本發明屬于生物技術領域,涉及一種糞便dna快速提取試劑盒。
背景技術:
結直腸癌是胃腸道中常見的惡性腫瘤,早期癥狀不明顯,隨著癌腫的增大而表現排便習慣改變、便血、腹瀉、腹瀉與便秘交替、局部腹痛等癥狀,晚期則表現貧血、體重減輕等全身癥狀。源發在結腸部位的癌細胞稱為結腸癌,源發在直腸的稱為直腸癌;兩器官都受影響則稱為結腸直腸癌。它是目前全球普遍可見的消化系統癌癥,發病率近年來不斷上升,其發病率和病死率在消化系統惡性腫瘤中僅次于胃癌、食管癌和原發性肝癌。結直腸癌也是目前最可預防的腫瘤之一。它通常起源于結腸或直腸上皮的非癌性新生物“息肉”。如果通過篩查,早期發現并摘除,就能阻止它變成腫瘤。醫學界認為,如果及早發現,腸癌是最易治愈的癌癥。
目前,常用的結直腸癌早期診斷的方法有結腸鏡檢測、大便隱血檢測、糞便rna檢測、糞便dna檢測。結腸鏡檢測法具有侵入性、腸道穿孔風險高的缺陷。大便隱血檢測是非入侵性的,但是檢測前需要控制飲食,而且檢測靈敏度低、特異性差易出現誤差。糞便dna檢測是無創的檢測技術,但糞便dna提取困難,操作繁瑣,檢測成功率低。所以迫切需要一種能夠快速提取糞便dna的試劑盒。
通過糞便dna檢測進行結直腸癌早期診斷,就要對糞便中的人基因組dna進行高效提取。但是還有許多難題需要解決,比如,在樣本的采集和分離過程中往往會因為dna酶的降解作用,各種酶阻抑劑(粘液、細菌和食物殘渣等等)和膽鹽的存在導致從糞便里提取出來的人體dna產量非常少或者提取出的dna雜質多而難以用于pcr擴增。為了解決這些難題,近年來也有許多的研究,通過多組提純和擴增方法對照來改進dna樣本的質量。目前,糞便人基因組dna的提取方法有:直接提取糞便中人基因組dna和富集腸壁脫落細胞后提取人基因組dna兩類。其中直接提取糞便中人基因組dna的方法又包含:柱式離心管吸附提取法以及電泳捕獲法。
柱式離心管吸附提取法:雖然此方法操作簡單,但特異性差,且樣本處理量少。
電泳捕獲法:處理量大、提取的dna濃度和純度高,但此法需要特殊的電泳裝置且提取時間長。
富集腸壁脫落細胞后提取人基因組dna:特異性好,提取的dna濃度高,但提取過程細胞損失大,產量低。
技術實現要素:
本發明的目的在于針對上面現有的技術缺陷,提出的一種快速、操作簡單、高特異性、可配合中山大學達安基因股份有限公司的核酸自動提取儀smart32進行自動提取的糞便dna快速提取試劑盒。
糞便dna快速提取試劑盒,包括:糞便處理液、探針磁珠、蛋白酶k、裂解結合液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液、96孔板、封板膜、磁棒套。
優選的,其中糞便處理液,是由1~3m異硫氰酸胍、5%~15%chelex-100、1~3mbsu、0.05~0.2midu、0.3~0.8mglycine、0.1~0.3mbestain組成。
優選的,探針磁珠的磁性強,1-3秒即可徹底吸附,易分散,輕輕振蕩即可實現單分散;表面結合了特異性探針,可特異性的和人基因組結合,更大程度的提高了核酸的純度。
優選的,蛋白酶k的濃度為1~3mg/ml,不能直接和裂解結合液接觸。
優選的,裂解結合液是由1~3m胍鹽、4~7m三羥基氨基甲烷鹽酸鹽、2.5~4m十四烷基硫酸鈉混合而成。
優選的,洗滌液1含有1~3m的胍鹽溶液,并含有體積濃度為35%~50%的醇溶液。
優選的,洗滌液2含有0.5~2m三羥基氨基甲烷鹽酸鹽,并含有體積濃度為35%~50%的醇溶液。
優選的,洗脫液為1~3m的鹽酸鹽溶液,ph:7~9。
優選的,糞便dna快速提取試劑盒中的探針磁珠、裂解結合液、洗滌液1、洗滌液2、洗脫液、96孔板、封板膜組成了一個預分裝板。
優選的,其中的預分裝板上的排列如下:第一列(第七列)是裂解結合液,第二列(第八列)是磁珠,第三列(第九列)是洗滌液1,第四列(第十列)是洗滌液2,第五列(第十一列)是洗滌液2,第六列(第十二列)是洗脫液,配合磁棒套可配套自動提取儀進行提取。
其中自動提取儀所述程序的流程及原理為先在第二列(第八列)吸磁;從第二列(第八列)到第一列(第七列)進行裂解細胞釋放出核酸,磁珠和釋放出的核酸結合后;磁珠又被吸到第三列(第九列)進行洗滌,去除蛋白雜質等;磁珠又被吸到第四列(第十列)進行洗滌,去除離子等;磁珠又被吸到第五列(第十一列)再次進行洗滌,去除離子等;磁珠又被吸到第六列(第十二列)進行洗脫,將結合在磁珠上的核酸洗脫下來;最后將不含核酸的磁珠洗棄到第四列(第十列)。此時,第六列(第十二列)就是所提取的核酸,可立即用檢測或者4℃暫時保存4小時或者-20℃長期保存。
所述上機程序,具體如下表:
表1
本發明的有益效果:
本發明具有高度自動化的優勢,減少了人工操作的環節,有效地節省了時間。本試劑盒提取的核酸比傳統的核酸提取方法,具有更高的純度,且降低了成本。在配合自動化儀器下,可以實現大批量樣本的自動化提取,更能突顯出其優點。
具體實施方法
以下實施案例用于解釋本發明,而并非限制本發明。
本說明書中公開的所有特征,除非特別敘述,均可被其他等效或者類似的特征所替換。
此次實驗做了本發明與天根的糞便dna提取試劑盒(柱提法)的比較,各提取了十個同樣的樣本。
實施過程:
糞便dna快速提取試劑盒,提取步驟如下:
1.用滅菌的槍頭或者滅菌刀片取180-250mg的糞便樣本于1.5mlep管中,置于冰上;
2.往ep管加入400ul糞便處理液,在常溫下振蕩混勻,12000rpm離心10min;
3.將糞便dna快速提取試劑盒的預分裝板從試劑盒取出,并1500rpm離心1分鐘;
4.將經過糞便處理液處理后的上層水層,加入到糞便dna快速提取試劑盒的預分裝板的第一列(第七列);
5.向第一列(第七列)加入50μl蛋白酶k;
6.上機,設置好上機程序,開始提取:
表2
7.程序運行完后,即提取完成,第六列(第十二列)即為提取好的核酸;
8.用nanodrop2000c測核酸濃度,結果如下:
表3
結論:
通過表3中相同樣本不同方法的核酸提取濃度比較,可以得出本發明提取的核酸比傳統法提取的核酸更純,濃度更高,并且人工操作少,減少操作難度和時間。
上述實施例只是對本發明方案的舉例說明或解釋,而不應理解為對本發明方案的限制,顯然,本領域的技術人員可對本發明進行各種修改和變型而不脫離本發明的精神和范圍。倘若這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內,則皆應屬本發明的保護范圍。