本發明涉及型熒光化合物技術領域,尤其是涉及一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物及其應用。
背景技術:
熒光分析是一種靈敏性高、選擇性強、使用簡便的分析方法,被廣泛應用于分析化學、生物分析、環境工程、材料科學、醫藥等領域。熒光化合物是一種具有特殊光學性能的物質,當吸收紫外、可見光等能量后,電子躍遷至激發態,然后發生輻射衰變回復到基態,放出光子,產生熒光。近年來,人們以杯芳烴——一類由亞甲基橋連苯酚單元所形成的新型空穴狀化合物為分子平臺,研制出各種熒光探針化合物,在臨床診斷、分子生物學等醫學領域有著廣闊的潛在應用價值。例如,杯芳烴衍生物可作為金屬離子熒光識別試劑測定人體血漿內na+、k+、ca2+和mg2+等金屬離子。
鐵,是人體必需的微量元素之一,豐富存在于生物體內。在許多生化反應中,fe3+扮演著非常重要的角色,它的缺乏與過量都會使機體的功能發生紊亂,例如,阿爾茲海默癥、帕金森綜合征和貧血等疾病的發生發展都與體內鐵離子濃度的異常有密切關系。因此,開發用于定量檢測人體內fe3+的選擇性熒光探針,對于保證生命健康具有重要意義。目前鐵離子熒光探針有金屬有機骨架材料(如tb-mof)、羅丹明類、納米材料(如s-gqds、gsh@agnc)等,但是這些熒光探針合成方法繁瑣,毒副作用較差。
技術實現要素:
本發明的目的在于提供一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物,其易于合成,選擇性高,無明顯細胞毒性,對fe3+檢測極限達到1.25ppm,可以根據熒光強度的變化檢測出體內fe3+的含量。
為實現本發明的上述目的,本發明采用如下技術方案:
一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物,具有如式i所示的結構。
作為一種優選方案,具有如式i所示結構的熒光化合物對mg2+、pb2+、al3+、cd2+、co2+、ni2+、cu2+和fe3+均具有選擇性,特別是fe3+。
作為一種優選方案,具有如式i所示結構的熒光化合物對fe3+的檢測極限達到1.25ppm。
一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物的制備方法,包括以下步驟,
1).將間苯二酚和丙醛充分溶于一定濃度的乙醇中,形成混合物a;
2).將混合物a冰凍,并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加一定濃度鹽酸,形成混合物b;
3).將混合物b溫熱至室溫,再在溫度為80℃的條件下加熱24小時,待冷卻至室溫后,真空干燥10小時得到黃色粉末;
4).將黃色粉末放置在冷水中洗滌,直至廢液的ph呈中性,得到淺黃色固體;
5).將淺黃色固體放置在溫度為100℃的條件下真空干燥16小時,得到穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物。
作為一種優選方案,步驟1)中的間苯二酚、丙醛和乙醇的質量比為1-2:1:2.5-3.5,所述乙醇的體積濃度為50%。
作為一種優選方案,步驟2)中的鹽酸與混合物a的質量比為1:7-8,所述鹽酸的體積濃度為37%。
作為一種優選方案,步驟3)中的室溫的溫度范圍為18℃-25℃。
作為一種優選方案,步驟3)和步驟5)中的真空度為0.1mpa。
本發明熒光化合物對金屬離子的識別能力是依據其自身熒光激發峰強度的變化來進行分析判斷的。通過各種不同金屬離子對本發明熒光化合物的熒光滴定實驗,發現金屬離子的存在可以使熒光強度發生變化,尤其是fe3+能使熒光發生猝滅,而且對fe3+檢測極限達到1.25ppm。因此,本發明化合物能作為熒光探針對fe3+進行識別檢測。
本發明熒光化合物的細胞毒性也進行了探討,通過使用不同濃度本發明物對hek293細胞(人胚腎細胞)生長進行干預,檢測本發明物對人類正常細胞的影響。具體使用mtt方法:外源性的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2、5-二苯基四氮唑溴鹽)在活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶的作用下能被還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中,而死細胞無此作用。dmso(二甲基亞砜)能溶解細胞中的甲瓚,用酶聯免疫檢測儀在490nm波長處測定光吸收值,可間接反映活細胞數量。mtt實驗表明,一定濃度范圍內的本發明熒光化合物對正常活細胞無明顯毒性。
本發明的有益效果為:本發明熒光化合物對fe3+具有很好的識別性能,該熒光化合物對fe3+檢測極限達到1.25ppm,且制備方法簡易,產率高,無明顯細胞毒性,在環境、生物體內fe3+的檢測等方面具有廣泛應用前景。
附圖說明
圖1為本發明的熒光化合物的核磁共振碳譜;
圖2為本發明的熒光化合物的核磁共振氫譜;
圖3為本發明的熒光化合物對各種金屬離子的熒光識別光譜;
圖4為本發明的熒光化合物對不同濃度的鐵離子的熒光識別光譜;
圖5為經不同濃度本發明的熒光化合物干預hek293細胞24、48和72h后的細胞活性圖。
具體實施方式
一種穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物,具有如式i所示的結構。
具有如式i所示結構的熒光化合物對mg2+、pb2+、al3+、cd2+、co2+、ni2+、cu2+和fe3+均具有選擇性,特別是fe3+。且具有如式i所示結構的熒光化合物對fe3+的檢測極限達到1.25ppm。
實施例1
1).將11.6g間苯二酚和15ml丙醛充分溶于73.5ml體積濃度為95%的乙醇中,形成混合物a;
2).將混合物a冰凍,并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加17ml體積濃度為37%的鹽酸,形成混合物b;
3).將混合物b溫熱至室溫,再在溫度為80℃的條件下加熱24小時,待冷卻至室溫后,真空干燥10小時得到黃色粉末;
4).將黃色粉末放置在冷水中洗滌,直至廢液的ph呈中性,得到淺黃色固體;
5).將淺黃色固體放置在溫度為100℃的條件下真空干燥16小時,得到穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物,產率為93%。
實施例2
1).將23.2g間苯二酚和15ml丙醛充分溶于103ml體積濃度為50%的乙醇中,形成混合物a;
2).將混合物a冰凍,并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加21.6ml體積濃度為37%的鹽酸,形成混合物b;
3).將混合物b溫熱至室溫,再在溫度為80℃的條件下加熱24小時,待冷卻至室溫后,真空干燥10小時得到黃色粉末;
4).將黃色粉末放置在冷水中洗滌,直至廢液的ph呈中性,得到淺黃色固體;
5).將淺黃色固體放置在溫度為100℃的條件下真空干燥16小時,得到穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物,產率為96%。
實施例3
1).將15g間苯二酚和11.6ml丙醛充分溶于70ml體積濃度為50%的乙醇中,形成混合物a;
2).將混合物a冰凍,并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加15ml體積濃度為37%的鹽酸,形成混合物b;
3).將混合物b溫熱至室溫,再在溫度為80℃的條件下加熱24小時,待冷卻至室溫后,真空干燥10小時得到黃色粉末;
4).將黃色粉末放置在冷水中洗滌,直至廢液的ph呈中性,得到淺黃色固體;
5).將淺黃色固體放置在溫度為100℃的條件下真空干燥16小時,得到穴狀多羥基杯芳烴熒光化合物,產率為94%。
以上實施例中室溫的溫度范圍為:18℃-25℃,真空度為0.1mpa。
綜上可知,本發明熒光化合物的制備方法簡易,產率高,便于工業生產。
以上實施例中,實施例3為最優方案,以下實施例中實驗使用的熒光化合物均由實施例3制得。
實施例4
對本發明熒光化合物中的碳進行核磁共振,得到核磁共振碳譜,結果如圖1所示。
實施例5
對本發明熒光化合物中的氫進行核磁共振,得到核磁共振氫譜,結果如圖2所示。
實施例6
本發明熒光化合物對各種金屬離子的熒光識別實驗
實驗說明:參與熒光識別的金屬化合物是kno3、ca(no3)2、nano3、lino3、zn(no3)2、mg(no3)2、pb(no3)2、al(no3)3、cd(no3)2、co(no3)2、ni(no3)2、cu(no3)2和fe(no3)3。所有的金屬濃度為0.01m。
實驗步驟:在若干個5ml容量瓶中加入5mg本發明熒光化合物,然后再分別加入以上金屬溶液,最后加入經5a分子篩干燥的定溶劑dmf(n,n-二甲基甲酰胺)定容,在超聲頻率為10khz的條件下超聲20分鐘,室溫下放置12小時后進行測試,記錄數據,得到實驗結果。
實驗結果:
由圖3可知,no3-不會影響本發明化合物的熒光強度,而熒光強度的變化確實是由金屬離子本身引起的。本發明熒光化合物在未加任何金屬的時候,在528nm處有最強激發峰,隨著金屬化合物的加入,最強激發峰的熒光強度出現了變化。尤為顯著的是fe(no3)3可以使熒光猝滅,因此本發明熒光化合物可作為fe3+的熒光探針。除此之外,除了ca(no3)2、nano3、lino3和zn(no3)2使本發明物528nm處的熒光強度增強外,mg(no3)2、pb(no3)2、al(no3)3、cd(no3)2、co(no3)2、ni(no3)2和cu(no3)2都能一定程度地減弱這個最強激發峰的熒光。
實施例7
本發明熒光化合物被fe(no3)3逐漸猝滅實驗
實驗步驟:稱取5mg本發明熒光化合物溶于5ml經過5a分子篩干燥的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶液中,在超聲頻率為10khz的條件下超聲處理20分鐘,靜置12小時后再在超聲頻率為10khz的條件下超聲處理20分鐘,然后測試,逐滴滴加fe(no3)3(1000ppm),記錄數據,繪制得到實驗結果。
實驗結果:
由圖4可知,隨著fe(no3)3濃度的逐漸增加,熒光強度逐漸減弱,最后發生猝滅。
實施例8
本發明熒光化合物用于mtt細胞毒性實驗
實驗步驟:
(1)不同濃度本發明熒光化合物的配制
將hek293細胞(人胚腎細胞)放入96孔板內進行培養。用dmso(二甲基亞砜)將本發明熒光化合物配成40mg/ml,然后將40mg/ml的本發明熒光化合物溶液分別用不含血清的高糖dmem培養液稀釋成25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和300μg/ml的溶液放在溫度為4℃的條件下保存。待96孔板內的細胞貼壁后,分別取10μl上述配好的溶液放于已經含有90μl含血清培養液的96孔板內培養(本發明熒光化合物的濃度被稀釋10倍,在孔內的本發明熒光化合物濃度分別為2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml)。
(2)細胞培養——計數——接板
hek293細胞(人胚腎細胞)貼壁生長至90-95%即可傳代。在超凈工作臺內,吸棄上述96孔板內的培養液,再用2ml經高壓除菌后的pbs(磷酸鹽緩沖液)對96孔板內的貼壁細胞進行潤洗,然后加入1ml胰蛋白酶(gibco公司生產的0.25%trypsin-edta)對96孔板內的貼壁細胞進行消化,在顯微鏡下觀察至大部分細胞縮小變后圓后,立刻加入2ml培養液終止消化,然后用離心管吸取15ml經消化后的細胞液并將其放入離心機中,以1000r/min的轉速進行離心5分鐘。去除上清液后,加入1ml培養液,然后將底部沉淀的細胞打散均勻形成細胞懸液。吸取400μl細胞懸液放入另一培養器皿中進行培養,另外再吸取100μl細胞懸液放于細胞計數板數數,然后對余下500μl細胞懸液進行稀釋使其密度達到5.6*104/ml,并將稀釋后的細胞懸液接種于3塊96孔板(每孔加入90μl細胞懸液)內繼續培養。
(3)mtt試驗
次日觀察96孔板內的細胞生長狀況,待細胞貼壁后,分別加入10μl(25μg/ml)、10μl(50μg/ml)、10μl(100μg/ml)、10μl(200μg/ml)和10μl(300μg/ml)的本發明化合物和不含血清的高糖dmem培養液于孔內。mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2、5-二苯基四氮唑溴鹽)溶解于pbs(磷酸鹽緩沖液)中形成mtt溶液。培養1、2、3天后,在孔內分別加入10μl(5mg/ml)經過濾除菌的mtt溶液,繼續培養4小時后,吸棄孔內廢液,每孔加入150μldmso(二甲基亞砜)溶液,放置搖床(其林貝爾儀器制造有限公司生產的ts-2搖床)在擺振幅度為70rpm的條件下搖晃20分鐘,最后用酶聯免疫檢測儀(伯騰儀器公司生產的epoch系列)在490nm波長處測定光吸收值,記錄數據,以本發明熒光化合物的濃度為橫坐標,細胞活力為縱坐標繪制柱狀圖,如實驗結果所示。
實驗結果:
由圖5可知,在一定濃度范圍內的本發明熒光化合物對正常活細胞無明顯毒性。
以上所述的僅是本發明的優選實施方式,應當指出,對于本領域的普通技術人員來說,在不脫離本發明創造構思的前提下,還可以做出若干變形和改進,這些都屬于本發明的保護范圍。