一種96孔板磁珠提取口腔拭子DNA的方法與流程

本發明涉及生物技術領域，特別地，涉及一種96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法。

背景技術：

dna提取是分子生物學的基本實驗，它是不斷發展的基因芯片檢測中最基本的方法，也是基因芯片制備、分析和診斷的前提，因此，dna提取是生物學最基礎的技術之一。

成功的核酸分離純化需要四個重要的步驟：組織或細胞的破碎和裂解、核蛋白復合體的變性、核酸酶的滅活以及污染物的去除，通過理想的抽提方法可以獲取高質量的靶核酸，同時沒有蛋白、糖、脂和其它核酸污染等。

目前，常用的dna提取方法主要有玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法等物理方法，ctab法、異硫氰酸胍法、堿裂解法等化學方式，以及酶提取法等生物提取方式；根據核酸分離純化方式的不同有硅質材料、陰離子交換樹脂提取等。其中，植物來源的dna提取方法主要有十六烷基三乙基澳化按(ctab)法、sds法和高鹽低ph法等；細菌、真菌來源的dna提取方法為堿裂解法、煮沸法、sds裂解法以及triton-溶菌酶裂解法等；動物來源的dna最為經典的提取方法主要有酚抽提法、異丙醇沉淀法、甲酞胺裂解法，現行的很多方法都是在此基礎上改進得來。

口腔黏膜為復層鱗狀上皮，具有代謝旺盛、更新快、易脫落的特點，它由多層細胞組成，基底層具有旺盛分裂能力，其上皮脫落細胞雖然細胞核固縮，但與其他組織細胞一樣具有完整的基因組dna，從而成為法醫學和遺傳學dna多態性檢測分型的生物性檢驗材料。既往多采用酚氯仿法或chelex-100等方法，存在酚、氯仿污染或收獲率低、純度不高等缺點。

采用口腔拭子法(口腔脫落細胞)提取口腔上皮細胞是一種非介入、無痛苦、無創傷、簡單的dna標本采集方法，該方法適用于采集任何年齡段人群的dna樣本，同時也可應用于新生兒、嬰幼兒或老弱病殘者等不便采血人群之用。

目前，口腔拭子dna的提取多采用96孔板磁珠提取，處理口腔拭子樣本時，需要先將拭子頭剪下放入1.5ml左右離心管中，加入消化液及蛋白酶k，進行細胞的裂解和酶解反應后，再轉入96深孔板進行后續的實驗。一方面，兩次分步操作的方式增加了操作步驟、造成時間浪費，同時在樣品轉移的過程中，也極大的增加了混樣的風險。

技術實現要素：

本發明提供了一種96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，解決了現有技術中口腔拭子dna提取樣品易混樣的問題。

為實現上述目的，本發明提出了一種裂解及酶解口腔拭子dna的方法，包括如下步驟：

(1)取細胞培養板，按照順序一一對應空位，將口腔拭子頭置于深孔板中；

(2)向所述細胞培養板中加入消化液和蛋白酶k；

(3)密封所述細胞培養板；

(4)將所述細胞培養板于振蕩器上充分混勻并水浴處理，得到dna酶解液。

所述細胞培養板為96孔板。

所述細胞培養板為96深孔板。

所述步驟(3)中，使用所述細胞培養板的專用膠墊進行密封。

所述水浴處理步驟的溫度為56℃。

所述消化液為blbuffer。

所述消化液的加入量為500ul。

所述蛋白酶k的加入量為20ul。

本發明還公開了一種96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，包括如下步驟：

(a)按照所述裂解及酶解口腔拭子dna的方法，得到所述dna酶解液；

(b)將所述dna酶解液轉移到新的細胞培養板上，按照現有技術常規方法進行后續的dna提取。

所述步驟(b)中，還包括加入磁珠進行提取的步驟。

本發明所述96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法，在處理拭子樣品時，直接以96深孔板為載體，并處理獲得dna酶解液，可以直接將所述dna酶解液置于新的細胞培養板上進行常規后續處理，整個過程將從離心管轉移時混樣的風險降到最低，同時減少操作步驟，節省了操作時間。

附圖說明

圖1是本發明實施例1中96孔板提取口腔拭子dna的操作示意圖；

圖2是本發明實施例1中96孔板提取口腔拭子dna的另一角度操作示意圖；

圖3是本發明對比例中單管離心管提取口腔拭子dna的操作示意圖。

具體實施方式

為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖和具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明。

實施例1

如圖1、2所示，本實施例所述96孔板磁珠提取口腔拭子dna的方法是以96孔板進行，包括如下步驟：

(a)口腔拭子dna的裂解及酶解，具體包括：

(1)取96深孔板為細胞培養板，按照《樣本提取表》的順序，一一對應空位，使用手術剪將口腔拭子頭剪下，置于所述96深孔板中；

(2)向所述細胞培養板中加入500ul的消化液blbuffer和20ul的蛋白酶k；

(3)以所述96深孔板專用膠墊密封所述96深孔板；

(4)將所述96深孔板于振蕩器上充分混勻并控制56℃水浴處理，得到dna酶解液；

(b)將所述dna酶解液轉移到新的細胞培養板上，按照現有技術常規方法進行后續的dna提取，具體包括：

(1)加入350ul無水乙醇，加入30ul磁珠，置于混勻儀上1200rpm，混勻1分鐘；靜置吸附10分鐘，并在靜置第3分鐘、第6分鐘分別混勻1次；

(2)吸附結束后，混勻磁珠，將深孔板置于磁力架上，至溶液澄清后，撕去膠墊，棄去深孔板內上清液，注意不要觸碰到磁珠；

(3)加入600ul已加乙醇的洗滌液bw1，蓋上膠墊，置于混勻儀上1350rpm，混勻1分鐘；并將深孔板置于磁力架上，至溶液澄清后，撕去膠墊，棄去深孔板內上清液，注意不要觸碰到磁珠；

(4)加入600ul已加乙醇的洗滌液bw1，蓋上膠墊，按照上述方法再洗滌一次；

(5)隨后加入500ul80％乙醇溶液，蓋上膠墊，按照上述方法洗滌一次；

(6)將96深孔板置于干式加熱器上，40℃烘干5分鐘；

(7)加入50ul洗脫液ce，置于混勻儀上1600rpm，混勻1分鐘，于56℃水浴孵育10分鐘進行dna洗脫，并在第5分鐘混勻1次；

(8)孵育結束后混勻磁珠，置于磁力架上至溶液澄清，吸取上清；使用nanodrop測定濃度，將濃度填寫到《樣本濃度表》中，于-20℃保存待用。

對比例

所述對比例中提取口腔拭子dna的方法與實施例1相同，其區別僅在于，如圖3所示，所述步驟(a)中，所述裂解及酶解dna的步驟中，在處理口腔拭子樣本時，先將口腔拭子頭剪下放入1.5ml左右離心管中，加入相同的消化液及蛋白酶k，在相同條件下，進行細胞的裂解和酶解反應，得到所述dna酶解液；待消化完畢后，再轉入96深孔板中，按照現有技術常規方法進行后續的dna提取，所述dna提取步驟同實施例1。

實驗例

對上述實施例1中以96深孔板進行操作和對比例中以現有單管提取口腔拭子的方法中所提取得到的dna樣本濃度和純度進行檢測并對比，記錄數據如下表1。

表1兩種方法dna樣本濃度和純度對比

由上表可看出使用96深孔板和單管孵育樣本得到dna樣本的濃度，其純度近似，沒有顯著的差異，但本發明所述方法使用96深孔板進行dna提取操作相比于單管提取操作能大大的減少操作的時間、且有效降低轉移時混樣的風險。

以上對本發明實施例進行了詳細介紹，本文中應用了具體個例對本發明的原理及實施方式進行了闡述，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想；同時，對于本領域的一般技術人員，依據本發明的思想，在具體實施方式及應用范圍上均會有改變之處，綜上所述，本說明書內容不應理解為對本發明的限制。