步驟（1）中的種子發酵培養基，每升組分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4，2-5顆直徑3-6mm的玻璃珠；
所述步驟（2）中的液體發酵培養基，每升組分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述活性發酵液為裂壺藻發酵產物，其制備方法為：
取經過清洗的裂壺藻原料，設定酶解條件為料液比1∶10（m/v）、纖維素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、溫度55℃、ph4.5、反應時間1.3h，進行酶解，纖維素酶水解結束后，沸水浴滅酶15min，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻纖維素酶水解液；裂壺藻酶解液滅酶活后，調節ph值至6.2-6.6，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min），然后接種體積分數1%的mrs培養基活化的戊糖片球菌液到裂壺藻酶解液，37℃恒溫培養箱靜置，進行發酵；發酵結束后，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻發酵產物，即為制備的活性發酵液。
進一步的，所述步驟（1）中的活化培養條件為：搖床轉速100r/min，溫度25℃，暗培養活化5天。
進一步的，步驟（2）中所述的分離是在15000r/min條件下離心分離10min。
進一步的，所述步驟（3）中提取蛹蟲草胞外多糖的方法，步驟如下：
取步驟（2）制得的發酵液，加入4倍體積的95%乙醇，混勻后4℃靜置5h，12000rpm離心10min，取沉淀，用6ml濃度為1mnaoh溶液60℃溶解1h，制得蛹蟲草胞外多糖。
進一步的，所述步驟（3）中提取蛹蟲草胞內多糖的方法，步驟如下：
將步驟（2）制得的蛹蟲草菌絲體65℃烘干，研成粉末，按每克蛹蟲草菌絲體粉末加6ml濃度為1m的naoh溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min離心5min，取上清液，制得蛹蟲草胞內多糖。
實施例3
一種高濃度蟲草多糖的發酵方法，包括如下步驟：
（1）將蛹蟲草菌種接種到pd液體發酵培養基中，進行活化培養，然后按體積百分數12.7%的接種量接到種子發酵培養基中，進行種子培養，種子培養條件為：溫度23℃，搖床培養3天，得種子液；
（2）將步驟（1）制得種子液按7%體積比接種于液體發酵培養基中，在溫度22℃的條件下，液體發酵培養3天，然后加入活性發酵液，使裂壺藻發酵蛋白產物的濃度為0.5mg/ml，然后繼續培養4天，分離，得到蛹蟲草菌絲體和發酵液；
（3）從步驟（2）制得的發酵液中提取蛹蟲草胞外多糖，從步驟（2）制得的蛹蟲草菌絲體中提取蛹蟲草胞內多糖，混合蛹蟲草胞外多糖和蛹蟲草胞內多糖，即得蟲草多糖；
所述步驟（1）中的種子發酵培養基，每升組分如下：
3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4，2-5顆直徑3-6mm的玻璃珠；
所述步驟（2）中的液體發酵培養基，每升組分如下：
3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1gmgso4、0.03gcacl2、0.1gkh2po4、0.1gk2hpo4；
所述活性發酵液為裂壺藻發酵產物，其制備方法為：
取經過清洗的裂壺藻原料，設定酶解條件為料液比1∶10（m/v）、纖維素酶cellulaseaccf-4740添加量2%、溫度55℃、ph4.5、反應時間1.3h，進行酶解，纖維素酶水解結束后，沸水浴滅酶15min，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻纖維素酶水解液；裂壺藻酶解液滅酶活后，調節ph值至6.2-6.6，高壓蒸汽滅菌（121℃，20min），然后接種體積分數1%的mrs培養基活化的戊糖片球菌液到裂壺藻酶解液，37℃恒溫培養箱靜置，進行發酵；發酵結束后，9000r/min離心，收集上清液得到裂壺藻發酵產物，即為制備的活性發酵液。
進一步的，所述步驟（1）中的活化培養條件為：搖床轉速125r/min，溫度22℃，暗培養活化4天。
進一步的，步驟（2）中所述的分離是在15000r/min條件下離心分離7min。
進一步的，所述步驟（3）中提取蛹蟲草胞外多糖的方法，步驟如下：
取步驟（2）制得的發酵液，加入4倍體積的95%乙醇，混勻后4℃靜置5h，12000rpm離心10min，取沉淀，用6ml濃度為1mnaoh溶液60℃溶解1h，制得蛹蟲草胞外多糖。
進一步的，所述步驟（3）中提取蛹蟲草胞內多糖的方法，步驟如下：
將步驟（2）制得的蛹蟲草菌絲體65℃烘干，研成粉末，按每克蛹蟲草菌絲體粉末加6ml濃度為1m的naoh溶液，60℃浸提2h，然后12000r/min離心5min，取上清液，制得蛹蟲草胞內多糖。
對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有變化囊括在本發明內。
此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但并非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。本發明中所未詳細描述的技術細節，均可通過本領域中的任一現有技術實現。特別的，本發明中所有未詳細描述的技術特點均可通過任一現有技術實現。