本發明屬于基因工程和生物發酵技術領域，具體地說，涉及一種利用食品安全級的微生物重組谷氨酸棒桿菌發酵生產四氫嘧啶的方法。
背景技術：
四氫嘧啶(ectoine)是一種環狀的氨基酸衍生物，是許多耐鹽微生物為維持滲透壓平衡而在細胞內產生的一種相容性溶質，對于細胞/酶的抗逆性具有重要的作用，可以緩解高滲、高溫、凍融、干燥、輻射和化學試劑對蛋白、核酸、生物膜及整個細胞的毒害作用。因此四氫嘧啶目前已被廣泛地應用于化妝品、醫藥、酶制劑領域，具有廣闊的市場前景。
目前，四氫嘧啶的生產方法主要通過嗜鹽微生物特別是鹽單胞菌的高密度發酵來獲得。這個過程通過采用被稱為“細菌擠奶法”的方式進行生產，即先在高滲透壓下培養細胞并在胞內積累四氫嘧啶，然后通過低滲沖擊刺激四氫嘧啶從胞內釋放到胞外，然后再重復進行高滲培養、低滲沖擊，以獲得較高濃度的四氫嘧啶。這個過程操作繁雜，且需要在高鹽條件下進行培養，因此對設備要求高，導致其生產價格十分昂貴。
目前正在開發的一些工藝采用重組大腸桿菌進行發酵，以葡萄糖或者天冬氨酸為底物在低鹽的條件下即可獲得較高濃度的四氫嘧啶，簡化了四氫嘧啶的生產工藝。然而，大腸桿菌會分泌內毒素，而四氫嘧啶主要應用于化妝品及醫藥領域，因此必須去除內毒素，使得整個分離過程較為復雜，增加了生產成本。因此開發安全高效的重組微生物使其能夠在低鹽的條件下連續生產四氫嘧啶且不會分泌內毒素，具有重要的應用價值。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種生物安全度高、產量高、操作簡便且成本低廉的利用重組谷氨酸棒桿菌發酵生產四氫嘧啶的方法，以克服現有技術的不足。
四氫嘧啶的生物合成途徑如圖1所示。本發明主要改造方案為：在谷氨酸棒桿菌中過表達解除反饋抑制的天冬氨酸激酶基因lysc(序列如seqid1所示)，強化流向天冬氨酸途徑的碳流量，該基因包含定點突變q298g且包含一個強啟動子p1；通過置換二氫嘧啶二羧酸合成酶的啟動子(序列如seqid2所示)弱化二氫嘧啶二羧酸合成酶的活性，降低流向賴氨酸的碳流量；過表達四氫嘧啶合成途徑相關基因ectabc(序列如seqid1所示)；將該菌株在發酵罐中進行發酵培養獲得四氫嘧啶。
本發明首先提供一種重組谷氨酸棒桿菌，含有突變后的lysc基因及啟動子，突變后的dapa基因及啟動子和ectabc基因；
所述突變后的lysc基因及啟動子的序列如seqidno.1所示；
所述突變后的dapa基因及啟動子的序列如seqidno.2所示；
所述ectabc基因的序列如seqidno.3所示。
本發明的重組谷氨酸棒桿菌，通過以下方法制備得到：
(1)將解除反饋抑制的天冬氨酸激酶基因lysc和強啟動子片段p1連接到自殺性質粒上，獲得的重組質粒，將該重組質粒電轉化入谷氨酸棒桿菌中，得到重組菌c.glutamicumlysc-p1-298；
(2)通過啟動子置換弱化重組菌c.glutamicumlysc-p1-298中的二氫嘧啶二羧酸合成酶基因dapa的表達，得到重組菌c.glutamicumlysc-dap；
(3)在重組菌c.glutamicumlysc-dap中轉入能夠過表達四氫嘧啶合成途徑相關基因ectabc的表達載體，構建得到重組菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc。
其中，步驟(1)是將lysc1，lysc2，lysc3和強啟動子片段p1連接到自殺性質粒上，所述lysc1，lysc2，lysc3分別通過引物對seqidno.5-6，seqidno.7-8，seqidno.9-10以谷氨酸棒桿菌基因組為模板pcr擴增得到。
所述強啟動子片段p1，其序列如seqidno.4所示，所述自殺性質粒為pk18mobsacb。
步驟(2)是將dap1和dap2片段連接到自殺性質粒上，獲得的重組質粒；
所述dap1和dap2片段分別通過引物對seqidno.11-12，seqidno.13-14以谷氨酸棒桿菌基因組為模板pcr擴增得到。
步驟(3)是將ectabc基因連接到表達載體pxmj19上，獲得的重組質粒命名為pxmj-ectabc，將該重組質粒電轉化入步驟(2)的重組菌c.glutamicumlysc-dap中；所述ectabc基因通過引物對seqidno.15-16以halomonaselongatadsm2581(購自dsmz)基因組為模板pcr擴增得到。
本發明的重組谷氨酸棒桿菌的培養基中含有氯霉素。具體地，含有5mg/l氯霉素。
本發明提供了重組菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc在生產四氫嘧啶中的應用。
本發明提供了利用權利要求重組谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc發酵生產四氫嘧啶的方法，以含可發酵糖的原料為底物，接入重組谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc，發酵溫度28-40℃，ph值5-8，溶氧值10％進行發酵。
所述含可發酵糖的原料為糖蜜，蔗糖、葡萄糖、淀粉水解液、玉米漿、木糖、甘露糖或甘油；發酵溫度為32-35℃，ph值6-7，在發酵3-5h時添加終濃度為0.01-1mm的iptg。
發酵過程中流加碳源，以及發酵培養基中含有硫胺素和生物素。
谷氨酸棒桿菌是一種食品安全級的微生物，廣泛應用于氨基酸的生產，比如谷氨酸和賴氨酸的生產。谷氨酸棒桿菌不會分泌內毒素，因此利用谷氨酸棒桿菌來發酵生產四氫嘧啶解決了生物安全性的問題，大大簡化了后提取工藝。本發明所構建的重組谷氨酸棒桿菌能夠利用葡萄糖等廉價原料在低鹽的條件下連續發酵生產四氫嘧啶，大大簡化了四氫嘧啶的發酵過程。同時谷氨酸棒桿菌能夠利用不同的廉價原料進行發酵，例如利用廢棄糖蜜、蔗糖、淀粉水解液等，同時還可以使用廉價的玉米漿作為營養成分替代昂貴的酵母粉，因此可以進一步降低原料的成本。同時本發明的重組谷氨酸棒桿菌解決了生物安全性問題，簡化了后提取工藝，具有良好的市場應用前景。
附圖說明
圖1為四氫嘧啶的生物合成途徑以及本發明的主要改造位點。
具體實施方式
以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的化學試劑均為常規市售試劑，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
實施例1過表達解除反饋抑制的天冬氨酸激酶基因lysc
四氫嘧啶的直接合成前體是天冬氨酸，從天冬氨酸到四氫嘧啶合成途徑的第一個酶天冬氨酸激酶受到賴氨酸和蘇氨酸的反饋抑制。因此，本發明首先通過在天冬氨酸激酶基因中引入定點突變q298g來解除以賴氨酸和蘇氨酸對該酶的反饋抑制，并在該基因(lysc)前插入一個強啟動子p1(序列為5’-ggtgcacaaagcaaaagctgggtacctctatctggtgccctaaacgggggaatattaacgggcccagggtggtcgcaccttggttggtaggagtagcatgggatcc-)(seqidno.4)來強化該基因的表達。具體的實施過程如下：
以谷氨酸棒桿菌mb001(baumgartmetal，applenvironmicrobiol79:6006-15(2013))的基因組為模板，以引物lysc-1-f(aggaaacagctatgacatgattacgtttcgcccagaaccaagtagcc)和lysc-1-r(cccagcttttgctttgtgcacctttcgatctacgt)為引物進行pcr，獲得基因片段lysc1約1.0kb并進行pcr產物純化。以谷氨酸棒桿菌mb001的基因組為模板，以引物lysc-2-f(catgggatccatggccctggtcgtacagaa)和lysc-2-r(gagacgttgcccagaaccatgtcaatgttgatttctgca)為引物進行pcr，獲得基因片段lysc2約0.9kb并進行pcr產物純化。以谷氨酸棒桿菌mb001的基因組為模板，以引物lysc-3-f(acatggttctgggcaacgtctcttctgtagaagacg)和lysc-3-r(tgcatgcctgcaggtcgactacataaggtccgacatcgcct)為引物進行pcr，獲得基因片段lysc3約1.0kb并進行pcr產物純化。以本實驗室構建的質粒pec-yqhd-pducdegh(huangetal.,scientificreports7:42246,2017)為模板，以引物p1-f(ggtgcacaaagcaaaagctgggtacctctatctggt)和p1-r(ccagggccatggatcccatgctactcct)為引物進行pcr，獲得基因片段p1約0.1kb并進行pcr產物純化。將谷氨酸棒桿菌自殺性質粒pk18mobsacb(journalofbiotechnology104(2003)287-299)用ecori/xbai進行雙酶切，利用gibsonassembly試劑盒(neb)將lysc1,lysc2,lysc3和p1片段一步連接到pk18mobsacb上，獲得的重組質粒命名為pk18-lysc。利用電穿孔儀(伯樂)將pk18-lysc通過電轉化轉入到谷氨酸棒桿菌mb001中，電擊條件為電壓2.5kv，電阻200ω，電容25μf(電擊杯寬度為2mm)，通過兩次篩選獲得重組菌。一次重組菌在含25mg/l的卡那霉素lb平板上篩選。該重組菌進一步在液體lb培養基里過夜培養，之后在含有100g/l的蔗糖lb平板上進行二次篩選。利用p1-1-f和lysc-3-r為引物進行菌落pcr，正確的重組子能克隆出約2kb的片段，該重組菌命名為c.glutamicumlysc-p1-298。該重組菌的關鍵特征是包括突變后的lysc基因及啟動子，序列seqidno.1所示，在該核酸序列的第998-1000位堿基發生定點突變q298g。該重組菌可以利用80g/l的葡萄糖產18g/l的賴氨酸，而野生菌株mb001不能產賴氨酸，說明在本實施例中，lysc基因修飾是成功的，即葡萄糖能夠流向賴氨酸和四氫嘧啶共同的代謝支路。具體的發酵過程見實施例4。
實施例2啟動子置換弱化二氫嘧啶二羧酸合成酶基因dapa的表達
由于重組菌c.glutamicumlysc-p1-298的主要發酵產物是賴氨酸，為了使更多的底物用于四氫嘧啶的合成，進一步弱化二氫嘧啶二羧酸合成酶基因dapa的表達。
以谷氨酸棒桿菌mb001的基因組為模板，以引物dap-1-f(ctatgacatgattacgaattcagatggttttcctgaccagctt)和dap-1-r(gggaagaaggaaaccttgaactctatgagcacagg)為引物進行pcr，獲得基因片段dap1約1.0kb并進行pcr產物純化。以谷氨酸棒桿菌mb001的基因組為模板，以引物dap-2-f(ttcaaggtttccttcttccctcatttggggg)和dap-2-r(tgcctgcaggtcgactctagaggcctgtaaaggctcatttcag)為引物進行pcr，獲得基因片段dap2約1.0kb并進行pcr產物純化。將谷氨酸棒桿菌自殺性質粒pk18mobsacb(journalofbiotechnology104(2003)287-299)用ecori/xbai進行雙酶切，利用gibsonassembly試劑盒(neb)將dap1和dap2片段一步連接到pk18mobsacb上，獲得的重組質粒命名為pk18-dap。利用電穿孔儀(伯樂)將pk18-dap通過電轉化轉入到谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-p1-298中，電擊條件為電壓2.5kv，電阻200ω，電容25μf(電擊杯寬度為2mm)，通過兩次篩選獲得重組菌。一次重組菌在含25mg/l的卡那霉素lb平板上篩選。該重組菌進一步在液體lb培養基里過夜培養，之后在含有100g/l的蔗糖lb平板上進行二次篩選。利用dap-1-f和dap-2-r為引物進行菌落pcr并進行測序，正確的重組菌命名為c.glutamicumlysc-dap。該重組菌的關鍵特征是包括突變后的dapa基因及啟動子，序列seqidno.2所示。該重組菌可以利用80g/l的葡萄糖產6g/l的賴氨酸同時生產2g/l的甘氨酸。具體的發酵過程見實施例4。
實施例3過表達四氫嘧啶合成途徑相關基因ectabc
為了強化表達四氫嘧啶合成途徑的關鍵基因，人工合成了ectabc基因，序列如seqidno.3所示。將halomonaselongatadsm2581基因組以引物ectabc-f(tgcatgcctgcaggtcgactaggaggcccttcagatgaacg)和ectabc-r(ccgccaaaacagccaagctgttacagcggcttctggtcgt)為引物進行pcr，獲得基因片段ectabc約2.5kb并進行pcr產物純化。將谷氨酸棒桿菌表達質粒pxmj19(購置addgene)用ecori/xbai進行雙酶切，利用gibsonassembly試劑盒(neb)將ectabc基因片段一步連接到pxmj19上，獲得的重組質粒命名為pxmj-ectabc。利用電穿孔儀(伯樂)將pxmj-ectabc通過電轉化轉入到谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap中，電擊條件為電壓2.5kv，電阻200ω，電容25μf(電擊杯寬度為2mm)，在含5mg/l的氯霉素lb平板上篩選重組菌，該重組菌命名為c.glutamicumlysc-dap-ectabc。該重組菌的關鍵特征是包括ectabc基因，序列seqidno.3所示。該重組菌可以利用80g/l的葡萄糖產12g/l的四氫嘧啶，而實施例1和2中的菌均不能產四氫嘧啶。具體的發酵過程見實施例4。
實施例4重組谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc的發酵
將谷氨酸棒桿菌野生菌株mb001以及重組菌株c.glutamicumlysc-p1-298，c.glutamicumlysc-dap，c.glutamicumlysc-dap-ectabc在lb平板上過夜培養。從該新鮮平板上單菌落接種到含有30ml種子培養基的250ml帶檔板搖瓶中，32℃，200rpm培養12小時。
種子培養基的配方包括(g/l)：葡萄糖40，(nh4)2so45.0,k2hpo41.5,mgso41.0,mnso40.005,feso40.005,玉米漿30。c.glutamicumlysc-dap-ectabc培養基中額外添加5mg/l氯霉素。
以10％的接種量將種子液接種到2l發酵培養基當中，發酵采用5l的發酵罐，控制溫度為32℃，通氣量為1vvm，調整轉速使得溶氧水平保持在10％以上，通過流加氨水控制ph值穩定在7.0左右。
發酵培養基配方包括(g/l)：葡萄糖80，(nh4)2so430.0,k2hpo42.5,mgso41.0,mnso40.010,feso40.010,玉米漿15，生物素0.0005,鹽酸硫胺素0.005。c.glutamicumlysc-dap-ectabc培養基中額外添加5mg/l氯霉素，并在發酵3h時添加1mm的iptg。
發酵72小時，通過液相色譜檢測產物濃度。野生菌株mb001不產氨基酸及四氫嘧啶，實施例1得到的重組菌c.glutamicumlysc-p1-298產18g/l的賴氨酸但不產四氫嘧啶。實施例2得到的重組菌c.glutamicumlysc-dap產6g/l的賴氨酸及2g/l的甘氨酸但不產四氫嘧啶。實施例3得到的重組菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc產2g/l的賴氨酸及12g/l的四氫嘧啶。
可見，在本申請實施例1和2的基礎上，進一步構建的重組菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc能夠發酵底物生產四氫嘧啶，與現有技術的其他菌相比，生產四氫嘧啶的量在同一個水平級上，但由于本發明的重組菌谷氨酸棒桿菌c.glutamicumlysc-dap-ectabc為食品安全級，不會產生內毒素，省去了在后續工程去除毒素分離提純產物的繁瑣步驟，不僅提高了產品的安全性，同時極大地降低了生產成本。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的范圍。
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<110>清華大學
<120>一種利用重組谷氨酸棒桿菌發酵生產四氫嘧啶的方法
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