鑒定棉花閉花授粉材料的引物對、試劑盒以及方法與流程

本發明涉及棉花品種鑒別領域，具體而言，涉及鑒定棉花閉花授粉材料的引物對、試劑盒以及方法。
背景技術：
：棉花是常異花授粉作物，一般天然異交率在3～20％，高的可達50％。目前，常規種和雜交種在生產上都得到大面積推廣。在常規種自交繁種和雜交種親本自交繁殖的過程中，由于棉花存在一定的異交率，很容易發生異交，造成生物學混雜，使優良品種特征特性發生退化。鑒于此，育種家和種子公司每年需要投入大量的人力物力財力對棉花常規品種和雜交種親本進行隔離繁殖或者人工自交保純。閉花授粉現象在現代棉花品種中非常罕見，早期曾有過零星記載。秘魯boza在海島棉坦奎斯品種的異交后代中選到閉花授粉的品系，蘇聯kaansh在(海島棉×草棉)×海島棉的自交后代中發現具有閉花授粉花朵的雜種，印度neelakantan和balasubrahmanyan在陸地棉×海島棉的f2代中亦觀察到閉花授粉變異體。80年代以后，埃及、蘇聯和法國等棉區又相繼發現閉花授粉棉花，并進行了初步遺傳分析。1990年，國內首次從陸海雜種后代中分離到穩定的閉花授粉棉花材料1057-1，等等。與正常開花授粉棉花材料相比，棉花閉花授粉材料在開花期花朵開花散粉授粉當天，花瓣緊閉，不開放，完成自我授粉。棉花閉花授粉材料的發現和應用，在棉花遺傳育種和良種繁育上具有廣闊的應用前景。在育種過程中，不需要繁瑣的人工自交提純，通過棉花多代種植后，自我自交，就可以實現后代的純合，顯著地提高了效率。在制種過程中，可以使棉花常規種繁種和雜交種親本繁殖過程中，無需人工干涉，進行自交，杜絕了品種生物學混雜退化。在棉花生產過程中，可有效地防止陰雨天氣，雨水進入花內致使花粉破裂而授粉受精不良，從而減少落鈴，提高產量。鑒于棉花閉花授粉材料的重要性，快速準確地鑒定該材料對于品種選育和知識產權保護均有重要作用。然而，目前我國很多材料真偽的鑒定大多依靠田間性狀表現，此法雖然直觀，但是費時費工。而且，閉花授粉特性受環境影響較大，在某些生態區或環境條件下，與正常開花棉花材料一樣，花朵表現為全部開放。隨著分子生物學技術的發展，從dna水平上進行分子鑒定使得結果更準確，方法更簡便。目前，利用ssr分子標記對材料進行鑒定的方法已經在各種作物中得到廣泛應用。有鑒于此，特提出本發明。技術實現要素：本發明的第一目的在于提供鑒定棉花閉花授粉材料的引物對，該引物對通過大量實驗篩選得到，特異性強，能穩定有效地鑒別棉花閉花授粉材料。本發明的第二目的在于提供鑒定棉花閉花授粉材料的試劑盒，該試劑盒為棉花閉花授粉材料的鑒定提供便利。本發明的第三目的在于提供鑒定棉花閉花授粉材料的方法，該方法通過分子水平進行鑒定，方法簡便快捷，鑒定結果穩定可靠。為了實現本發明的上述目的，特采用以下技術方案：鑒定棉花閉花授粉材料的引物對，包括以下引物對中的任一種或多種：nau2173引物對的上下游核酸序列如seqidno.1和seqidno.2所示，nau2343引物對的上下游核酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示，nau7024引物對的上下游核酸序列如seqidno.5和seqidno.6所示，tmb1638引物對的上下游核酸序列如seqidno.7和seqidno.8所示，bnl3875引物對的上下游核酸序列如seqidno.9和seqidno.10所示，hau0979引物對的上下游核酸序列如seqidno.11和seqidno.12所示，nau1102引物對的上下游核酸序列如seqidno.13和seqidno.14所示，nau6601引物對的上下游核酸序列如seqidno.15和seqidno.16所示，nau2251引物對的上下游核酸序列如seqidno.17和seqidno.18所示，dpl0133引物對的上下游核酸序列如seqidno.19和seqidno.20所示。本發明針對陸地棉26條染色體選擇180對引物(平均每條染色體上最少3對引物)進行ssrpcr擴增，將閉花授粉材料與多個普通棉花品種進行比較，篩選得到這些特異性引物對。這些引物對特異性強，檢測結果穩定可靠。普通棉花品種包括栽培棉花的兩個主要的棉種(海島棉和陸地棉)，特別選擇海島棉遺傳標準系(3-79)和陸地棉遺傳標準系(tm-1)。另外，針對種植面積占絕大多數的陸地棉種，試驗材料涵蓋三大棉區(黃河流域、長江流域、西北內陸)，包括來源于不同血緣系譜的種質資源和目前大面積推廣的品種，比如黃河流域棉區陸地棉品種魯棉研28號、西北內陸陸地棉品種中棉所49。具體的棉花品種如下：海島棉品種：新海21號、海7124、吉扎76以及海島棉遺傳標準系3-79；陸地棉遺傳標準系tm-1；黃河流域棉區陸地棉品種中棉所10號和魯棉研28號；長江流域棉區陸地棉品種蘇棉22號、川棉239和鄂抗棉9號；黃河流域和長江流域棉區陸地棉品種中棉所12；西北內陸棉區陸地棉品種中棉所49、新陸中69號和新陸棉1號。以上這些棉花品種均可從中國農業科學院棉花研究所獲得。本發明提供的鑒定棉花閉花授粉材料的引物對，可以為上述引物對中的任意一種，也可以為任意兩種、任意三種、任意四種、任意五種、任意六種、任意七種、任意八種、任意九種以及這十種的組合，當然，鑒定的時候采用的引物越多，則鑒定更為確切。進一步地，所述棉花閉花授粉材料為棉花閉花授粉材料cj1548143。本發明還提供了鑒定棉花閉花授粉材料的試劑盒，含有權利要求1中所述的引物對。該試劑盒中，可以含有上述引物對中的任一種或幾種。試劑盒為鑒定棉花閉花授粉材料的進行提供便利。本發明還提供了鑒定棉花閉花授粉材料的方法，采用上述的引物對對待檢測棉花材料的基因組進行檢測。該處的上述的引物對為上述引物對中的任一種或幾種。進一步地，所述檢測為分子水平的檢測。如可以為雜交、基因芯片、pcr檢測等。pcr檢測簡便易行，因此，優選為pcr檢測。進一步地，所述pcr檢測時，pcr擴增所用的退火溫度為58±1℃。該退火溫度，擴增得到的產物特異性強，雜帶少。如pcr擴增程序為：94-95℃預變性3-5分鐘；94℃變性30秒；58℃退火30秒；72℃延伸30秒；35個循環；72℃延伸5-10分鐘；產物4℃保存。由于本發明提供的引物對針對棉花染色體上的ssr序列得到，因此，使用該引物得到的片段的長度較小，一般在200bp左右。pcr檢測時，pcr擴增產物一般采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，或者毛細管電泳進行檢測。優選地，所述pcr檢測時，pcr擴增產物采用毛細管電泳檢測結果。本發明創新性地采用毛細管電泳分辨ssrpcr擴增產物，相對于傳統的利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨擴增產物，提高了效率和準確性。利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨擴增產物，包括制作聚丙烯酰胺凝膠、點樣、電泳1h和顯色等步驟，一般每次完成48個樣品，最多96個樣品的條帶采集。利用毛細管電泳分辨擴增產物僅需要在擴增后的96孔pcr板中加入te緩沖液，電泳1h，直接用prosize2.0軟件觀察條帶，每次可以完成95個樣品的條帶采集，大大節約了時間，提高了效率。另外，毛細管電泳可以區分開相差2bp以上的條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳結果只能憑借肉眼觀察，分辨率較低。優選地，所述pcr檢測所用的pcr反應體系為10-25μl。如pcr反應體系為10μl，包括以下成分：基因組20-50ng,濃度為10μm上下游引物各0.5μl；taqmix5μl，無菌雙蒸水補齊至10μl。相應地，若pcr反應體系的體積更大，每個成分相應的增加即可。為了獲得穩定的檢測效果，優選地，所述pcr反應體系中的模板dna的含量不小于5ng,優選為20-50ng。優選地，待檢測棉花材料的基因組所用的提取材料為待檢測棉花材料的種仁。是將該棉花材料的種子去殼得到。本發明還提供了另一種鑒定棉花閉花授粉材料的方法，若待檢測棉花材料的花朵開花當天花瓣緊閉，散粉正常，并且花粉活性正常，則判斷為棉花閉花授粉材料。該方法采用形態學特征進行鑒定，只要判斷待檢測棉花材料在花朵開花當天花瓣緊閉，散粉正常，并且花粉活性正常，這三個特征同時存在的話，則判斷該待檢測棉花品種為閉花授粉材料。與現有技術相比，本發明的有益效果為：(1)本發明提供的引物對，特異性強，能穩定有效地鑒別棉花閉花授粉材料。(2)本發明提供的鑒定棉花閉花授粉材料的方法，能快速高效地、準確地、穩定地檢測出是否為閉花授粉材料。(3)本發明對pcr擴增產物采用毛細管電泳分辨，大大節約了時間，提高了效率和準確性。(4)本發明還提供了形態學鑒定閉花授粉材料的方法，適宜在棉株生長過程中鑒定。附圖說明為了更清楚地說明本發明實施例或現有技術中的技術方案，以下將對實施例或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。圖1為本發明實施例1中利用毛細管電泳分辨引物bnl3875的擴增產物圖譜；圖2為本發明實施例1中利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨引物bnl3875的擴增產物電泳圖；圖3為本發明實施例3中正常開花材料的花朵開放動態觀察圖；圖4為本發明實施例3中棉花閉花授粉材料的花朵開放動態觀察圖；圖5為本發明實施例3中棉花閉花授粉材料與正常開花材料的散粉情況觀察圖；圖6為本發明實施例3中棉花閉花授粉材料與正常開花材料的花粉活性觀察圖。具體實施方式下面將結合實施例對本發明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發明，而不應視為限制本發明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規產品。實施例11、材料取以下棉花品種的種子：海島棉品種：新海21號、海7124、吉扎76以及海島棉遺傳標準系3-79；陸地棉遺傳標準系tm-1；黃河流域棉區陸地棉品種中棉所10號和魯棉研28號；長江流域棉區陸地棉品種蘇棉22號、川棉239和鄂抗棉9號；黃河流域和長江流域棉區陸地棉品種中棉所12；西北內陸棉區陸地棉品種中棉所49、新陸中69號和新陸棉1號；棉花閉花授粉材料cj1548143。以上這些棉花品種均可從中國農業科學院棉花研究所獲得。2、dna提取取棉花閉花授粉材料與上述14個對照材料的種子，采用sds法提取基因組dna，具體提取步驟如下：(1)剝去棉種種皮外殼，并盡量保證種仁的完整性。(2)置于放入鋼珠的2ml離心管中，在組織研磨儀上粉碎。(3)加入800μlsds提取液(組成成分:1wt％sds，0.01mol/ledta，0.705mol/lnacl，0.05mol/ltris，0.5wt％山梨醇，1wt％pvp，1wt％β-巰基乙醇)，漩渦充分后，65℃水浴30min，間隔10min左右輕搖一次。(4)加入等體積800μl酚:氯仿:異戊醇(25:24:1)，混勻至不分層，12000r/min離心10min。(5)取上清，加入1μlrnasea(10mg/ml)，37℃水浴30min。(6)重復抽提一次后離心取上清，加入0.7倍體積異丙醇，緩慢混勻至dna成團析出，室溫靜置30min。(7)70％乙醇洗滌dna沉淀2次，無水乙醇洗滌1次。(8)倒置晾干，加入200μlddh2o充分溶解dna，備用，測定模板dna濃度為20-50ng/μl。3、ssr引物的擴增和檢測以上述提取的基因組dna為模板，針對陸地棉26條染色體選擇180對引物(平均每條染色體上最少3對引物)進行ssrpcr擴增。pcr擴增程序如表1所示。表1pcr擴增程序pcr擴增反應所用體系為10μl反應體系，擴增反應體系如表2所示。表2pcr擴增反應體系所用試劑用量taqmix5.0μl正向引物(10μm)0.5μl反向引物(10μm)0.5μl模板dna1.0μlddh2o3.0μl總體積10μlpcr產物用毛細管電泳進行檢測，使用fa-96全自動毛細管電泳系統和配套的dnf-910試劑盒。操作過程如下：(1)將試劑盒中的5×buffer稀釋5倍，96孔分析托盤中每孔加1ml，放入毛細管電泳系統的b托盤中，每跑六板樣品更換一次。(2)在96孔平面pcr板的每個點樣孔中加入30μlmaker，上面覆蓋一滴mineraloil，放入毛細管電泳儀m托盤中。(3)每10mlgel和1μldye混合后加入毛細管電泳儀的gel1盛液瓶中。(4)將試劑盒中的5×conditioningsolution溶液稀釋5倍，加入毛細管電泳系統的conditioning盛液瓶中，并清空廢液瓶。(5)在96孔板的10μlpcr產物中加入14μl1×te，共24μl。最后一個點樣孔中加入24μlladder，然后按順序放在毛細管電泳系統的樣品托盤中。(6)打開fragmentanalyzer軟件按實際情況進行參數設置，每六板一個循環，第一板樣品選擇fc-dnf-900-33-dna35-500bp.mthds程序，剩下五板選擇gp-dnf-900-33-dna35-500bp.mthds程序。(7)在prosize2.0軟件中查看結果相關信息。通過毛細管電泳，最終鑒定出10對在閉花授粉材料中有特異性擴增條帶的引物，具體如表3所示。表310對特異性ssr引物及其序列引物名稱正向引物反向引物nau2173gccaaataggtcacacacaaagcgagaaggagacagaaaanau2343gctttgctttggaatgagatatactgcaacccctcacactnau7024acataagacacaaagagaggaaggaggagagattaaagaatmb1638aaaaccaagaatcgaggaaaaatgcaatcctcgaaggtctttbnl3875catgtaggaacgagcatagtgaacacataccagtcccagtcghau0979cacccctaaagtaacaaacaaaatcttcctcagcactccaagnau1102atctctctgtctcccccttcgcatatctggcgggtataatnau6601tctattttacaacgcgaccatggcaaagtggtaaatgttgnau2251ttctccagtaaccaacaaaggaaaatatcatccccgtcaaadpl0133cagtttctctaccggtctcaaatcggtatcacaccacatactttcacg10對特異性引物的擴增產物如下：引物nau2173的擴增組中，閉花授粉材料有268bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物nau2343的擴增組中，閉花授粉材料有419bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物nau7024的擴增組中，閉花授粉材料有276bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物tmb1638的擴增組中，閉花授粉材料有219bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物bnl3875的擴增組中，閉花授粉材料有133bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物hau0979的擴增組中，閉花授粉材料有258bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物nau1102的擴增組中，閉花授粉材料有186bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物nau6601的擴增組中，閉花授粉材料有177bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物nau2251的擴增組中，閉花授粉材料有162bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段；引物dpl0133的擴增組中，閉花授粉材料有210bp的擴增產物，而其它對照均無此大小的片段。具體地，bnl3875的擴增產物進行毛細管電泳的結果如圖1所示。圖1中，從下至上的曲線依次代表以下的f1-g3；f1：新海21號；f2：3-79；f3：海7124；f4：吉扎76；f5：tm-1；f6：中棉所10號；f7：中棉所12；f8：魯棉研28號；f9：蘇棉22號；f10：川棉239；f11：鄂抗棉9號；f12：中棉所49；g1：新陸中69號；g2：新陸棉1號；g3：閉花授粉材料。紅色箭頭指示特異性條帶；35bp和1500bp處峰分別指示最低和最高分子量標準。另外，對應于圖1中的pcr產物采用聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體結果見圖2。圖2中，1：新海21號；2：3-79；3：海7124；4：吉扎76；5：tm-1；6：中棉所10號；7：中棉所12；8：魯棉研28號；9：蘇棉22號；10：川棉239；11：鄂抗棉9號；12：中棉所49；13：新陸中69號；14：新陸棉1號；15：閉花授粉材料；m：分子量標準。紅色箭頭指示特異性條帶。綜合考慮，優選采用毛細管電泳分辨ssrpcr擴增產物，相對于傳統的利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨擴增產物，提高了效率和準確性。聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨擴增產物，包括制作聚丙烯酰胺凝膠、點樣、電泳1h和顯色等步驟，一般每次完成48個樣品，最多96個樣品的條帶采集。毛細管電泳分辨擴增產物僅需要在擴增后的96孔pcr板中加入te緩沖液，電泳1h，直接用prosize2.0軟件觀察條帶，每次可以完成95個樣品的條帶采集，大大節約了時間，提高了效率。另外，毛細管電泳可以區分開相差2bp以上的條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳結果只能憑借肉眼觀察，分辨率較低。實施例2對已知棉花品種進行鑒定，取以下棉花品種在不同種植地或者不同時期采集到的種子，每個棉花品種采用10個種子：海島棉品種：新海21號、海7124、吉扎76以及海島棉遺傳標準系3-79；陸地棉遺傳標準系tm-1；黃河流域棉區陸地棉品種中棉所10號和魯棉研28號；長江流域棉區陸地棉品種蘇棉22號、川棉239和鄂抗棉9號；黃河流域和長江流域棉區陸地棉品種中棉所12；西北內陸棉區陸地棉品種中棉所49、新陸中69號和新陸棉1號；棉花閉花授粉材料cj1548143。采用實施例1的dna提取方式提取基因組；對提取到的基因組測定濃度，濃度均在5ng/μl以上；進行pcr擴增，采用的引物為表3中所示，pcr擴增程序和擴增體系同實施例1；擴增產物采用毛細管電泳，電泳結果顯示，這10對特異性引物均在閉花授粉材料中得到了同實施例1中的大小的特異性條帶；并且，不同地方或者不同時期采集得到的閉花授粉材料均得到了一致大小的特異性條帶；而在其他棉花品種中均未得到相應大小的特異性條帶。說明，本發明提供的鑒定棉花閉花授粉材料的方法，鑒定結果穩定可靠。實施例3棉花閉花授粉材料cj1548143閉花授粉特性的形態學鑒定將棉花閉花授粉材料cj1548143種植在河南省安陽市中國農業科學院棉花研究所試驗農場，以正常開花材料為對照。在開花期對當天即將開放花朵的動態觀察，與正常開花材料(圖3)明顯不同，棉花閉花授粉材料花朵開花當天花瓣緊閉，不開放(圖4)。但是，與正常開放花朵相比，散粉正常(圖5)，花粉活性正常(圖6)。持續的觀察也表明，閉花授粉的花朵能發育成棉鈴，完成吐絮，收獲纖維和種子。這些結果表明，棉花閉花授粉材料能夠自主閉花完成自我授粉。將這些種植得到的對照組以及閉花授粉材料的種子各收集50個，采用實施例2相同的方法進行pcr檢測。pcr產物結果進行毛細管電泳，閉花授粉材料的50個樣本均在10對特異性引物中擴增得到了同實施例1中閉花授粉材料的相應大小的特異性條帶；而對照組的50個樣本中均未得到這些特異性條帶。盡管已用具體實施例來說明和描述了本發明，然而應意識到，在不背離本發明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權利要求中包括屬于本發明范圍內的所有這些變化和修改。<110>中國農業科學院棉花研究所<120>鑒定棉花閉花授粉材料的引物對、試劑盒以及方法<160>20<170>patentinversion3.3<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1gccaaataggtcacacacaa20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2agcgagaaggagacagaaaa20<210>3<211>20<212>dna<213>人工序列<400>3gctttgctttggaatgagat20<210>4<211>20<212>dna<213>人工序列<400>4atactgcaacccctcacact20<210>5<211>20<212>dna<213>人工序列<400>5acataagacacaaagagagg20<210>6<211>20<212>dna<213>人工序列<400>6aaggaggagagattaaagaa20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<400>7aaaaccaagaatcgaggaaaaa22<210>8<211>20<212>dna<213>人工序列<400>8tgcaatcctcgaaggtcttt20<210>9<211>21<212>dna<213>人工序列<400>9catgtaggaacgagcatagtg21<210>10<211>21<212>dna<213>人工序列<400>10aacacataccagtcccagtcg21<210>11<211>22<212>dna<213>人工序列<400>11cacccctaaagtaacaaacaaa22<210>12<211>20<212>dna<213>人工序列<400>12atcttcctcagcactccaag20<210>13<211>20<212>dna<213>人工序列<400>13atctctctgtctcccccttc20<210>14<211>20<212>dna<213>人工序列<400>14gcatatctggcgggtataat20<210>15<211>20<212>dna<213>人工序列<400>15tctattttacaacgcgacca20<210>16<211>20<212>dna<213>人工序列<400>16tggcaaagtggtaaatgttg20<210>17<211>21<212>dna<213>人工序列<400>17ttctccagtaaccaacaaagg21<210>18<211>20<212>dna<213>人工序列<400>18aaaatatcatccccgtcaaa20<210>19<211>24<212>dna<213>人工序列<400>19cagtttctctaccggtctcaaatc24<210>20<211>24<212>dna<213>人工序列<400>20ggtatcacaccacatactttcacg24當前第1頁12