SeZn7MT3的組成、制備方法及其在防治阿爾茨海默癥中的應用與流程

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及sezn7mt3的創新金屬蛋白的化學組成、制備方法，及其在防治阿爾茨海默癥和制備抗阿爾茨海默癥等神經退行性疾病藥物中的應用。

背景技術：

阿爾茨海默癥（alzheimer’sdisease,ad）,俗稱老年癡呆癥，是由德國學者alosialzheimer于1907年首次報道。這是一種常發于老年人群中的中樞神經系統原發性退行性疾病，目前全世界有超過五千多萬例ad患者，其臨床表現為不同程度的記憶力喪失，語言困難，定向力障礙，認知能力降低，人格及行為和感情活動異常，進行性智力障礙，最后全身衰竭，并發感染而亡。目前ad已經成為繼心臟病、腫瘤和中風之后的第四位死亡原因。ad最典型的病理特征是：大腦皮層和海馬組織內出現大量的老年斑（senileplaques,sp）、神經纖維纏結（neurofibrillarytangles,nfts）、神經元數量減少、顆粒空泡變性和慢性神經炎癥。ad的發病機理十分復雜，可能是多種因素相互作用的結果。迄今為止，其確切的發病機理還是一個未解之謎，但在近三十年的研究證據表明，淀粉樣多肽（amyloid-betapeptide,abeta）、淀粉樣前體蛋白（amyloidprecursorprotein,app）、金屬硫蛋白（metallothionein,mt3）及其所參與調節的金屬離子內穩態平衡與ad的發生、發展有著密切的聯系。

國內外已對ad的神經病理機制進行了大量的研究。70年代中期以來，大量藥理學研究集中于提高突觸裂隙中的乙酰膽堿水平，發現了一系列乙酰膽堿酯酶的抑制劑類藥物。然而，這種治療僅是緩解癥狀的治標療法。80年代中期以來，許多研究圍繞abeta的形成、聚集以及清除機制，或abeta的神經毒性機制進行。以abeta為靶標治療ad病的藥物有abeta前體蛋白app分泌酶的抑制劑、抗abeta聚集的金屬離子螯合劑和abeta的抗體等。然而，2008年lancet報道，abeta疫苗能有效地清除腦內abeta斑，但并不能阻止癡呆癥狀的發展。這一報道對圍繞abeta斑的治療研究提出了疑問。這些結果說明，abeta斑本身并不是神經細胞毒性的主要根源，可能的機制是，abeta斑在形成過程中產生的ros對神經細胞造成毒性。運用同步輻射x-射線熒光分析技術發現老年斑中有高濃度的金屬離子聚集，如銅、鐵、鋅離子的含量分別高達1.0、0.4和1.0mm。大腦中這些過渡金屬離子異常高濃度聚集及其相關的蛋白質（如abeta、tau蛋白等）異常聚集是多種神經退行性疾病的共有特征。因此，金屬離子與神經醫學高度關聯的這一領域受到科學家和神經醫學科學家的極大關注。大量研究報道顯示：腦神經中某些過渡金屬離子（cu、fe、zn）的內穩態失衡是ad病人神經元死亡的主要起因之一；腦中這些過渡金屬離子，特別是能夠進行單電子氧化還原的cu和fe離子的內穩態調節，以及有關的活性氧物種（ros）水平的調控很可能是治療ad病的有效策略。

金屬硫蛋白-3（metallothionein-3,mt3），也稱為神經生長抑制因子（gif），在人大腦中特異性表達。mt3由68個氨基酸組成，其中就包括了20個保守的半胱氨酸。它的兩個結構域含有兩個金屬簇，總共能夠結合7個二價的金屬離子。n-端beta-結構域中的m3s9和存在于c-端的alpha-結構域的m4s11。兩個結構域之間通過kks三個氨基酸連接。大腦中mt3大量分布于神經星形細胞，但是在ad患者腦中，mt3的表達量明顯下降約三分之一。mt3表達的受損可能與ad癥狀的發生或神經功能損傷有關。mt3可以將no信號轉化為zn2+信號。no通過與mt3中結合zn2+的半胱氨酸直接發生s-亞硝基反應或者與s-亞硝基硫醇發生亞硝基轉換反應，將zn2+從mt3中釋放出來。

鋅離子是大腦中的信使，大腦具有最高的鋅含量，最典型的是在灰質中可達到約150μm。大腦中處于自由離子形式的鋅大量富集在許多谷氨酸能神經末端（10-15%）。當鋅被釋放后進入突觸間隙，在突觸間隙內離子濃度可上升至毫摩爾數量級。和銅離子一樣，釋放的鋅離子在突觸間隙內與神經受體如nmda相互作用，同時也會作用于多種神經元離子通道及轉運子來調控神經信號傳導。多種鋅轉運蛋白（znts）以及mts等結合胞質中的zn離子，從而阻止游離的zn離子轉變為有毒狀態。相比于cu離子，血漿中的zn離子含量從出生后逐步下降，且ad患者的血漿中zn離子含量比同齡正常人有進一步的減少。盡管zn離子總含量與大腦年齡的老化沒有關系，然后已知一些特定區域含有高濃度的zn離子，如高谷氨酸能支配的海馬區，隨著年齡的增長表現出zn離子含量的降低。現在的多篇文獻報道，大腦補鋅可能是防治老年癡呆癥的有效策略之一。

金屬硫蛋白mt3是神經元內部zn的主要來源，近期的研究發現，結合于mt3上的zn離子能夠同abeta-cu復合物發生金屬置換，從而抑制了abeta還原cu2+所產生的氧化損傷。ad腦中zn離子失衡，可能源自zn離子輸出的抑制，abeta-cu還原活性產生的一種過氧化物4-hydroxynoenal（4-羥基巴比妥）被認為具有這種作用。小鼠動物研究指出，系統性zn離子的缺失引起了腦中zn離子的滯留，而這種作用是通過抑制胞內zn離子輸出蛋白znt1所致。

神經突觸中，mt3、abeta和銅金屬離子可能形成一種動態平衡。在znt3的作用下，zn離子和谷氨酸同時聚集于前突觸囊泡中，zn離子在突觸間隙中濃度高達0.3mm，而nmda介導的激活使銅離子在突觸后釋放，轉運到突觸間隙，隨之銅離子在突觸間隙的濃度達到毫摩爾級。反過來銅和鋅都可以抑制nmda受體的應答反應。abeta經淀粉樣蛋白前體蛋白app酶切后釋放到突觸間隙后可以與間隙內的銅發生反應，然后交聯形成可溶性的abeta聚集體甚至形成淀粉樣沉淀。mt3由鄰近的星形膠質細胞釋放進入突觸間隙，可以緩解這一不利反應的發生。神經金屬離子、abeta、mt3在突觸間隙形成一個動態平衡，這種平衡可阻止abeta在突觸間隙中形成纖維沉淀。適當的神經突觸活動可能會促進這一平衡系統，但是過度的或異常的神經活動可能對這一系統有害。調控腦神經[金屬離子-abeta-mt3]形成有益的平衡可能是治療老年癡呆癥的創新思路，對ad病的調控治療有重要意義。

維持大腦活性氧物種（ros）內穩態平衡是大腦正常生理功能的必要條件。大腦消耗人體五分之一的氧，而且抗氧化劑和相關酶的濃度相對較低又富含不飽和脂肪酸，易受氧化損傷。正常情況下，細胞可以通過調節內穩態平衡對抗氧化攻擊，但隨著年齡增長，細胞保持平衡的能力減低，導致自由基積累，線粒體功能失調，神經元損傷。氧化損傷誘發信號傳導通路，操縱細胞對壓力的反應，這個反應的表現就是ros的增加。當ros的數量超過了神經元細胞對抗的能力時就會發生氧化脅迫，進而導致線粒體機能障礙以及神經元細胞損傷。線粒體中缺乏組蛋白以及線粒體中dna修復功能的減弱都是造成線粒體易產生氧化脅迫的原因。銅離子等被認為是ad中氧化脅迫發生的重要原因。在ad病中，氧化損傷的增加不是最終的結果，而是具有起始作用。ad的初期，神經細胞盡管氧化損傷增加，但實際上仍然是處于內穩態平衡的。隨著ad病的發展及相應的ros水平的增加，abeta-金屬化合物和過度磷酸化的tau蛋白將不能有效的被去除，導致淀粉樣斑塊和神經纖維纏結的不可控地增加，而這又會導致反應活性物質的進一步增多，這種惡化的反饋機制最終造成神經元功能喪失。

銅、鐵等具有氧化還原活性的過渡金屬離子被認為是ad中氧化脅迫發生的重要原因，具有很強的介導ros產生的能力。ros內穩態調控與超氧化物歧化酶（sod）、過氧化氫酶、細胞色素c氧化酶、過氧化物歧化酶、硫氧還蛋白還原酶等硒酶等密切相關。如果這些系統功能異常，或者ros量超過了系統的負荷，堆積的ros將通過對蛋白和脂質等分子的攻擊，破壞突觸相關蛋白的功能，引起突觸功能損害。硒蛋白/酶，如hpgpx、sel-p、gpxs，具有其獨特的抗氧化作用，可防止過多ros對神經突觸機制的損害，selp基因被干擾的小鼠神經功能紊亂。硒為脊椎動物腦發育、代謝所必需，當硒攝入量不足時，它被優先供給中樞神經系統（cns）。而長期缺硒會引起腦疾病，如阿爾海茨默病（alzheimer，ad病）、癲癇、帕金森病、神經分裂癥等神經退行性疾病。亞硒酸鈉通過作用于erkmapk而抑制g-分泌酶活性、減少abeta肽產生，發揮神經保護作用。硒代甲硫氨酸（semet）能通過對gpx的調控，降低自由基的產生，調控大腦活性氧物種的穩態平衡。

以補充阿爾茨海默等神經退行性疾病大腦中缺少的金屬穩態調控蛋白mt3，增加神經營養元素鋅和硒為目的，通過生物基因工程和化學合成相結合的復合方法，制備了sezn7mt3重組金屬蛋白。在此基礎上，運用阿爾茨海默癥轉基因小鼠模型，研究了sezn7mt3在腦神經中的調控功能，研究發現，sezn7mt3可以改善阿爾茲海默癥模型小鼠的認知和記憶能力，抑制神經細胞凋亡，抑制淀粉樣蛋白沉積等，能有效阻止老年癡呆癥病情發展。因此，sezn7mt3在防治老年癡呆等神經退行性疾病方面有重要應用。

技術實現要素：

本發明提供了一種創新金屬蛋白sezn7mt3及其制備方法。該重組鋅的硒代金屬硫蛋白sezn7mt3是通過基因重組和化學合成相結合的復合方法制備。利用基因重組、生物合成金屬硫蛋白mt3，mt3中的甲硫氨酸被硒代甲硫氨酸取代，再經過化學重組，有7個金屬鋅離子與mt3蛋白配位構成重組鋅硒代金屬硫蛋白。

本發明的目的在于提供sezn7mt3的創新組成、制備方法，及其在防治阿爾茨海默癥中的應用。本發明研究表明，sezn7mt3可以調控大腦金屬離子穩態和ros穩態平衡，抑制神經細胞的凋亡，抑制淀粉樣蛋白聚集，改善認知記憶能力，具有明顯的抗阿爾茨海默癥發展的作用，可用于制備抗阿爾茨海默癥藥物。

本文提及人源mt3，為特定蛋白質名稱，如不加說明，均與多數公開文獻及ncbi數據庫、歐洲基因數據庫一致。mt3（metallothionein3）又稱神經生長抑制因子（neuronalgrowthinhibitoryfactor），含有68氨基酸殘基，其genbank名為：eaw82868.1.

具體實施方式

下面通過實施例，具體說明本發明的內容。在本發明中，以下所述的實施例是為了更好地闡述本發明，并不是用來限制本發明的范圍。

實施例1：sezn7mt3的制備

所有生物化學試劑、試劑盒，除特別說明外，均購自sigama或invitrogen公司。

（1）smt-mt3質粒構建

人源性金屬硫蛋白mt3和融合標簽蛋白基因smt3購自廣州福能基因公司。基因載體質粒mbpht-mcherry-2購自invitrogen公司，基因引物合成由上海杰瑞生物技術公司完成，利用設計的引物p1、p2（擴增smt3基因）和p3、p4（擴增mt3基因）擴增出pcr產物。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠檢測驗證并膠回收正確的片段。產物1和產物2按相同濃度比例混合后作為模板，利用p1和p4引物擴增出smt3-mt3序列，其5’端帶有bamhi酶切位點ggatcc，3’端帶有hindiii酶切位點aagctt。設計的擴增引物如下：

p1:5’-cgcggatccatggctagcatgtcggactc-3’

p2:5’-ggcaggtctcagggtccataccaccaatctgttctc-3’

p3:5’-gagaacagattggtggtatggaccctgagacctgcc-3’

p4:5’-cgcaagctttcactggcagcagctgcac-3’

分別將載體mbpht-mcherry-2和擴增的smt3-mt3基因序列用bamhi和hindiii內切酶，在37℃雙酶切6小時，用1%瓊脂糖凝膠檢測驗證酶切成功，膠回收酶切片段。酶切的大小片段按1：3混合，用t4連接酶在16℃連接8小時，連接產物轉化到top10克隆感受態細胞，挑取陽性克隆進行pcr鑒定和測序證明，成功構建了融合蛋白smt3-mt3表達質粒。

（2）野生型semt3蛋白的生物表達

將構建的smt3-mt3表達質粒轉化入宿主菌bl21（de3）中，挑取單菌落于3mllb培養基中，37℃下搖床培養8小時后以1：100的比例接入50ml的lb培養基中，在37℃搖床中培養6小時后,離心收集菌體，棄掉培養基水溶液，然后用m9培養基懸浮后加入到m9培養基中（1：100的比例接入m9培養基中，培養基均含有100μg/ml氨芐青霉素鈉）。37℃200rpm搖床培養至od值為0.6~0.8時，加入iptg誘導劑（終濃度0.5mm）和硒代甲硫氨酸（每升m9培養基15mg硒代甲硫氨酸）,于20℃過夜表達。

（3）semt3蛋白的純化

用高速離心機離心收菌，加tris緩沖液（20mmtris-hcl，500mmnacl，10%甘油，5mmβ-巰基乙醇，ph=7.5）懸浮（1ml/g菌體），加少量溶菌酶、dna酶、1%pmsf，攪拌溶菌并用超聲破碎機破菌，然后，用高速離心機離心（12000rpm、離心30min），取上清液穿流已經平衡好的親和ni-nta柱，使得帶有his標簽的融合蛋白掛柱。用含20mm咪唑的tris緩沖液洗脫雜蛋白，至考馬斯亮藍檢測不變色為止。用含200mm咪唑的tris緩沖液洗脫融合蛋白。洗脫的融合蛋白裝入透析袋中透析，透析液為tris緩沖液，每次1l，每隔6小時換液，共換三次，之后按1%的比例加入sumo酶酶切6小時，酶切產物穿流已經平衡好的ni-nta柱，共穿流三次除去標簽蛋白及sumo酶，再用superdex-g75凝膠分子篩進一步除去雜蛋白，純化得到的semt3蛋白經15%sds－page膠檢測純度達98%以上。

（4）sezn7mt3的金屬重組

取2mlsemt3蛋白溶液（5mg/ml），加入dtt至終濃度為5mm，4℃還原2小時。加入6m的hci溶液調節ph至l-2，酸化l小時后，過superdexg-25柱除去雜金屬離子，用ph2.0的hci溶液洗脫mt3蛋白。流出液用紫外光譜儀檢測，收集。脫金屬的apo-semt3蛋白溶液脫氣后立即載入厭氧手套箱中，加入dtt至終濃度為5mm，加20倍于蛋白濃度的zncl2，慢慢滴加2m的tris堿調節ph至8-9，室溫下放置過夜，然后透析去除過剩的鋅離子，蛋白濃縮后得到sezn7mt3。

（5）sezn7mt3的性質表征

semt3蛋白濃度標定方法：采用2，2’-二硫二吡啶(2-pds)比色法。原理是利用2，2’一二硫二吡啶氧化蛋白中的巰基，形成的產物2-硫代吡啶在343nm處有敏銳吸收。取10μl蛋白溶液，加入到500μl測定液中（2mm2，2’一二硫二吡啶，1mmedta，0.2m乙酸鈉，ph4.0），混勻后室溫下靜置5分鐘，用紫外光譜儀測量343nm吸光度值并用比爾朗伯定律(lamber-beerslaw)計算蛋白質中疏基（-sh）的濃度。c(-sh)=a343/(ε343·l)，其中a343為反應產物（2一硫代吡啶）在343nm的吸光度，ε343為反應產物在343nm的摩爾消光系數(7.06×103m^-1)，l為光徑長度(cm)。由于金屬硫蛋白中含有多個巰基，所以用測得的疏基濃度除以疏基數即可得到蛋白的濃度。

sezn7mt3金屬含量測定：取一定量的重組好的蛋白，加少量濃硝酸于65℃硝化過夜，稀釋10倍后在電感耦合等離子體發射光譜儀（icp-oes）上測定金屬zn和se的含量。結果顯示重組后每摩爾semt3蛋白含有的zn為7±0.3摩爾,se為1±0.2摩爾。

（6）sezn7mt3內毒素的去除

sezn7mt3（分子量約7kd）先用10kd的超濾膜截留聚集態的內毒素（lps），再用polymyxinb親和柱除去殘留的內毒素。

實施例2：阿爾茨海默癥小鼠模型及sezn7mt3的藥效檢測

c57普通小鼠，雄性，體重24-26g，5月齡，spf級，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[實驗動物質量合格證號：scxk（滬）2007-0005]。app/ps1轉基因小鼠購自北京中科澤晟生物技術有限公司，5月齡，體重24-26g。所有小鼠均自由覓食和飲水，在室溫（23±2）℃下飼養。飼料及水均經高壓滅菌處理，全部實驗飼養過程為spf級。實驗鼠隨機均分為3組，每組10只小鼠。分別為a：正常c57小鼠組，b：app/ps1轉基因小鼠，陰性對照組（生理鹽水組）；c：sezn7mt3給藥組，app/ps1轉基因小鼠。

受試藥物名稱：sezn7mt3；

溶媒：生理鹽水；

配制方法：臨用前用生理鹽水溶液配制成所需濃度的溶液。

給藥方式：小鼠腦室給藥。實驗動物為app/ps1二轉基因小鼠，正常鼠用c57小鼠。使用alzet微滲泵model2006，進行6周的緩釋給藥。給藥部位為側腦室，埋管時使用立體定位儀精確定位（以前囟為原點，左側或右側1.0mm，后側0.4mm，深度0.3mm），給藥劑量為2mg/kg/天，給藥6周后取血清和腦組織。

實施例3：用morris水迷宮驗證阿爾茨海默癥小鼠認知能力

實驗鼠隨機均分為2組，每組10只小鼠。分別為a：app/ps1轉基因小鼠；b：sezn7mt3給藥組，app/ps1轉基因小鼠。

裝置:圓形水池，直徑1m，高50cm，水深30cm，池底白色，水溫保持在23±2℃；池壁上標記四個等距離點n、e、s、w作為試驗的起始點，分水池為四個象限，在第三象限中央放置平臺(平臺與池壁圓心距離相等)；沒于水下1cm，使平臺不可見。水池周圍貼有豐富的參照線索(不同顏色三角形、四方形、圓、菱形置于各個象限)且保持不變，供小鼠用來定位平臺。定位航行試驗:試驗共歷時6天，每天定于固定時間訓練4次。訓練開始時，將平臺置于第一象限，從池壁四個起始點的任一點將小鼠面向池壁放入水池。自由錄像記錄系統記錄小鼠找到平臺的時間和游泳路徑，4次訓練即將小鼠分別從四個不同的起始點（不同象限）放入水中。小鼠找到平臺后或90秒內找不到平臺(潛伏期記為90秒)，則由實驗者將其引導到平臺，在平臺上休息10秒，再進行下一次試驗。

空間探索試驗：定位航行試驗結束24h后，撤除站臺。然后將小鼠由第三象限放入水中，記錄鼠在180s內的游泳路徑，記錄鼠在目標象限（第三象限）的停留時間和穿越原站臺所在位置的次數，觀察受試鼠的空間定位能力。數據用spss10.0軟件進行處理，采用單因素方差分析（one-wayanova）檢驗比較給藥效果的顯著性。

結果表明：sezn7mt3治療的阿爾茨海默癥小鼠具有認知能力改善的現象。相比ad鼠對照組，給藥組ad鼠在第三象限停留時間和穿越原站臺所在位置的次數幾率平均提高了25%以上，說明sezn7mt3能有效阻止治療的阿爾茨海默癥小鼠病情發展。

實施例4：sezn7mt3對阿爾茨海默癥小鼠腦神經細胞的調控

ad鼠給藥6周后，取小鼠腦組織，在4％多聚甲醛中固定、脫水、石蠟包埋，在切片機上切成4微米厚的組織切片，然后用蘇木精和曙紅（he）染，在光學顯微鏡下（leica,germany）觀察海馬體ca1區的細胞形態）。實驗結果如圖1所示（a：為正常鼠對照組，b：為ad鼠模型組，c：為ad鼠模型腦室定位緩釋sezn7mt3給藥組）。ad模型鼠腦組織ca1區的細胞變形皺縮，觀察不到染色質及核糖體，給藥sezn7mt3后細胞形態趨于正常。使用sezn7mt3后，能夠抑制小鼠大腦神經細胞的退化變性，調控神經細胞恢復正常功能。

實施例5：sezn7mt3抑制阿爾茨海默癥小鼠腦淀粉樣蛋白聚集

本實驗為硫黃素s染色實驗，實驗流程為：ad鼠給藥6周后，取小鼠腦組織，固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，tbs洗三次，0.3%硫黃素s（溶于50%乙醇）滴于組織上，室溫孵育10min，50%乙醇洗三次，tbs清洗，陰干，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。實驗結果如附圖2所示。硫磺素s本身自帶綠色熒光，能特異性的與成熟的abeta淀粉樣蛋白結合，用于標記腦組織中淀粉樣蛋白的含量和分布，評價阿爾茲海默癥的病理狀況。實驗結果如圖2所示（a為正常鼠對照組，b為ad鼠模型組，c為ad鼠模型腦室定位緩釋sezn7mt3給藥組）。給藥后aβ淀粉樣蛋白較模型組有明顯減少。sezn7mt3能夠顯著降低ad鼠腦內abeta蛋白的沉積。

實施例6：sezn7mt3抑制阿爾茨海默癥小鼠腦神經細胞凋亡

tunel凋亡試劑盒（g3250試劑盒）購自promega公司。小鼠給藥6周后，取小鼠腦組織，固定，石蠟包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度脫水，pbs洗滌，蛋白酶k室溫孵育10min，切片pbs洗滌后甲醛固定，加入平衡緩沖液預平衡后洗滌，之后加入孵育緩沖液（內含平衡緩沖液，核苷混合物和rtdt酶），37℃避光孵育1h，終止反應后共染dapi，陰干，封片，激光顯微鏡拍照。實驗結果如圖3所示（a為對照組，b為ad鼠模型組，c為ad鼠模型腦室定位緩釋sezn7mt3給藥組），結果表明：sezn7mt3能夠抑制小鼠大腦神經細胞的凋亡。

說明書附圖

圖1.sezn7mt3對阿爾茨海默癥鼠腦組織海馬體ca1區細胞形態的調控作用（a為正常鼠對照組，b為ad鼠模型組，c為ad模型鼠腦室給藥組sezn7mt3）。圖2.sezn7mt3抑制ad鼠腦內abeta蛋白的沉積（a為對照組，b為ad鼠模型組，c為ad模型鼠腦室給藥sezn7mt3六周）。

圖3、sezn7mt3對阿爾茨海默癥鼠腦內神經細胞凋亡的影響（a為對照組，b為ad鼠模型組，c為ad模型鼠腦室給藥sezn7mt3六周）。

semt3蛋白氨基酸序列（1-68）：

semdpetcpcpsggsctcadsckcegckctsckksccsccpaecekcakdcvckggeaaeaeaekssccq。