本發明屬于微生物發酵
技術領域：
，具體涉及一種采用米曲霉發酵產蘋果酸的工藝。
背景技術：
：蘋果酸,又名羥基丁二酸、羥基琥珀酸或1-羥基乙烷二羧酸,分子式為c4h6o5，分子量134.09，結構式為hoocchohch2cooh。蘋果酸具有右旋（d-型）和左旋（l-型）兩種旋光異構體及dl-型外消旋體三種型式產品。其中l-蘋果酸，廣泛存在于生物體中，作為三羧酸循環的一員參與細胞代謝；d-蘋果酸人體不易代謝，吸入或吞咽其對人體有害，作為手性合成的手性源，可以合成許多重要的有機化合物。l-蘋果酸的生產最初是在培養黃曲霉時有少量蘋果酸伴隨琥珀酸和富馬酸產生。后來，由糖類物質發酵來生產l-蘋果酸，但是傳統的發酵法生產l-蘋果酸培養時間長、能耗大、產酸率低，糖的利用率不高，很難實現工業化生產。隨著氨基酸行業逐步發展，發酵法生產技術l-蘋果酸也有了長足的進步，但是l-蘋果酸的工業平均轉化率為70%-80%，尚有20%-30%富馬酸殘留，反應液中l-蘋果酸的含量較低，大約為100g/l左右，目前國內尚無規模化的l-蘋果酸生產方法。申請人之前的發明專利“一種直接發酵法生產l-蘋果酸的方法”以及“一種l-蘋果酸提取新工藝”通過優化工藝以及菌株合理配伍，大幅度提高了蘋果酸的產量以及糖酸轉化率，但是黃曲霉會產生一定量的黃曲霉素，產品中會殘留黃曲霉毒素，后續分離步驟繁瑣，增加了企業成本。鑒于上述缺陷，申請人之前的專利技術“一種制備l-蘋果酸的方法”采用米曲霉發酵來制備蘋果酸，其采用混合發酵的方式，取得了較好的蘋果酸產率，本發明在該專利技術的基礎上對發酵培養進行了改進，旨在于進一步提高蘋果酸的產率。技術實現要素：針對現有技術的缺陷，本發明提供了一種采用米曲霉發酵產蘋果酸的工藝。本發明通過對菌株進行透過性處理，工藝簡單，成本低廉，提高了蘋果酸產量。本發明的技術方案是通過如下方式來實施的：一種采用米曲霉發酵產蘋果酸的工藝，其包括如下步驟：制備米曲霉種子液，發酵制備蘋果酸，發酵過程中，添加碳酸鈣和ctab，以及調整壓強和溫度。具體地，所述工藝包括如下步驟：1）將米曲霉菌液按照8％的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為33℃，搖床轉速為200r/min，培養12h得到種子液；2）按照種子液∶發酵罐培養基為1∶10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度33℃，培養48h，然后添加碳酸鈣和ctab，繼續發酵36h，然后控制溫度為39-40℃，壓強為2-3個大氣壓，保溫保壓發酵12h，停止發酵，得到蘋果酸發酵液；發酵過程中，控制ph為6.2，控制殘糖濃度不低于1.0wt％。優選地，所述碳酸鈣的添加量為80g/l，ctab的添加量為30-40mg/l。優選地，所述種子罐的培養基組分為：蔗糖3g，硝酸鈉0.2g，硫酸銨0.5g，磷酸二氫鉀0.1g，磷酸氫二鉀0.1g，一水硫酸錳0.1g，七水硫酸亞鐵0.01g，硫酸鎂0.01g，氯化鈉0.01g，ph值6.0。優選地，所述發酵罐培養基組分為：碳酸鈣80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米漿12g/l，硫酸銨2g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.2g/l，磷酸氫二鉀0.1g/l，七水硫酸亞鐵0.01g/l，ph值6.2。所述米曲霉為米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。本發明的有益效果主要包括但是并不限于幾個方面：本發明對現有菌株進行通透化處理，提高了蘋果酸的產率；本發明通過提高培養溫度，可增加分子擴散的速度；增加壓力對細胞的擠壓作用增強,細胞表面發生輕微變形,細胞膜的通透性增加；培養過程后期加入合適劑量的ctab，干擾細胞壁的合成，改善菌體細胞壁和細胞膜對催化反應中底物和產物的傳質限制，同時調整合適的濃度，避免終濃度過低，達不到透性化改造的目的，終濃度過高則可能導致細胞死亡或生長停滯；本發明通過添加ctab結合溫度壓強的改變，實現菌株培養與透性化處理的耦合，可以在不需要對培養好的細胞進行后續透性化處理的情況下減小菌體細胞壁和細胞膜對底物和產物的傳質限制，避免后續透性化處理細胞的步驟及相關設備運轉的投入，為提高蘋果酸產量提供了一個簡便方法；本發明發酵工藝中添加碳酸鈣來維持培養液中碳酸鈣的濃度，提高了米曲霉的發酵效率。具體實施方式為了使本
技術領域：
的人員更好地理解本申請中的技術方案，下面將結合本申請具體實施例，對本發明進行更加清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本申請一部分實施例，而不是全部的實施例。基于本申請中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都應當屬于本發明保護的范圍。實施例1一種采用米曲霉發酵產蘋果酸的工藝，其包括如下步驟：將米曲霉(aspergillusoryzae)菌液（濃度為1×108cfu/ml)按照8％(體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為33℃，搖床轉速為200r/min，培養12h得到種子液，其中，種子罐的培養基組分為：蔗糖3g，硝酸鈉0.2g，硫酸銨0.5g，磷酸二氫鉀0.1g，磷酸氫二鉀0.1g，一水硫酸錳0.1g，七水硫酸亞鐵0.01g，硫酸鎂0.01g，氯化鈉0.01g，ph值6.0；按照種子液∶發酵罐培養基為1∶10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度33℃，培養48h，然后添加碳酸鈣和十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，碳酸鈣的添加量為80g/l，ctab的添加量為30mg/l，繼續發酵36h，然后控制溫度為39℃，壓強為2個大氣壓，保溫保壓發酵12h，停止發酵，得到蘋果酸發酵液；發酵過程中，通過自動流加氨水控制ph在6.2；并通過流加濃度為200g/l的葡萄糖溶液將殘糖控制在不低于1.0％；所述發酵罐培養基組分為：碳酸鈣80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米漿12g/l，硫酸銨2g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.2g/l，磷酸氫二鉀0.1g/l，七水硫酸亞鐵0.01g/l，ph值6.2；所述米曲霉為米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。實施例2一種采用米曲霉發酵產蘋果酸的工藝，其包括如下步驟：將米曲霉(aspergillusoryzae)菌液（濃度為1×108cfu/ml)按照8％(體積比)的接種量接入種子罐中進行培養，在溫度為33℃，搖床轉速為200r/min，培養12h得到種子液，其中，種子罐的培養基組分為：蔗糖3g，硝酸鈉0.2g，硫酸銨0.5g，磷酸二氫鉀0.1g，磷酸氫二鉀0.1g，一水硫酸錳0.1g，七水硫酸亞鐵0.01g，硫酸鎂0.01g，氯化鈉0.01g，ph值6.0；按照種子液∶發酵罐培養基為1∶10的體積比例轉入發酵罐中培養，溫度33℃，培養48h，然后添加碳酸鈣和十六烷基三甲基溴化銨(ctab)，碳酸鈣的添加量為80g/l，ctab的添加量為40mg/l，繼續發酵36h，然后控制溫度為39℃，壓強為3個大氣壓，保溫保壓發酵12h，停止發酵，得到蘋果酸發酵液；發酵過程中，通過自動流加氨水控制ph在6.2；并通過流加濃度為200g/l的葡萄糖溶液將殘糖控制在不低于1.0％；所述發酵罐培養基組分為：碳酸鈣80g/l，葡萄糖60g/l，木糖50g/l，玉米漿12g/l，硫酸銨2g/l，硫酸鎂0.5g/l，磷酸二氫鉀0.2g/l，磷酸氫二鉀0.1g/l，七水硫酸亞鐵0.01g/l，ph值6.2；所述米曲霉為米曲霉(aspergillusoryzae)accc30584。實施例3各因素對米曲霉發酵蘋果酸產量的影響：l-蘋果酸的測定：采用2,7—萘二酚顯色法，取樣品溶液1.0ml，加入6.0ml分析純的濃硫酸，再加入0.1ml2,7—萘二酚溶液，接著在100℃水浴中加熱20min，取出待冷卻至室溫后，于385nm下進行比色測定，以蒸餾水作對照校正儀器零點。用標準樣品先作標準曲線，以蘋果酸含量為橫坐標，385nm處吸收值即od385為縱坐標，通過未知樣品在385nm處的od值，則可在標準曲線上查得相應的蘋果酸含量。設置對照組，其中，對照組1：發酵過程不提高溫度和壓強，其余同實施例1；對照組2：不添加ctab，其余同實施例1；試驗組分別為實施例1和實施例2。各組別發酵液中蘋果酸的產量見表1：表1組別對照組1對照組2實施例1實施例2蘋果酸產量（g/l）89.195.7130.5133.1實施例4一、壓強梯度試驗：針對發酵后期12小時內，選擇1-5大氣壓進行測試，其余實驗流程同實施例1，具體發酵結果見表2：表2大氣壓強度12345蘋果酸產量（g/l）115.3130.5132.7121.4109.8二、溫度梯度試驗：針對發酵后期12小時內，選擇33-43℃進行測試，其余實驗流程同實施例2，具體發酵結果見表3：表3溫度℃333537394143酸產量（g/l）102.6113.9123.4133.1118.5105.7結論：適當提高溫度或壓強可以增加菌株細胞壁的透過性，從而提高蘋果酸產量，壓強或溫度過高時，可能會導致菌株活力降低或者死亡，從而導致蘋果酸量下降。雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方式對本案作了詳盡的說明，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所作的修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。當前第1頁12