球形棕囊藻的培養方法與流程

本發明涉及赤潮藻——球形棕囊藻，尤其是涉及其在20l大體積環境中穩定培養的球形棕囊藻的培養方法。

背景技術：

赤潮(redtide)又稱有害藻華，是指在某一海域內,海洋中的浮游微藻、原生動物或細菌等在適宜的環境條件下大量繁殖或聚集，引起水質變壞、海水變色的海洋生態異常現象[1]。赤潮作為一種全球性的水污染，它不僅給海洋環境、海洋漁業和海水養殖造成嚴重危害，給世界經濟帶來了無法估量的損失，而且威脅人類的生存[2]。我們只有在充分了解赤潮的成因、赤潮對人類的危害、赤潮對世界經濟的影響等諸多方面以后，才能更好防止赤潮的發生[2]。

1.赤潮成因

赤潮爆發是一種具有長遠歷史的生態現象，但近些年隨著我國工業的發展，這種現象發生開始變得更加頻繁。

沿海的工業、農業、水產養殖及生活污水的過度排放，大量的廢水污水隨徑流匯集到江河湖海中，促使近海海水水體氮、磷等大量營養鹽類激增，造成了近海海水水體的富營養化和海域水體的環境污染；當營養鹽達到一定濃度，加上20～30℃的適宜海水溫度及不同的光照強度，就會使得不同赤潮生物不斷增長和繁殖；此外，海水鹽度為27‰～30‰，也是引發赤潮的重要條件；海區地理位置、地理特征也是爆發赤潮的影響因素，如淺海區內彎都是赤潮多發的海域[3]。

并非滿足了以上條件就一定能形成赤潮，適宜在該環境下生長的藻類也是必不可少的，能夠引起赤潮的藻類種類繁多。有260種海洋浮游生物能生成赤潮,不同海區不同環境條件下,赤潮爆發時的優勢藻、規模數量各不相同[4]。

2.球形棕囊藻及其培養

glennf.cota[5]等在文獻中描述到球形棕囊藻是一種不同尋常的浮游植物，它能引發的大規模赤潮，它復雜的生活史，和它特別的理化性質都注定了其不同尋常。該種浮游植物能在非常廣的溫度和鹽度范圍生長，從赤道到極地都有其身影。黃思明[6]等描述到球形棕囊藻赤潮是我國東南沿海典型的高發赤潮藻種之一，球形棕囊藻在赤潮爆發過程中會產生大量的膠質、糖和溶血毒素，同時消耗大量溶解氧，造成水產品的大量死亡；而且其釋放的二甲基丙磺酸(dmsp)和二甲基硫醚(dms)對海洋生態環境產生較大的影響。由此可見，對球形棕囊藻的防治是很有必要的。

沈萍萍[7]等的研究表明，球形棕囊藻具有一個比較復雜的異型生活史,介于兩種不同的細胞形態之間:群體和單細胞。單細胞又有幾種不同的形式:具有鞭毛的細胞,不動細胞,小游動細胞等。在實驗室三角瓶中培養時，球形棕囊藻的生長周期很長，一般大于30天。王艷[8]等的研究表明磷是球形棕囊藻生長的首要影響因子，硝酸鹽也是影響球形棕囊藻生長速率的重要影響因子，氮磷比例同樣影響球形棕囊藻的生長；此外，不同株系的球形棕囊藻對硝酸鹽的需求有很大差別。fe、微量元素以及維生素對球形棕囊藻的生長影響不明顯，但在某些條件下fe不足會限制藻的光和作用，維生素等能影響藻的生物量。故在球形棕囊藻培養中，氮磷等大量元素的添加量直接影響藻的生長情況。

傳統方法僅適用于無菌、小體積環境下培養藻種，在20l大體積有菌環境中培養很困難。逐級放大培養球形棕囊藻，獲得大體積高密度藻液，有利于我們后期模擬赤潮爆發過程，揭示其發生機制，為研發球形棕囊藻的調控技術提供了重要的技術支持。

參考文獻：

[1]汪艷濤,高強,姜少慧.赤潮災害監測預報與減災對策研究進展[j].中國漁業經濟,2013(04):161-167.

[2]秦志高.海洋中的赤潮現象及其防治對策[j].南通航運職業技術學院學報,2005(03):46-48.

[3]侯靜,胡成麗.淺談近年我國赤潮的發生概況及防治措施[j].現代交際,2014(06):98.

[4]茍釗訓,任春艷.赤潮的成因及其預報初探[j].聊城大學學報(自然科學版),2003(04):82-85.

[5]cota,g.f.,smith,w.o.,mitchell,b.g.photosynthesisofphaeocystisinthegreenlandsea[j].limnologyandoceanography,1994,39(4):948-953.

[6]黃思明,尹平河,玲,趙.一株芽孢桿菌對球形棕囊藻的溶藻效果[j].暨南大學學報(自然科學與醫學版),2013,23(3):337-342.

[7]沈萍萍,呂頌輝.球形棕囊藻的生長特性及生活史研究[j].水生生物學報,2000,24(6):635-643.

[8]王艷,齊雨藻,李韶山.球形棕囊藻生長的營養需求研究[j].水生生物學報,2007,31(1):24-29.

技術實現要素：

本發明的目的在于提供球形棕囊藻的培養方法。

本發明包括以下步驟：

1)將培養到對數期的有菌球形棕囊藻藻液接入新鮮無菌f/2培養基中，在含f/2的三角瓶中接入藻種，培養；

2)將步驟1)中的600ml藻液全部接入含4l無菌f/2培養基的5l三角瓶中培養到對數期；

3)將步驟2)中的4.6l藻液全部接入含10l處理后海水的已消毒養藻缸中，向其中加入營養鹽：10ml溶液1，5ml溶液2，1ml溶液3；在溫度20℃，光照2000～3000lux，光照周期12h/12h，通氣量為9l/min條件下培養，早晚各監測一次波長為440/680nm處的熒光值，熒光強度100對應細胞個數1000個/μl；

4)生長一天后，向步驟3)養藻缸中添加處理后海水6l，以及與步驟3)等量的營養鹽，早晚各監測一次波長440/680nm處的熒光值；

5)每天向養藻缸中添加20ml溶液1；早晚各監測一次波長440/680nm處藻液的熒光值，直到長至所需細胞濃度。

在步驟1)中，所述對數期可為10天，所述在含f/2的三角瓶可在含400mlf/2的1l三角瓶中接入200ml藻種；所述培養的條件可在溫度20℃，光照強度1400～1500lux，光照周期12h/12h條件下培養10天。

在步驟2)中，所述培養的條件可在溫度20℃，光照4000lux，光照周期12h/12h下培養到對數期10天。

在步驟3)中，所述處理后海水的獲得方法可為：將實驗室ph為7.9～8.1、鹽度為25％～30‰的陳海水用2μm膜過濾，每50l海水添加3ml的8％naclo液體處理過夜，添加1.2gna2s2o3解氯2h，獲得處理后海水。

所述消毒養藻缸的獲得方法可為：

(1)將藻缸清洗干凈后，用0.8％naclo對藻缸進行多次噴霧，等待1天，得養藻缸；

(2)將步驟(1)所述養藻缸用自來水清洗后，再次進行噴霧0.8％naclo處理；

(3)在接藻前，用清水沖洗步驟(2)所述養藻缸內部，再噴霧75％乙醇消毒，待缸晾干后，用75％乙醇消毒后的塑料膜覆蓋養藻缸。

在步驟4)中，所述營養鹽溶液的制備方法可為：

(1)溶液1：稱取nano3150g，nah2po410g，定容至1l蒸餾水中，標準添加量為10ml/20l；

(2)溶液2：稱取na2edta·2h2o8.72g，cl3·6h2o6.3g，uso4·5h2o0.02g，znso4·7h2o0.04g，cocl2·6h2o0.02g，cl2·4h2o0.36g，namoo4·2h2o0.012g，定容至500ml蒸餾水中，標準添加量為5ml/20l；

(3)溶液3：稱取vb10.2g，vb7(生物素)1mg，vb121mg，定容至100ml蒸餾水中，標準添加量1ml/20l。

本發明通過常規的1l和5l密閉無菌三角瓶逐級放大培養獲得穩得的球形棕囊藻藻種，將該藻種接入20l體系，在光照強度為2000～3000lux，光照周期12h/12h，溫度為20℃，鹽度30‰，ph為8，通氣量為9l/min，n、p過量的條件下培養。在環境消毒良好的情況下培養7～10天即可獲得20l體系中具有相應細胞濃度的球形棕囊藻藻液。所述藻液能在較大體系中獲得，對后期大規模模擬赤潮爆發提供可能。為殺藻物質處理赤潮藻提供了更大的模擬環境，對了解赤潮爆發的原因提供更多的理論依據，在藻類大規模穩定培養和赤潮治理方面具有廣泛應用價值。

本發明在20l體系中的培養方法，所述球形棕囊藻密度達1000個/μl，顏色呈棕褐色，生長狀態良好。

附圖說明

圖1為大量元素加倍對藻生長的影響。在圖1中，橫坐標表示時間，縱坐標表示熒光強度。

圖2為溶液2(fe，cu等元素)和溶液3(維生素)添加頻次對藻生長的影響。在圖2中，橫坐標表示時間，縱坐標表示熒光強度。

圖3為光照對藻生長的影響。在圖3中，橫坐標表示時間，縱坐標表示熒光強度。

圖4為環境及容器消毒對藻生長的影響。在圖4中，橫坐標表示時間，縱坐標表示熒光強度。

具體實施方式

實施例1：n，p對球形棕囊生長的影響

1)在光照3300lux，光照周期12h/12h，溫度20℃，消毒徹底的透明玻璃缸中培養球形棕囊藻。

2)表1給出營養鹽添加量，其中處理組的溶液1(n，p)添加量加倍，對照組照常添加，按照表1所述方式，每天分別向對照組和和處理組添加營養鹽，其中對照組添加10ml的溶液1，處理組添加20ml的溶液1。

表1

3)每天檢測藻液在440/680nm處的熒光值，連續監測1周以上。

4)如圖1可見，溶液1(n，p)的加倍添加可以使藻繼續生長。

實施例2：fe，cu及維生素等對藻生長的影響

1)在光照3300lux，光照周期12h/12h，溫度20℃，消毒徹底的透明玻璃缸中培養球形棕囊藻。溶液1按表1所示處理組的量添加，溶液2(fe，cu等)和溶液3(維生素)在對照組每天供給，實驗組僅在養藻第一天供給。

2)每天檢測藻液在440/680nm處的熒光值，連續監測8天。

3)由圖2可以看出，只需補充一次fe，cu及維生素就維持球形棕囊藻細胞增長。

實施例3：光照對藻生長的影響

1)在營養充足，溫度20℃，消毒徹底，光照周期為12h/12h的透明玻璃缸中培養球形棕囊藻。

2)將步驟1中的藻分別放置于光照強度為3300lux光照強度下作為實驗組，將剩余藻缸置于2200lux光照強度下作為對照組。

3)每天檢測不同藻缸在440/680nm處的熒光值，連續監測10天以上。

4)從圖3可以明顯看出，光照強度較低的對照組藻同等條件下生長緩慢。

實施例4：藻缸及環境消毒

1)清洗干凈養藻缸后，用0.8％naclo對養藻缸進行噴霧，晾干，用自來水沖洗干凈，再次用0.8％naclo進行噴霧處理。

2)將上述養藻缸在紫外燈下照射0.5h處理，接入藻種前用清水沖洗養藻缸內部，并噴霧75％乙醇消毒，待缸晾干后使用。

3)對照組僅用自來水將藻缸沖洗干凈，晾干。

4)本次實驗全部使用75％消毒的全新塑料膜覆蓋藻缸，并且每天用0.8％naclo對消毒組養藻環境進行處理。

5)正常培養球形棕囊藻，并每天檢測藻液在440/680nm處的熒光值，連續監測6天以上，生長情況如圖4所示。可見未徹底消毒的環境會導致藻死亡。

實施例5：熒光值為250時藻的狀態

1)在營養充足，光照強度為3300lux，光照周期12h/12h，溫度為20℃，通氣量9l/min，消毒徹底的透明玻璃缸中培養球形棕囊藻。

2)培養一周后，藻的熒光值為250時，顏色呈棕色，生長狀態良好。

本發明屬于定鞭金藻門，棕色，直徑為3～5μm的球形赤潮藻類。通過2μm濾膜過濾，濃度為8％的液體氯酸鈉消毒和硫代硫酸鈉解氯的方法處理海水，將藻種接入其中；增大營養鹽添加量特別是n、p添加量，且每天加入；培養過程中定期清理周邊環境，并將消毒后的透明塑料膜覆蓋于養藻缸上，用濃度為0.8％的次氯酸鈉溶液對周邊環境進行噴霧消毒，每天兩次。在光照強度為2000～3000lux，光照周期12h/12h，溫度為20℃，鹽度30‰，ph為8，通氣量9l/min的條件下培養。通過1l體系，5l體系，到20l體系的逐級放大培養，得到所需密度球形棕囊藻藻液。球形棕囊藻逐級放大培養，獲得大體積，高密度穩定球形棕囊藻藻液，有利于我們大規模模仿赤潮爆發，為赤潮治理提供更大體積的模擬環境。所述球形棕囊藻逐級放大培養方法在赤潮模擬和防治上均有重要意義。