一個早期評估食管鱗癌發病風險的SNP及檢測試劑盒的制作方法

本發明涉及人外周血基因組dna并利用等位基因特異性pcr法去檢測食管癌患者的5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-lo)c.760g＞a(e254k)位點情況進而早期評估食管癌發病風險的試劑盒。
背景技術：
：食道鱗狀細胞癌(esophagealsquamouscellcarcinoma，escc)是我國一種常見的上消化道惡性腫瘤，在國人的惡性腫瘤死亡率中位居第四位。上世紀70年代，在全國范圍內實施了惡性腫瘤普查，確立河北磁縣、河南林縣、山西陽泉、四川鹽亭、廣東潮汕和江蘇淮安等地區為中國食管癌六大高發區。內蒙赤峰地區是我國北方食管癌較高發地區。我們的前期流行病學調查結果表明，該地區食管癌發病具有鮮明的蒙古族高發的特點。尤其是蒙古族牧民集中居住的牧區，食管癌的發病率最高，是危害當地蒙古族牧民的最主要惡性腫瘤，男性發病率遠遠高于女性。值得特別注意的是，赤峰地區蒙古族人發生食管癌有明顯家族聚集性，比如我們初步的調查結果顯示，在赤峰翁牛特旗一個牧場的200多戶蒙古族居民中，近十年來發現有20余人患食管癌，情況十分嚴重，其中一個典型的例子是一家兄弟三人均因罹患食管癌死亡。早期評估食管癌發病風險對于臨床早期診斷和預防具有重要意義。一些食管癌若早期發現是可以完全治愈的，因此，食管癌重在早期診斷。然而，目前除了做x線鋇餐檢查和胃鏡外還沒有一種簡便無創的方法可以早期評估食管癌發病風險。做胃鏡對患者來說比較痛苦，是一種有創性的檢測手段，很多患者因為害怕做胃鏡而錯失早期診斷的機會。對于臨床癥狀尚不明顯的食管癌早期評估來說，需要一種快速簡便且無創的檢測方法來評估食管癌的發病風險，本發明所采用的試劑盒能夠快速檢測出與食管鱗癌高度相關的5-loe254k位點，與經典的測序法和酶切法相比具有簡便、經濟、快速等特點，與胃鏡法相比對人體無傷害，屬于無創性的早期檢測方法，并且本發明所基于的等位基因特異性pcr法是一種成熟可靠、可在基層醫院廣泛使用的方法。本試劑盒中5-脂氧合酶的背景介紹如下。花生四烯酸和白三烯等脂類物質代謝異常在食管癌的發生發展中發揮著十分重要的促進作用，而5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-lo)是機體催化花生四烯酸生成生物活性分子從而影響細胞信號傳導及代謝的關鍵酶。人類的5-lo基因定位于第10號染色體p11.2亞帶，長度超過82kb，包括14個外顯子和13個內含子，5-lo蛋白包含674個氨基酸，編碼蛋白的分子量約為72～80kd。其cdna760位的g突變成a，760g＞a位于第六個外顯子中，在基因庫中也有記載，其對應的254位的氨基酸由帶負電荷的谷氨酸(e)突變成帶正電荷的賴氨酸(k)，這一單核苷酸多態性(snp)引起了電荷的改變對酶的功能或者該酶與其他酶之間的相互作用都有可能受影響。有研究證明我國人群中5-脂氧合酶基因e254k多態性與哮喘的發生有關，與食管癌的發生是否有關尚不清楚。該研究的目的在于檢測該多態性在食管癌患者中的分布情況，同時與正常人群中的分布情況進行對比，進而揭示該多態性與食管癌發生的關系。該研究證實，5-locdna第760位的堿基g突變成堿基a，使相應的254位氨基酸由谷氨酸glu(e)變成了賴氨酸lys(k)。該突變與食管癌的發生高度相關，該結果為家族性食管癌發生提供了一個新的機制。基因突變位點的檢測方法很多，經典的方法是測序法。測序法需要先對目的片段進行pcr擴增、電泳、切膠、純化、測序反應和測序。而且測序儀價格昂貴，很多醫院不具備購買的條件。本發明采用的等位基因特異性pcr(as-pcr)法可快速檢測5-lo的snp位點，快速直接進行分型，不需要測序和酶切，具有經濟、快速、簡便、易行等特點，是一種成熟可靠、可在基層醫院廣泛使用的方法。as-pcr技術的關鍵在于引物設計，本發明采用自行設計的引物和檢測條件，可快速檢測到5-loc.760g＞a(e254k)位點情況。雖然x線鋇餐和胃鏡檢查是常用的食管癌檢查手段，但這類檢查屬于有創性的，不適合經常進行。本發明通過對5-loc.760g＞a(e254k)位點的檢測，可以對食管癌進行早期風險評估，對高危組要進行早期預防。而且本發明是通過檢測外周血的基因組dna，屬于無創性的檢測，更容易被患者接受。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是提供一種基于等位基因特異性pcr方法早期評估食管癌發病風險的試劑盒。其中，上述的等位基因特異性pcr方法主要是檢測人外周血基因組dna。其中，上述試劑盒主要包括針對5-脂氧合酶(5-lo)c.760g＞a位點設計的上游等位基因特異性引物2條(野生型引物p1，5′-cgctgcacagagctgcctg和突變型引物p2，5′-cgctgcacagagctgccta)，下游引物1條(p3，5′-cgcaattcctcctctgatgt)，和一對內參照引物(p4，5′-agaggcgaagttctccaaca和p5，5′-aacagggacggagagtgatg)。其中，上述試劑盒還包括：pcrmix(北京百泰克公司)、dnamarkeri(北京百泰克公司)和滅菌水。附圖說明圖1是as-pcr法檢測食管癌患者的5-loc.760g＞a位點的電泳圖(每個樣本分a和b兩管，a管加的是該位點野生型引物，b管是突變型引物，若目的條帶a有b沒有，是野生型(gg)，屬低危組；只要b管中出現目的條帶，就屬于高危組。a和b管都有目的條帶，則基因型為ga型；只在b管有目的條帶，則基因型為aa型)。第1泳道為markeri，條帶從上到下為600、500、400、300、200、100。第2和3泳道為一個樣本，結果顯示為a管除了有600bp的內參照條帶外還有301bp的目的條帶，而b管未出現目的條帶，說明為野生型gg。第4和5泳道為一個模板，也是野生型gg。第6和7泳道為一個樣本，結果顯示a管和b管，除了有內參照條帶外都出現了目的條帶，說明是雜合突變型ga；第8和9泳道為一個樣本，也是雜合突變型ga。圖2是對as-pcr法進行測序驗證，以6s為引物對樣本m8有意鏈進行測序的結果。結果與as-pcr檢測結果一致，樣本m8為雜合突變型ga。圖3是以6a為引物對同一個樣本m8反義鏈進行測序的結果。與圖2雙向測序結果一致。圖4是以6s為引物對樣本m19有意鏈進行測序的結果。結果與as-pcr檢測結果一致，樣本m19為野生型gg。圖5是以6a為引物對同一個樣本m19反義鏈進行測序的結果。與圖4雙向測序結果一致。具體實施方式我們收集了160例食管癌患者和204例正常對照的外周血。下面結合附圖實施例作進一步詳細描述。等位基因特異性pcr法步驟如下。(1)分a和b兩管，兩管的不同點在于a管中加入上游野生型的引物p1，b管中加的是上游突變型引物p2，其余都相同。(2)pcr反應體系：a、b管中加入成分見下表。a管b管滅菌水：5μl滅菌水：5μlpcrmix：10μlpcrmix：10μldna模板：1μl(100-150ng/μl)dna模板：1μl(100-150ng/μl)p1：1μl(10μm)p2：1μl(10μm)p3：1μl(10μm)p3：1μl(10μm)p4：1μl(10μm)p4：1μl(10μm)p5：1μl(10μm)p5：1μl(10μm)total：20μltotal：20μl(3)pcr反應條件為：95℃預變性5分鐘，然后按95℃30秒、56℃30秒、72℃1分鐘循環35次，末次循環后72℃延伸10分鐘，4℃保存。(4)瓊脂糖凝膠電泳：pcr擴增后取pcr產物5-10μl，進行2％的瓊脂糖凝膠電泳，鑒定pcr擴增的結果，取5μldnamarkeri作為標記，條帶分別為600、500、400、300、200、100。(5)eb浸染：電泳后的凝膠取出放入eb浸泡液中，eb是致癌物，戴一次性手套小心操作。有eb的手套不能碰其他任何東西，包括鼠標、電腦等，用完后放入指定的垃圾箱。(6)放射自顯影：將浸染后的膠取出，放入凝膠成像儀的指定位置，打開設備，拍照，保存兩種格式，一種是jpg格式，一種是自動成像格式。(7)分析電泳結果：若目的條帶a有b沒有，是野生型(gg)，屬低危組；a和b管都有目的條帶，則基因型為ga型；只在b管有目的條帶，則基因型為aa型。只要b管中出現目的條帶，就屬于高危組。如圖1。數據的統計學處理。食管癌組與正常對照組間5-loc.760g＞a(e254k)位點基因頻率和基因型頻率的比較采用t檢驗方法；p＜0.05被認為有統計學顯著性。統計結果顯示：在食管癌患者中5-loc.760g＞a(e254k)位點基因突變發生的頻率是正常對照組的7.19倍，p＜0.05有顯著性差異。測序驗證：另外設計一對引物，分別在snp位點的上下游，5-lo6s：5`-gcagggactctgctcttagg，5-lo6a：5`-cgcaattcctcctctgatgt。測序驗證結果顯示：as-pcr法檢測與測序法檢測結果一致率為100％。結論1：檢測5-脂氧合酶e254k多態性在食管癌患者中的分布情況，同時與正常人群中的分布情況進行對比，研究結果顯示該多態性與食管癌發生有關。結論2：臨床上早期評估個體食管癌發病風險時，用as-pcr法檢測5-loc.760g＞a(e254k)位點，若目的條帶a管有b管沒有，是野生型(gg)，屬低危組；a和b管都有目的條帶，則為雜合突變基因型為ga型；只在b管有目的條帶，則為純合突變基因型為aa型。只要b管中出現目的條帶，就屬于高危組。結論3：用as-pcr法可快速檢測5-lo的e254ksnp位點，具有經濟、快速、簡便、易行等特點，是一種成熟可靠、可在基層醫院廣泛使用的方法。當前第1頁12