重組大腸桿菌的構建方法及發酵生產β?丙氨酸的方法與流程

本發明涉及微生物發酵工程技術領域，尤其涉及一種重組大腸桿菌的構建方法及發酵生產β-丙氨酸的方法。

背景技術：

β-丙氨酸在醫藥食品化工等領域都有著廣泛的應用，尤其是其可作為具有高附加值的醫藥中間體。目前在工業生產中，β-丙氨酸的主要合成方式是丙烯酸、丙烯腈氨化法或β-氨基丙腈水解法，這些方法多需要在高溫、高壓、強酸或強堿的條件下，而且產物純化繁瑣，存在環境污染問題。

近年來越來越多的人開始研究酶轉化法生產β-丙氨酸，但也存在一些問題，如高濃度底物對菌的生長產生抑制，產物的產率較低、分離純化的成本較高等。而微生物發酵法具有原料成本低，反應條件溫和，容易實現大規模生產等優點。但目前國內尚未出現有關發酵生產β-丙氨酸的方法。

技術實現要素：

為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種重組大腸桿菌的構建方法及發酵生產β-丙氨酸的方法，本發明構建的重組大腸桿菌本發明對大腸桿菌代謝途徑進行改造，降低其副產物合成量，高效表達β-丙氨酸合成代謝途徑，通過發酵法高效生產β-丙氨酸，采用本發明的方法所構建的重組大腸桿菌，其β-丙氨酸的產量可高達18.4g/l，生產強度達到0.61g/l·h，而未經本發明的方法改造的大腸桿菌b0016-050的β-丙氨酸的產量僅為5.2mg/l。

在一方面，本發明提供了一種重組大腸桿菌的構建方法，包括以下步驟：

敲除大腸桿菌中天冬氨酸激酶的編碼基因lysc、泛酸合成酶的編碼基因panc和葡萄糖轉運蛋白eⅱcbglc的編碼基因ptsg，并用強啟動子過表達pand基因，得到所述重組大腸桿菌。

其中，lysc的核苷酸序列如seqidno.1所示；panc的核苷酸序列如seqidno.2所示；ptsg的核苷酸序列如seqidno.3所示；pand的核苷酸序列如seqidno.4所示。

進一步地，大腸桿菌為敲除了乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸、醇合成途徑編碼基因的重組菌株。使用敲除了上述有機酸和醇代謝途徑編碼基因的重組菌作為出發菌株，可以在后續發酵過程中降低乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸、醇等副產物。

進一步地，大腸桿菌為大腸桿菌b0016-050。

進一步地，強啟動子為pl啟動子、ptac啟動子或ptrc啟動子。

進一步地，pand基因來源于谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum或赤擬谷盜triboliumcastaneum。

在另一方面，本發明還提供了一種采用上述構建方法得到的重組大腸桿菌搖瓶發酵生產β-丙氨酸的方法，包括以下步驟：

(1)將重組大腸桿菌的lb種子培養液接種至無機鹽培養基中，使得od600＝0.05-0.8，在28-37℃下培養至od600＝1.5-4.5；

(2)然后向無機鹽培養基中補加濃度為25-75g/l的甘油1-40ml/l，在40-45℃下進行誘導培養，誘導培養過程中使用碳酸氫鹽控制ph＝6-7.5。

進一步地，在步驟(1)中，將重組大腸桿菌在lb種子培養基中培養獲得lb種子培養液。

進一步地，在步驟(1)和步驟(2)中，在步驟(1)和步驟(2)中，在轉速為150-220r/min的條件下振蕩培養。

進一步地，在步驟(2)中，在步驟(2)中，向無機鹽培養基中每隔2-8h補加濃度為25-75g/l的甘油水溶液。優選地，每升無機鹽培養基中補加30ml濃度為63g/l的甘油水溶液。甘油作為重組大腸桿菌生長過程中的碳源。

進一步地，在步驟(2)中，培養時間為30-65h。優選的，培養時間為42h。

優選地，在步驟(2)中，使用濃度為100g/l的nahco3水溶液控制ph＝7。

本發明還提供了一種采用上述構建方法得到的重組大腸桿菌發酵罐發酵生產β-丙氨酸的方法，包括以下步驟：

(1)將重組大腸桿菌在lb液體培養基中，于28-37℃下培養至od600＝1.5-4.5，然后接種至濃度為0.1-2g/l甘油的無機鹽培養基中，于28-37℃下培養至od600＝3-5；

(2)將步驟(1)得到的發酵液接種至無機鹽培養基中進行上罐發酵，上罐發酵時甘油的初始濃度為5-40g/l，當培養至od600＝10-50時，在40-45℃下進行補料發酵培養，并補加甘油和硫酸銨，補料發酵培養過程中使用碳酸氫鹽控制ph＝6-7.5。

進一步地，在步驟(1)之前，還包括將重組大腸桿菌在含有氨芐青霉素的lb平板上于33℃培養24h，然后轉接于lb液體培養基中的步驟。

進一步地，在步驟(1)中，以2.5％(v/v)的接種量接種至無機鹽培養基中。

進一步地，在步驟(1)和步驟(2)中，在轉速為100-1000r/min的條件下進行培養。

優選地，在步驟(2)中，使用濃度為100g/l的nahco3水溶液控制ph＝7。

進一步地，在步驟(2)中，每隔6h，每升發酵罐中補加6.5-26g甘油和2-8g硫酸銨。

進一步地，在步驟(2)中，補料發酵培養過程中的溶氧大于45％，總發酵時間為30-65h。優選的，發酵時間為42h。

在本發明的發酵生產β-丙氨酸的方法中，在步驟(2)中，所用碳酸氫鹽為nahco3或khco3。

在本發明的發酵生產β-丙氨酸的方法中，無機鹽培養基中包括硫酸銨和甘油。

進一步地，每升無機鹽培養基中包含以下含量的各組分：nahpo4·12h2o7.5-20g、kh2po41-5g、nh4cl0.1-5g、nacl0.1-3g、(nh4)2so41-20g、甘油添加至指定濃度、泛酸0.1-1g、mgso40.1-1g、氨芐青霉素50-100μg以及微量元素母液1ml；

其中，每升所述微量元素母液中含有以下重量的各組分：fecl3·6h2o2.4g；cocl2·6h2o0.3g；cucl2·2h2o0.15g；zncl20.3g；na2mo4·2h2o0.3g；h3bo30.075g；mncl2·4h2o0.495g。

無機鹽培養基中，以甘油為唯一碳源，目的是在代謝過程中產生更多的還原力，優點是可促進β-丙氨酸發酵合成；在無機鹽培養基中添加高濃度(nh4)2so4，目的是提供更多的nh4⁺，可促進β-丙氨酸發酵合成。

本發明中，大腸桿菌b0016-050(escherichiacolicicimb0016-050)為文獻“周麗等，微生物學通報，2015，42(11)：2272-2281”中公開的大腸桿菌。

借由上述方案，本發明至少具有以下優點：

在敲除了副產物乙酸、甲酸、乙醇、琥珀酸、乳酸合成途徑編碼基因(acka-ptapflbadhefrdaldha)的escherichiacolicicimb0016-050菌株中，疊加敲除β-丙氨酸的競爭途徑的酶的編碼基因，并過表達來源于谷氨酸棒桿菌corynebacteriumglutamicum的pand基因，所構建的重組大腸桿菌的β-丙氨酸合成量大幅提高。

在發酵過程中，使用改良的無機鹽培養基，避免了復雜碳氮源來源和批次差異導致的發酵生產不穩定，營養成分簡單可方便產品分離純化，培養基廉價有助于降低生產成本以甘油為唯一碳源可在代謝過程中產生更多的還原力，添加高濃度(nh4)2so4可提供更多的nh4⁺促進β-丙氨酸合成；使用兩階段控溫，在搖瓶發酵和上罐補料發酵過程中，分別以菌體生長至od600為1.5-4.5、10-50為分界點，將發酵溫度由33℃切換為42℃，原因是菌體在低溫生長時可獲得較高的細胞濃度(而此時天冬氨酸-α-脫羧酶不表達，避免β-丙氨酸大量合成干擾菌體生長)，在高溫時可誘導天冬氨酸-α-脫羧酶的大量表達并快速合成β-丙氨酸(而菌體生長受到限制，避免與β-丙氨酸合成競爭前體物質)，使得整個發酵過程β-丙氨酸的合成速率較高。在搖瓶發酵42h時，β-丙氨酸合成量最高，達到5.0g/l，體積生產強度達到0.12g/(l·h)，上罐發酵產量可達18.4g/l，生產強度達到0.61g/l·h。本發明構建的重組大腸桿菌，為發酵法生產β-丙氨酸奠定了基礎。

上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段，并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。

附圖說明

圖1是e.coli菌株β-丙氨酸合成相關代謝途徑及改造策略；

圖2是本發明實施例1不同基因敲除前后的pcr驗證電泳圖；

圖3圖示了實施例1中敲除不同基因后對β-丙氨酸合成的影響；

圖4為ppl-pand重組質粒的物理圖譜和酶切驗證電泳圖譜；

圖5圖示了搖瓶發酵不同菌株的β-丙氨酸產量結果；

圖6圖示了不同誘導時機對b0016-080bb/ppl-pand搖瓶發酵中β-丙氨酸產量的影響結果；

圖7圖示了不同發酵時間對b0016-080bb/ppl-pand搖瓶發酵β-丙氨酸產量的影響結果；

圖8圖示了上罐補料發酵080bb/ppl-pand的發酵曲線。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。

本發明中，以下實施例涉及的方法具體如下：

(1)基因敲除方法

采用文獻“datsenkoka,etal.procnatlacadsciusa,2000,97:6640-6645”中報道的方法進行基因敲除。

(2)搖瓶發酵方法：

1)種子培養：取-80℃甘油保藏的菌種，在氨芐青霉素抗性的lb平板劃線，于33℃恒溫培養24h后，轉接到50ml含有氨芐青霉素的lb液體培養基中，于33℃搖床200r/min振蕩培養至od600＝2.5。

2)發酵培養：將lb種子培養基轉接至50ml含有6.3g/l甘油的改良無機鹽培養基中，使od600終濃度為0.05-0.8。第一階段于33℃、200r/min振蕩培養至od600＝1.5-4.5；第二階段補料1.5ml63g/l甘油并用100g/l的nahco3水溶液調節ph＝7，同時調節溫度至42℃誘導培養，繼續在200r/min條件下振蕩培養，每隔6h向培養基中補加1ml63g/l甘油，并用100g/l的nahco3水溶液調節ph＝7；兩個階段共培養30-65h，結束搖瓶發酵，每次進行三個平行試驗并計算其平均值。

(3)上罐補料發酵方法：

將-80℃保藏的菌株劃線含有100μg/ml氨芐青霉素的lb平板，33℃培養24h，轉接于50mllb液體培養基中，在33℃、200r/min條件下培養至od600＝2.5，再以2.5％(v/v)的接種量轉接于150ml含有6.3g/l甘油的改良無機鹽培養基中，在33℃、200r/min條件下培養至od600＝4，最后以5％(v/v)的接種量接種于含有2l改良無機鹽培養基(添加100μg/ml的氨芐青霉素)的5l發酵罐中，發酵罐中甘油的初始添加量為30g/l。在菌體生長至od600＝10-50時將培養溫度調節為42℃，每6h補加200ml含有濃度為650g/l的甘油和200g/l的(nh4)2so4的混合水溶液，溶氧濃度與轉速偶聯，控制溶氧大于45％，總發酵時間為30-65h。整個發酵過程中用100g/l的nahco3水溶液調節ph為7。

(4)以上發酵方法中，使用的無機鹽培養基中包含以下含量的各組分：nahpo4·12h2o15.1g/l、kh2po43.0g/l、nh4cl1.0g/l、nacl0.5g/l、(nh4)2so413.21g/l，甘油根據需要添加至指定濃度，200g/l的泛酸水溶液1ml，1mol/l的mgso4水溶液1ml和微量元素母液1ml。其中，每升微量元素母液中含有以下重量的各組分：fecl3·6h2o2.4g；cocl2·6h2o0.3g；cucl2·2h2o0.15g；zncl20.3g；na2mo4·2h2o0.3g；h3bo30.075g；mncl2·4h2o0.495g。

(5)β-丙氨酸檢測方法：

發酵液預處理方法：發酵液樣品10000r/min離心2min，取上清液加入等體積10％(m/v)三氯乙酸，避光放置3h以上，稀釋后用0.45μm濾膜過膜。

利用鄰苯二甲醛(opa)試劑在線衍生β-丙氨酸，用高效液相色譜(hplc)分析β-丙氨酸的含量。色譜柱為diamonsilc18柱(250cm×4.6mm,5μm)，流動相a配法為：先將4.52g無水醋酸鈉(分析純)溶于水，再加三乙胺200μl，四氫呋喃5ml，用水定容至1l，再用醋酸調節ph＝7.2；流動相b配法為：先將4.52g無水醋酸鈉溶于水，然后定容至200ml，用醋酸調節ph＝7.2，再加400ml甲醇和400ml乙腈。采用梯度洗脫：0-27min，流動相b由8％上升到60％，流速為1ml/min；27-31.5min，流動相b由60％上升到100％，流速為1ml/min；31.5-34min，流動相b梯度不變，流速為1.2ml/min。34-35min，流動相b由100％下降到8％，流速為1ml/min。柱溫為40℃，檢測波長為338nm；進樣量為10μl。

實施例1敲除β-丙氨酸競爭代謝途徑

采用文獻“datsenkoka,etal.procnatlacadsciusa,2000,97:6640-6645”中報道的方法，在菌株e.colib0016-050中依次疊加敲除天冬氨酸激酶的編碼基因lysc、泛酸合成酶的編碼基因panc和葡萄糖轉運蛋白eⅱcbglc的編碼基因ptsg(如圖1所示)，依次獲得了b0016-060a、b0016-070b和b0016-080bb菌株(見表1)。圖1中pflb代表丙酮酸甲酸裂解酶，ldha代表nad依賴發酵型d-乳酸脫氫酶，pta代表磷酸轉乙酰酶，acka代表乙酸激酶，adhe代表乙醇脫氫酶，frda代表富馬酸還原酶，aspa代表天冬氨酸氨裂解酶，lysc代表天冬氨酸激酶，panc代表泛酸合成酶，ptsg代表葡萄糖轉運蛋白iicbglc，ppc代表磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，aspc代表天冬氨酸轉氨酶，pand代表天冬氨酸-α-脫羧酶，圖中黑點代表實施例所刪除的基因，表1為本發明涉及的菌株和質粒。用表2中的引物對上述突變菌株進行驗證，結果如圖2所示。圖2中m代表dl5000dna標記，1代表敲除lysc前的基因，2代表敲除lysc后的基因，3代表敲除panc前的基因，4代表敲除panc后的基因，5代表敲除ptsg前的基因，6代表敲除ptsg后的基因。從圖2中可看出，lysc基因敲除前，基因大小為1714bp，敲除后為469bp；panc敲除前，基因大小為1334bp，敲除后為587bp；ptsg敲除前，基因大小為1770bp，敲除后為340bp。這表明天冬氨酸激酶、泛酸合成酶和葡萄糖轉運蛋白eⅱcbglc的編碼基因lysc、panc和ptsg已成功敲除。

對b0016-050菌株以及上述獲得的b0016-060a、b0016-070b和b0016-080bb菌株分別進行搖瓶發酵，比較三種菌株的β-丙氨酸合成水平。結果如圖3所示，b0016-050菌株的β-丙氨酸產量為5.2mg/l，b0016-060a菌株的β-丙氨酸合成量較b0016-050提高了35.1％，說明敲除lysc基因有助于l-天冬氨酸的積累，從而提高β-丙氨酸的產量；而b0016-070b菌株的β-丙氨酸合成量較b0016-060a提高了595.8％，表明敲除panc基因阻斷了β-丙氨酸的分解，從而使其合成量大幅度提高；b0016-080bb菌株的β-丙氨酸產量為49.3mg/l，較b0016-070b提高了1.7％，說明敲除ptsg基因對β-丙氨酸的合成也有提高作用。

實施例2pand基因的異源過表達

將實施例1中的質粒pet28a-pand用bglⅱ和ecori進行雙酶切，膠回收0.5kb片段，克隆于ppl451質粒載體的bamhi和ecori酶切位點，獲得重組質粒ppl-pand(其物理圖譜如圖4a所示)。重組質粒ppl-pand用ecori進行酶切，電泳獲得了4.8kb條帶(圖4b)，圖4b中的m代表dl10000dna標記，1代表ppl-pandecori酶切產物，圖4結果表明重組質粒ppl-pand構建正確。

將ppl-pand質粒分別轉化入菌株b0016-050、b0016-060a、b0016-070b和b0016-080bb，獲得b0016-050/ppl-pand、b0016-060a/ppl-pand、b0016-070b/ppl-pand和

b0016-080bb/ppl-pand重組大腸桿菌，對以上獲得的菌株進行發酵實驗檢測其β-丙氨酸合成性能。

搖瓶發酵結果如圖5所示，圖5中結果表明，過量表達pand基因顯著提高了β-丙氨酸合成量，其中，b0016-050/ppl-pand菌株的β-丙氨酸合成量達2.4g/l，比b0016-050重組菌株提高了464.1倍；而b0016-080bb/ppl-pand重組菌的β-丙氨酸合成量最高，達4.3g/l，比b0016-080bb重組菌β-丙氨酸合成量提高了86.2倍。依次疊加敲除lysc、panc和ptsg基因，β-丙氨酸合成量依次升高12.5％、39.3％和13.3％(b0016-050/ppl-pand、

b0016-060a/ppl-pand、b0016-070b/ppl-pand和b0016-080bb/ppl-pand依次比較)。可見，敲除天冬氨酸的分解途徑關鍵基因lysc和β-丙氨酸的分解途徑關鍵基因panc顯著提高了β-丙氨酸的合成量；此外，也證明了在以甘油為碳源時，敲除ptsg基因同樣可增加β-丙氨酸代謝流。

表1本發明使用的菌株和質粒

表1中，pet28a-pand質粒采用文獻“生物技術通報,2013,4:110-115”中的方法進行構建。pkd46、pkd13、pcp20質粒來源于耶魯大學基因保藏中心，ppl451質粒來源于江南大學中國高校工業微生物資源和信息中心。

表2引物

a：小寫字母代表與pkd13質粒同源堿基序列。

實施例3搖瓶發酵080bb/ppl-pand重組大腸桿菌

對實施例2得到的菌株b0016-080bb/ppl-pand進行搖瓶發酵，對33℃菌體生長和42℃β-丙氨酸合成兩個階段的轉折時機進行優化，當33℃下菌體生長至od600為0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4時，將發酵溫度由33℃切換為42℃，測定β-丙氨酸合成量。

此外，在最優誘導時機下，對實施例2得到的菌株b0016-080bb/ppl-pand進行搖瓶發酵，進一步對菌株b0016-080bb/ppl-pand的β-丙氨酸發酵周期進行優化，將溫度調至42℃后，總發酵時間為30-65h，每6h取樣，測定β-丙氨酸合成量。

搖瓶發酵誘導時機的優化結果如圖6所示，菌體生長至od600為2.5時，將發酵溫度由33℃切換為42℃時，其β-丙氨酸合成量最高，達到4.9g/l。因此，最佳溫度誘導時機為od600值達到2.5。發酵周期的優化結果如圖7所示，從圖7可看出，當搖瓶發酵進行42h時，β-丙氨酸合成量最高，達到5.0g/l，體積生產強度達到0.12g/(l·h)。因此，菌株b0016-080bb/ppl-pand的最佳搖瓶發酵周期為42h。

實施例4上罐補料發酵080bb/ppl-pand重組大腸桿菌

按照上述說明書中的上罐補料發酵方法，對代謝改造菌b0016-080bb/ppl-pand上罐培養，檢測β-丙氨酸合成量。圖8為上罐補料發酵過程中，在培養至od600值為30時，將溫度由33℃培養轉換為42℃，在不同培養時間時的發酵實驗結果。圖8中實線箭頭代表補料時間點，虛線箭頭代表溫度由33℃培養轉換為42℃的時間點。如圖8所示，30h時β-丙氨酸產量最高，可達18.4g/l，生產強度達到0.61g/l·h。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，并不用于限制本發明，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。

序列表

<110>江南大學

<120>重組大腸桿菌的構建方法及發酵生產β-丙氨酸的方法

<160>4

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1350

<212>核苷酸序列

<213>lysc

<400>1

1atgtctgaaattgttgtctccaaatttggcggtaccagcgtagctgattttgacgccatg

61aaccgcagcgctgatattgtgctttctgatgccaacgtgcgtttagttgtcctctcggct

121tctgctggtatcactaatctgctggtcgctttagctgaaggactggaacctggcgagcga

181ttcgaaaaactcgacgctatccgcaacatccagtttgccattctggaacgtctgcgttac

241ccgaacgttatccgtgaagagattgaacgtctgctggagaacattactgttctggcagaa

301gcggcggcgctggcaacgtctccggcgctgacagatgagctggtcagccacggcgagctg

361atgtcgaccctgctgtttgttgagatcctgcgcgaacgcgatgttcaggcacagtggttt

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481gcgctggcggaactggccgcgctgcagctgctcccacgtctcaatgaaggcttagtgatc

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781ccggcaacgttgctacccgcagtacgcagcgatatcccggtctttgtcggctccagcaaa

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901gctctggcgcttcgtcgcaatcagactctgctcactttgcacagcctgaatatgctgcat

961tctcgcggtttcctcgcggaagttttcggcatcctcgcgcggcataatatttcggtagac

1021ttaatcaccacgtcagaagtgagcgtggcattaacccttgataccaccggttcaacctcc

1081actggcgatacgttgctgacgcaatctctgctgatggagctttccgcactgtgtcgggtg

1141gaggtggaagaaggtctggcgctggtcgcgttgattggcaatgacctgtcaaaagcctgc

1201ggcgttggcaaagaggtattcggcgtactggaaccgttcaacattcgcatgatttgttat

1261ggcgcatccagccataacctgtgcttcctggtgcccggcgaagatgccgagcaggtggtg

1321caaaaactgcatagtaatttgtttgagtaa

<210>2

<211>852

<212>核苷酸序列

<213>panc

<400>2

1gtgttaattatcgaaaccctgccgctgctgcgtcagcaaattcgccgcctgcgtatggaa

61ggcaagcgcgtggcgctggtgcctaccatgggtaacctgcacgatggccatatgaagctg

121gtcgacgaagccaaagcccgcgccgatgtggtcgtcgtcagtattttcgttaacccgatg

181cagttcgaccgcccggaagatctggctcgttatccacggaccttgcaggaggactgcgag

241aagctaaacaaacgtaaagtggatttagttttcgccccttcggtaaaagagatctacccg

301aacggtactgaaacccacacttacgttgacgttcctggcctttcgaccatgctggaaggt

361gccagccgtccgggacattttcgcggcgtttcgactattgtcagcaagctgttcaacctg

421gtccagccggacatcgcctgcttcggtgaaaaagattttcagcaactggcgctgatccgc

481aaaatggttgccgatatgggcttcgatattgagattgtcggtgtgccaattatgcgcgcc

541aaagacggtctggcgctaagttcccgtaacggttatctgacggcggaacaacgcaaaatt

601gcgcctggtctgtacaaagttttaagttcgattgctgacaaattgcaggctggggaacgg

661gatctcgatgaaattattaccattgcggggcaagaactgaatgaaaaaggcttccgcgcc

721gatgatattcagattcgcgatgccgacacattgctggaagtttctgaaaccagcaaacgg

781gcagtaattctggtagccgcctggcttggcgatgctcgcctgatcgacaacaaaatggtc

841gagctggcgtaa

<210>3

<211>1434

<212>核苷酸序列

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