一種促進農作物生長的拮抗木霉菌及其應用的制作方法

本發明屬于微生物領域，具體涉及一種促進農作物生長的拮抗木霉菌及其應用。

背景技術：

禾谷絲核菌，拉丁名rhizoctoniacerealis，屬無孢霉目真菌類。可引起小麥、大麥、玉米、水稻的紋枯病，是我國小麥種植區普遍發生、危害嚴重的一種土傳性真菌病害。

禾谷絲核菌侵染引起的小麥紋枯病是一種世界性病害。在我國近20個省（市）都有不同程度的發生和危害，以江蘇、浙江、安徽、山東、河南、陜西、貴州、湖北及四川等省麥區發生普遍，危害嚴重，輕者產量損失5%-10%，重者減產20%-40%。甚至造成枯孕（白）穗而顆粒無收。近年來，由于小麥品種、栽培措施和肥水條件的改變，紋枯病危害逐漸加重，己成為影響小麥穩產高產的重要障礙。目前對小麥紋枯病的防治是在農業防治的基礎上進行藥劑防治，藥劑防治主要用三唑類殺菌劑迸行“一噴一拌”。由于紋枯病發生在小麥莖基部，防治方法不當則效果不理想。而且長期連續地使用化學農藥，易導致一系列嚴重后果：使病菌產生抗藥性、農藥殘留造成環境污染以及威脅人類的健康等。生物防治則是利用生物及其代謝產物防治植物病蟲害，可避免化學農藥使用帶來的一系列環境和能源方面的問題，促進農業的可持續發展。小麥紋枯病的生物防治研究目前還處于開始階段，篩選有效控制小麥紋枯病的生防菌、研究生防菌的控病機理將為小麥紋枯病的生物和生態防治提供一定的理論基礎，使其成為小麥紋枯病綜合治理中的重要環節。

黃色鐮孢菌（fusariumculmorum）、層出鐮孢菌（fusariumproliferatum）、尖孢鐮孢菌（fusariumoxysporum）不僅可以引起小麥的根腐病，還可以侵染玉米、水稻、多種蔬菜甚至牧草，引起根腐病。這種病害的生物防治也是當前農業生產的一大重要課題。

小麥根腐病是一種典型的土傳性真菌病害，根據小麥不同受害時期、發病部位及癥狀的不同又被稱為黑胚病、根腐葉枯病等，小麥根腐病菌能夠危害小麥的各個部位，根部受害最為嚴重。

70年代以前，小麥根腐病國外研究主要是專指由單一病菌長蠕孢菌導致的病害，隨著研究的不斷深入，80年代后，逐漸認識到小麥根腐病不是由單一病原菌引起的病害，而是多種病原菌混合發生相互影響復合侵染的一類病害，并且近幾年來許多國外學者將這一類病害作為復合根病加以研究。

國內研究，小麥根腐病也由單一病原向多病原發展，其中主要致病菌不下3種（趙宜謙等，1993）。研究表明，小麥根腐病一種病原菌是由麥根腐蠕孢菌（bipolarissorokiniana）引起的蠕孢根腐病（白金鎧等，1982；張景春等，1988），另一種是由鐮孢菌屬（fusariumspp.）真菌引起的鐮孢根腐病（李良等，1989；王樹權等，1991；樊少華等，2007）。近年，小麥根腐病發生嚴重，小麥種子的帶菌率比較高，一般病田發病率為1%~5%，較重病田發病率在10%左右。小麥根腐病對小麥產量的影響比較大，一般病田減產10%~30%，嚴重地塊會減產30%~70%（李可凡等，2003）。

在我國，防治小麥根腐病比較常用的農藥有三唑酮、三唑醇、克菌丹、福美砷、退菌特、賽力散等，一般采用藥劑拌種的方法，采用藥劑拌種與田間藥劑噴施相結合的方法，能更有效的減輕小麥根腐病的為害程度。李可凡等（2003）小麥開花始期施用噴灑25%粉銹寧可濕性粉劑或50%的福合劑，每公頃用商品藥量1500g，可控制葉部病害的發展，有較好的防病增產的效果。朱統泉等（2005）研究發現，使用立克秀、禾果利拌種對小麥紋枯病和根腐病的防治效果較好。但是使用農藥，受限于農藥的施用量、施藥方式以及降解等因素，化學防治還容易致使病原菌產生抗藥性。

小麥紋枯病是一種常見的危害性很強的土傳病害，危害小麥生長，引起小麥根部乃至全株的病害，從而造成重大的經濟損失。在病害防治中，化學農藥拌種對土傳病害有一定的效果，但是，化學農藥的使用會造成環境污染、農藥殘留，同時化學農藥的長期并且超標使用，嚴重危害甚至破壞農業生態系統，同時殺死了環境中的有益微生物，提高了植物病原菌的抗藥性，最終導致防治效果下降甚至防治失敗。發展生物防治是當前研究的一大趨勢。

技術實現要素：

為解決現有技術上的不足，本發明目的是提供一種促進農作物生長的拮抗木霉菌，不僅可以促進農作物多的生長，而且可以防治小麥或其他農作物病害，減少化學農藥的使用，保護生態環境。

本發明的技術方案如下：

一種促進農作物生長的拮抗木霉菌，其特征在于：包括保藏編號為cgmccno.9774的深綠木霉(trichoderma.atroviride)h18-1-1和/或cgmccno.9775的深綠木霉(trichoderma.atroviride)tf28。

所述深綠木霉h18-1-1和/或tf28在促進小麥等農作物生長中的應用。

所述深綠木霉h18-1-1和/或tf28在農業生物防治中的應用。

優選的，所述深綠木霉h18-1-1和/或tf28在防治禾谷絲核菌、黃色鐮孢菌、層出鐮孢菌和/或尖孢鐮孢菌等引起病害中的應用。

優選的，所述深綠木霉h18-1-1和/或tf28在防治小麥紋枯病和/或小麥根腐病中的應用。

所述深綠木霉h18-1-1和/或tf28制備的木霉菌菌劑。

優選的，木霉菌菌劑，其活性成分為如下(a)、(b)、(c)、（d）和（e）中的至少一種：

（a）權利要求1所述木霉菌；

（b）權利要求1所述木霉菌的發酵上清液；

（c）權利要求1所述木霉菌的發酵培養物；

（d）權利要求1所述木霉菌的發酵上清液的提取物；

（e）權利要求1所述木霉菌的發酵培養物的提取物。

本發明的有益效果是：本發明是一種促進農作物生長，并且高效拮抗禾谷絲核菌、黃色鐮孢菌、層出鐮孢菌和/或尖孢鐮孢菌等多種農業病原菌的木霉菌，在小麥、玉米、水稻等多種病害的生物防治上具有重要意義，本發明的應用可以減輕化學防治帶來的生態環境污染、人畜危害等問題，降低農業生產投入，減輕環境壓力，提高農作物的產量和品質。

生物樣品保藏信息如下：

深綠木霉(trichoderma.atroviride)h18-1-1和tf28，于2014年10月17日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號中科院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.9774和9775。

附圖說明

圖1是木霉菌株tf28對峙小麥紋枯病菌-207圖。

圖2是木霉菌株tf28對峙絲核菌wk-207圖。

圖3是木霉菌株tf28對峙黃色鐮孢菌正面圖。

圖4是木霉菌株tf28對峙黃色鐮孢菌反面圖。

圖5是木霉菌株tf28對峙尖孢鐮孢菌圖。

圖6是木霉菌株h18-1-1對峙尖孢鐮孢菌圖。

圖7是木霉菌株tf28對峙層出孢鐮孢菌圖。

圖8是木霉菌株h18-1-1對峙層出鐮孢菌圖。

圖9是木霉菌株t11-1-3對峙尖孢鐮孢菌圖。

圖10是tf28木霉在不同ph培養基中生長圖。

圖11是h18-1-1木霉菌絲圖。

圖12是h18-1-1菌株在pda上培養性狀圖。

圖13是拮抗木霉tf28和h18-1-15.8srdna-its區核苷酸序列分析樹狀聚類圖。

圖14是木霉處理對小麥超氧化物歧化酶活性的影響圖。

圖15是木霉處理對小麥過氧化物酶活性的影響圖。

圖16是木霉處理對小麥過氧化氫酶活性的影響圖。

圖17是是小麥根際木霉菌的定殖檢測圖。

具體實施方式

實施例1拮抗木霉菌來源和篩選

1．試驗菌株來源

2012年從山東地區的濟寧、德州、聊城、菏澤、泰安、淄博、濱州、濰坊等地區采集小麥田根部土壤，每個地區選取2-3個縣進行土壤的采集，共計50余份，對土樣采用稀釋平板法分離得到70株木霉菌。

實驗室保存的10株優良木霉菌株、t10菌株為友人所贈送。

2.木霉菌分離

2.1土壤樣品的采集

小麥紋枯病和根腐病發病比較嚴重的地塊，采樣時，先除去土壤表層1~2cm的土層鏟去，然后取土，每份土壤取三個點，取出的各點土壤充分混勻后置入無菌取樣袋中，帶回實驗室放置4℃冰箱中保存，一個月內盡快分離木霉。

2.2木霉菌的分離采用稀釋平板法

（1）稱取10g土壤，加入到90ml無菌水的三角瓶中，160rpm/min，振蕩30min，土壤懸浮液稀釋10倍。（2）吸取土壤懸浮液1ml置入裝有9ml無菌水的試管中，稀釋倍數為10²的懸浮液，一直稀釋至10³為止。（3）每100ml的pda培養基中加入鏈霉素使其達到50μg/ml，取100μl稀釋后的土壤懸浮液加入其中，涂布器涂布均勻，同時將滅菌的麥稈置于培養皿中間，每份土樣涂3皿。（4）25℃生化培養箱中培養5d后，體視鏡下鏡檢，挑單孢到pda培養基上純化菌種。

3.木霉菌的初次篩選

將分離得到的木霉菌和實驗室保存的10株菌株，以小麥紋枯病菌wk-207為指示菌，采用平板對峙法，篩選生防效果較好的菌株，為后期的復篩工作提供依據。

表1木霉菌株對峙小麥紋枯病菌wk-207抑制率

表1可見，對小麥紋枯病菌wk-207抑制率最高的是從泰安肥城分離的tf28，抑制率為60.72%，其次是實驗室保存的h18-1-1菌株。從表中選擇抑制效果最好的7株木霉菌株進行下一步的復篩，這7株木霉菌對小麥紋枯病病菌的抑制率在46.86%到60.72%之間，編號分別為tf28、tw18、t28-1-3、t35-2-3、h18-1-1、t28-1-1、t11-1-3。

4.木霉菌的復篩

木霉菌的復篩，主要測量木霉菌的生長速度、抑制率、產孢量、耐溫性、耐酸堿性、對多菌靈的耐性、揮發性代謝物對病原菌抑制率等9個性狀，采用灰色關聯度分析法綜合評價，篩選綜合性狀最優菌株。

（1）生長速度的測定

木霉菌株的生長速度是在培養基上單獨接種木霉菌株48h后菌株的生長直徑距離表示，生長三天后的木霉，用0.5cm打孔器取培養皿邊緣的菌絲片接種在無菌的pda平板上，設置3次重復，48h測定木霉菌落直徑，求平均值。

（2）對病原菌的抑制率通過采用平板對峙培養法測定

1）將所要對峙的木霉菌與病原菌同時擴大培養，三天后，同時接種培養，用直徑5mm的打孔器取新鮮培養的木霉菌和小麥紋枯病菌的菌絲塊，即培養皿邊緣的菌塊生長基本一致。

2）將木霉菌與病原菌分別同時接入平板，兩菌塊距離4cm，重復3次。

3）分別以小麥紋枯病菌wk-207和木霉菌在平板中的純培養作為對照，25℃恒溫培養，觀察病原菌菌落生長。

4）48h后，采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算木霉的抑菌率。篩選生長速度快、抑制率高的木霉菌。

抑菌率(%)=[(對照菌落直徑-對峙菌落直徑)/對照菌落直徑]×100。

（3）產孢量

將培養7d的木霉菌株，用10ml無菌水清洗培養皿，使用移液搶緩慢抽吸打出，將皿中的孢子清洗下來，然后轉移到10ml的離心管中，依次稀釋，用血球計數板計數，取三次均值。

（4）耐溫性測定

直徑5mm的菌塊木霉菌，移至pda平板中央，重復3次，5℃、25℃、10℃和35℃恒溫培養生長72h后測量菌落半徑。

（5）木霉菌耐酸堿性的測定

直徑5mm的菌塊木霉菌，移至ph為4、6、9、10的pda平板中央，重復3次，25℃下培養，生長48h后，測量木霉的菌落半徑。

（6）木霉菌耐藥性的測定

直徑5mm的菌塊木霉菌，移至含有0.1mg/l多菌靈的平板中央，重復3次，25℃培養，加入1ml無菌水為對照，48h測量木霉的菌落直徑。

（7）揮發性代謝產物對病原菌的抑制作用

采用培養皿對扣培養法測定(dennis，1971)。在培養皿的皿蓋和皿底分別倒入適量培養基。冷卻凝固后，在皿蓋中心接入直徑5mm的木霉菌塊，在皿底中心接入直徑5mm的病原菌菌塊，25℃培養箱倒置培養，對照僅接種病原菌。觀察病原菌及木霉菌絲的生長狀況，對扣培養5d后采用十字交叉法測量病原菌的菌落直徑，計算抑制率。

抑制率(%)=(對照病原菌的菌落直徑-處理病原菌的菌落直徑)/對照病原菌的菌落直徑×100。

5灰色關聯度分析法

5.1構造理想菌株

根據灰色系統理論，把7株木霉看做一個灰色系統，把每個菌株做為該系統中的一個因素。木霉菌對病原菌的生防效果和實際生長情況確定各性狀比較理想的值為參考數列x0，以參比木霉的各種性狀指標構成比較數列xi，不同性狀用k表示。

5.2數據無量綱化處理

根據上述方法，供試菌株主要生防性狀的初始化變換值，將木霉菌的生長速度、抑制率、產孢量、ph的酸堿耐性、高低溫耐性、對多菌靈的耐性、揮發性等9個指標按上限性狀。

5.3計算參試菌株與參考菌株的灰色關聯系數

首先計算性狀差序列值和性狀兩極差，性狀差序列值

。

最大性狀極差，最小性狀極差。分別計算x0與xi的絕對差值可知，m=0，m=0.8642，取0＜ζ＜1，可設ζ=0.5，將相應的絕對差值代入各參試品種性狀的灰關聯系數公式，其中ζ為分辨系數(0<ζ<1)，一般取ζ=0.5即可得到x0與xi各性狀的灰關聯系數。

5.4確定各木霉菌株綜合評估關聯系數

即，據此，可以排序各個菌株的優劣順序。

5.5.拮抗木霉菌的復篩結果與分析

利用灰色關聯度分析法，綜合分析評價7株木霉菌株，測定結果如下：

5.5.17株木霉生長速度的測定結果

生長速度測定檢結果見表2，木霉菌的生長速度非常快，各菌株差異明顯，從表中可以觀察到，生長速度最快的菌株為h18-1-1和tf28，生長直徑為9cm。木霉生防機制中，快速生長的菌絲能夠迅速地占領生態位點，爭奪營養，從而抑制病原菌的生長，達到生物防治的目的。

5.5.27株木霉菌株對4種病原菌的拮抗效果

7株供試木霉菌株對小麥紋枯病菌起到不同程度的抑制效果。由表2可以看出，木霉菌株tf28、h18-1-1表現出較好的抑制作用，tf28對小麥紋枯病菌的抑制率最大，可達到60.72%，h18-1-1次之為58.26%；與黃色鐮孢菌對峙中，tf28抑制率最高，為36.50%，其次t11-1-3和h18-1-1，抑制率相同，為33.96%；與尖孢鐮孢菌對峙中，h18-1-1抑菌效果最好，達到40%，其次是tf28和和t11-1-3，抑制率分別為39.17%和38.75%；與層出鐮孢菌對峙中，t11-1-3表現出較好的抑制效果，抑制率為38.21%，其次為h18-1-1和tf28兩株菌株。

表2供試木霉菌株的生長速度測定和對4種病原菌的抑制率

在與小麥紋枯病菌對峙試驗中，tf28生長速度最快(見圖1，圖2)，能夠迅速包圍病原菌，24h后其菌落半徑就超過了小麥紋枯病菌的直徑，在與小麥紋枯病菌對峙的方向，wk-207受到木霉菌的影響，菌絲停止生長。72h后可以看到木霉菌的菌絲在病原菌的菌落上生長，木霉菌長滿整個培養皿，并產生大量的淺綠色孢子。木霉對小麥紋枯病菌的抑制作用，一方面來自于其迅速生長的能力，占據空間，爭奪營養；另一方面是木霉具有重寄生能力，能夠在小麥紋枯病菌上面寄生，破壞菌絲體；最后可能木霉能夠產生一些抗菌的物質的代謝產物，對小麥紋枯病菌有抑制作用。

在與黃色鐮孢菌的對峙中，木霉菌和黃色鐮孢菌菌絲接觸后，能形成明顯的抑制，接觸部位菌落顏色變暗黃（見圖3、圖4）。可能是木霉菌株分泌抗生物質和重寄生作用，抑制鐮孢菌菌絲，黃色鐮孢菌在與木霉對峙的方向上，菌絲生長緩慢，可見木霉菌對病原菌的拮抗抑制作用明顯。96h后，木霉越過黃色鐮孢菌，在其菌絲上生長。

由圖5可以看到，tf28木霉在接觸到尖孢鐮孢菌后，迅速包圍其菌落，然后占據皿中大部分位置，被包圍的尖孢鐮孢菌菌落邊緣出現消解的跡象，本已經隆起的氣生菌絲開始塌陷，然后木霉菌絲迅速開始覆蓋其表面。木霉菌株h18-1-1在對峙尖孢鐮孢菌的過程中與tf28菌株相似（見圖6），雖然在48h沒有出現菌落塌陷的跡象，但是隨著木霉菌絲的迅速擴張，已經逐步開始覆蓋尖孢鐮孢菌的邊緣，同時發現在尖孢鐮孢菌的頂端出現了類似黃色油滴狀物質，可能是木霉菌消解其菌絲而產生的水滴。

木霉與層出鐮孢菌對峙中，t11-1-3表現出旺盛的生長態勢（見圖9）。其能夠迅速占領生長空間，在鐮孢菌的周圍產生深綠色的孢子，并在其菌落上面產生綠色孢子，菌絲覆蓋在鐮孢菌上，但是之后層出鐮孢菌的氣生菌絲沒有顯示出塌陷或者變色的跡象，但就對層出鐮孢菌菌絲的消解能力相比菌株tf28和h18-1-1來說表現較差（見圖7、圖8），兩株木霉均能夠立即包圍層出鐮孢菌，并對其菌絲進行消解。

5.5.37株木霉菌耐性測定結果

表37株木霉菌株耐性測定結果

（1）7株木霉菌產孢量測定結果

7株木霉菌產孢量從表3可見，t35-2-3菌株的產孢量最大，達到8.675×10⁷cfu/ml，其次是t28-1-3、h18-1-1、tf28，孢子量均能夠達到1×10⁷cfu/ml。

（2）7株木霉菌株對溫度的適應性結果

由表3可知，10℃培養24h時，木霉菌株均有所生長。在48h后，木霉的生長速度出現了差異，t28-1-1、t11-1-3、tw18菌株長勢良好。在35℃條件下，只有菌株t28-1-3、t35-2-3生長明顯，其它菌株生長速度比較慢。72h后木霉的菌落明顯老化，氣生菌絲少，孢子排列緊密，整個菌株菌落開始發白，菌落底部變黃，并停止了生長。

（3）7株木霉菌對酸堿度的適應性結果

在ph為4培養基中，木霉菌株h18-1-1和tf28生長速度最快，48h后菌落的直徑均達到9cm，說明這兩株木霉的耐酸性比較好；在ph為10的pda培養皿中，tf28和h18-1-1的菌落直徑分別為7.47cm和7.03cm，明顯高于其他菌落，表明這兩株菌株對酸性環境具有良好的耐性，同時對堿性環境具有良好的耐性（見圖10）。

（4）7株木霉菌株對多菌靈的適應性結果

對多菌靈的耐性測定中，各個菌株均表現出較強的耐性，6株木霉菌株均長滿培養皿，其中h18-1-1和tf28的生長速度最快，是72h后，木霉菌株基本長滿培養皿，對多菌靈的有強的耐性。

（5）揮發性代謝物的抑菌作用

培養96h后，對小麥紋枯病菌wk-207的抑制率最好的菌株為h18-1-1，其揮發性物質對紋枯病菌wk-207的抑制率達到了83.44%，其次是tw18和tf28，抑制率分別為78.67%和76.67%。

5.5..4利用灰色關聯度分析法綜合評價7株木霉菌株

木霉菌株的生長速度、耐低溫、耐高溫性、耐酸、耐堿性、對多菌靈的耐性及揮發性物質對紋枯病菌的抑制率（見表3）。

表47株木霉菌株的生防性狀測定結果

表5供試菌株主要生防性狀初值化變換值

表6供試菌株與參考菌株的關聯系數

表7供試菌株的灰色關聯度及排序

表5和表6是灰色關聯度分析的中間計算過程。其中，表5的數據經初值化轉化而得到的，表6數據是根據關聯系數公式計算而得到的關于供試菌株與參考菌株各測定性狀的灰色關聯度系數ξi(k)。

根據灰色關聯度分析方法原則，關聯度越大的菌株，其與參考菌株的接近程度就越大，綜合評價也越高。由表7可以看出，木霉菌株h18-1-1的灰色關聯度ri=0.7751最大，其次是tf28和t35-2-3，其灰色關聯度分別為0.7727和0.7584。其中，木霉菌株h18-1-1和tf28的關聯度與參考菌株的接近程度較大，是較理想的拮抗病原菌的木霉菌。因此，本實驗選取灰色關聯度最高兩個的木霉菌株h18-1-1和tf28，進行下一步生防效果的測定。

實施例2木霉菌形態和分子鑒定

1木霉菌形態的培養鑒定

純化木霉菌在培養產孢后，挑取孢子及產孢梗，在顯微鏡下觀察孢子，查閱原始文獻進行鑒定。

菌落在pda平板上生長快，菌絲層較厚，致密叢束狀，初期為白色，平坦，后期因產生分生孢子而呈深綠色。菌落背面無色，有時呈淺黃色。菌絲透明，有隔，細胞壁光滑，分生孢子梗由菌絲直立生出，二至三級分枝，整體像樹枝；分枝與分生孢子梗的夾角近似直角，末端為小梗。小梗瓶形，分生孢子球形或長橢圓形。

2木霉菌分子鑒定

所有供試菌株首先移植到pda平板上，在25℃生化培養箱內培養3d后，取3塊直徑為5mm的菌落塊移植于鋪有玻璃紙的培養基中，在25℃下培養4d，用液氮研磨后，采用ctab(cetyltriethylamoiumbromide)法提取dna。

2.1dna提取試劑

(1)液氮

(2)ctab提取緩沖液(2％ctab、1.4mnacl、20mmedta(ph8.0)、100mmtris.hcl(ph8.0)

(3)氯仿：異戊醇(24：1)

(4)異丙醇

(5)75％乙醇

(6)te緩沖液(2mtris.hcl、0.5medta、ddh2o)

(7)飽和酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)

(8)無水乙醇

(9)4m的naac

(10)加樣顯色液（0.25％溴酚藍、40％蔗糖水溶液）

(11)tbe電泳緩沖液5×濃貯液（54gtris堿、27.5g硼酸、20ml0.5medta）。

2.2dna提取步驟

(1)取0.2g左右的木霉菌絲置于液氮中迅速研磨成干粉狀。

(2)把粉末轉入1.5ml的離心管中，加700μlctab提取緩沖液上下輕輕顛倒數次使之混勻。

(3)65℃水浴保溫40min，每20min輕輕顛倒混勻一次。

(4)冷卻至室溫，加入等體積(700μl)的氯仿：異戊醇(24：1)輕輕混勻10min。

(5)離心(10000rpm，10min)，去沉淀，將上清液轉入另一離心管中。

(6)加入等體積異丙醇(-20℃)，輕輕顛倒混勻，室溫放置10-20min。

(7)離心去上清(10000rpm，10min)

(8)加200μl70%乙醇洗滌2次，去鹽控干。

(9)加入600μltebuffer，使沉淀溶解。

(10)用等體積飽和酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)，抽提1-3次，離心(條件同上)取上清，棄下液，將上清轉入另一管。

(11)等體積氯仿：異戊醇(24：1)，抽提1-3次，離心(條件同上)取上清棄下液，將上清液轉入另一離心管。

(12)上清液加1/4體積4mnaac溶液后，再加2×體積無水乙醇，混勻，-20℃放置45min。

(13)離心(10000rpm，5min)沉淀dna，棄上清。

(14)沉淀用75%乙醇(-20℃洗滌2-3次，37℃保溫箱中干燥后融于100μlte緩沖液中，4℃備用。

將提取的dna用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳，紫外燈下觀測所提取dna的質量及數量，將提取成功的菌株的dna溶液保存于-20℃冰箱中保存。

2.3pcr擴增

采用真菌生物核糖體dna通用引物its1/its4分別擴增10個供試菌株5.8srdna-its區的序列。其序列如下

its1序列為：5’-tccgtaggtgaacctgcgg-3’

its4序列為：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’

選用50μl反應體系，各組分的成分如下:

表8pcr擴增反應體系

擴增反應條件：

擴增結果用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，tbe為電泳緩沖液，加樣8μl。

2.4特異性擴增片段的回收

采用康寧生命科學（吳江）有限公司提供的axyprepdnagelextractionkit試劑盒進行擴增產物的回收純化。具體操作按照試劑盒說明進行。

(1)在紫外燈下切下含有目的dna的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體-并切碎。計算凝膠重量（提前記錄1.5ml離心管重量），該重量作為一個凝膠體積（如100mg=100ul體積）

(2)加入3個凝膠體積的bufferde-a，混合均勻后與75℃加熱（低熔點瓊脂糖凝膠于40℃加熱），間斷混合（每2-3min），直至凝膠塊完全熔化（約6-8min）

(3)加入0.5個bufferde-a體積的bufferde-b，混合均勻。當分離的dna片段小于400bp時，需再加入1個凝膠體積的異丙醇。

(4)吸取步驟3中的混合液，轉移到dna制備管（置于2ml離心管）中，12000×g離心一分鐘。棄濾液。

(5)將制備管置回2ml離心管，加入500ulbufferw1，12000×g離心30s，棄濾液。

(6)將制備管置回2ml離心管，加入700ulbufferw2，12000×g離心30s，棄濾液。以同樣的方法再用700ulbufferw2洗滌一次12000×g離心1min。

(7)將制備管置回2ml離心管中，12000×g離心1min。

(8)將制備管置于潔凈的1.5ml離心管中，在制備膜中央加25-30uleluent或去離子水，室溫靜置1min。12000×g離心1min洗脫dna。

2.5回收產物檢測

1%瓊脂糖凝膠電泳，加樣1μl進行回收產物的檢測。

2.6特異擴增片段的克隆

克隆載體采用的peasy-t3載體，克隆感受態細胞為大腸桿菌dh5α，均由北京全式金生物技術有限公司提供。

2.7克隆反應體系的建立

在微型離心管中一次加入pcr回收產物3.7μl，peasy-t3克隆載體0.3μl，輕輕混合，室溫反應10min，然后將離心管置于冰上反應5min。

2.8轉化

(1)加連接產物于50μldh5α感受態細胞中，輕輕混勻，冰浴反應25min。

(2)42℃熱激90s，立即置于冰上5min。

(3)加入800μllb液體培養基，200rpm，37℃孵育1h。

(4)8000rpm離心2min，去除部分上清，保留100-150μl，輕彈懸浮菌體，取全部菌液均勻涂布lb平板(含氨芐青霉素)，培養過夜。

2.9單克隆檢測

挑取平板上長出的單克隆于lb/amp⁺液體培養基中，200rpm，37℃過夜培養。以培養的菌液為模板，進行pcr檢測。

2.10序列測定及分析

將含有目的片段的克隆送北京博尚生物技術有限公司進行測序。每一序列用dnaclub軟件對正向(5’-3’)和反向(3’-5’)序列進行核對并生成5’-3’的完整序列。用bioedit軟件進行多重序列比較，mega4.1軟件構建供試菌株的系統發育樹。

2.11木霉菌h18-1-1和tf28分子鑒定結果

以提取的木霉菌絲基因組dna為模板，利用its1和its4序列引物進行pcr擴增，擴增得到特異性條帶，將pcr產物連接轉化后，單克隆子菌液送測，并對測序結果進行blast比對，菌株tf28its片段長度608bp，h18-1-1的片段長度608bp。通過在genebank核酸序列數據庫進行比對，利用mega并構建系統進化樹，待測菌株與深綠木霉(登錄號為hq229943)同源性達到100%。確定高效拮抗木霉菌株tf28和h18-1-1是深綠木霉(trichoderma.atroviride)（圖13）。

實施例3拮抗木霉菌株的促生及防病效果測定

1.木霉固體發酵產物和紋枯病菌接種體制備

（1）木霉固體發酵物制備

小麥麩皮：秸稈粉：玉米粉為物料，將木霉孢子懸浮液加入到已滅菌的物料中，發酵一周后，產生大量的綠色孢子，孢子濃度達1×10⁹cfu/g。

（2）木霉孢子懸浮液制備

將制備好的木霉固體發酵物，稱取一定量，按照所需濃度要求，用水中稀釋至所需濃度。

（3）紋枯病菌接種體制備

將小麥粒蒸煮30min后，分別裝入三角瓶，每瓶200g，葡萄糖2g，121℃高壓滅菌20min后，待其溫度涼至后，接入小麥紋枯病菌wk-207，培養兩周后備用。

2.高效拮抗木霉菌株的促生及防病效果測定

2.1溫室盆栽測定篩選木霉菌株的生防效果

小麥處理設計如下：

處理1：ck只接種小麥；

處理2：ck+小麥紋枯病菌接種體；

處理3：小麥紋枯病菌接種體+施入tf28木霉孢子懸浮液；

處理4：小麥紋枯病菌接種體+施入h18-1-1木霉孢子懸浮液。

小麥播種的同時接種小麥紋枯病菌，21d后，按照設置的不同處理方案將木霉孢子懸浮液施加到小麥中，每盆加100ml木霉孢子懸浮液，孢子懸浮液濃度為2×10⁷cfu/ml，覆蓋1cm厚的基質與土的混合物。

溫室盆栽測定tf28和h18-1-1的防病效果及小麥防御酶系的影響，主要測量小麥發病率和小麥葉片的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶：

（1）采用氮藍四唑（nbt）法測定小麥葉片超氧化物歧化酶（sod）活性；

（2）愈創木酚法檢測小麥的過氧化物酶(pod)；

（3）紫外吸收法檢測小麥過氧化氫酶（cat）活性；

（4）小麥紋枯病菌的發病率測定每盆作為一個處理單元，每盆播種10株小麥，每處理重復3次。

2.1.1木霉菌對小麥超氧化物歧化酶活性的影響

表9木霉處理對小麥超氧化物歧化酶活性的影響

由圖14可以看出，施入木霉菌處理后，小麥的超氧化物歧化酶活性上升趨勢明顯高于對照，三天后，達到頂峰，h18-1-1處理的小麥超氧化物岐化酶活性是對照的2倍。表明，木霉菌能使小麥的超氧化物歧化酶活性增高。

2.1.2木霉菌對小麥過氧化物酶活性的影響

表10木霉處理對小麥過氧化物酶活性的影響

由圖15可以看出，施入h18-1-1和tf28菌株4天后，小麥過氧化物酶活性達到頂峰，高于對照處理。說明，h18-1-1和tf28均能夠使小麥過氧化物酶活性提高（見圖15）。

2.1.3木霉菌對小麥過氧化氫酶活性的影響

表11木霉處理對小麥過氧化氫酶活性的影響

由圖16可見，施入木霉3天后，h18-1-1和tf28處理的小麥過氧化氫酶活性達到頂峰，明顯高于空白對照，之后活性開始降低，酶活性變化趨于平緩。表明，h18-1-1和tf28均能夠使小麥過氧化氫酶活性的提升。

2.1.4木霉菌對小麥紋枯病的防病情況

表12不同木霉處理對小麥紋枯病防病效果

由表12可知，h18-1-1處理的小麥，小麥紋枯病發病率低，防病效果達到63.63%，tf28的防治效果為54.45%，表明，h18-1-1和tf28兩株木霉菌能有效降低小麥紋枯病菌的發病率，減輕紋枯病對小麥的危害。

2.2沙培麥苗法測定木霉菌株的促生效果

試驗處理設計如下：

處理1：空白對照ck（只接種小麥）；

處理2：小麥ck+200mlpd；

處理3：小麥苗用木霉tf28孢子懸浮液沾根+200mlpd培養基；

處理4：小麥苗用木霉h18-1-1孢子懸浮液沾根+200mlpd培養基。

將麥粒用水浸泡后，挑選飽滿度一致并且露白的麥粒播種于水培紗網上，72h后將根長4cm的小麥在木霉孢子懸浮液中沾根，木霉孢子懸浮液的濃度1.0×10⁷cfu/ml，然后將水培箱將水置換為滅菌的沙土，同時加入200mlpd培養基利于木霉孢子的萌發，5周后檢測小麥生長指標。

每個處理隨機選取培養箱中的20株小麥進行以下的促生指標的測試：

（1）小麥根系的活力測定，采用氯化三苯基四氮唑（ttc）方法。

（2）測量小麥根數、鮮重、株高等指標。

表13不同木霉處理對小麥生長性狀的影響

由表13可見，h18-1-1和tf28處理小麥根系活力，明顯高于對照，其中h18-1-1處理根系活力最高，達到了378.76ug/（g.h）。但是，各處理間小麥的株高、地上部和地下部鮮重沒有顯著差異。

2.3田間試驗測定優良木霉菌株的生防效果

處理設計如下：

處理1：空白對照ck（魯麥21，紋枯病易感品種）；

處理2：小麥播種3周，施入tf28木霉孢子懸浮液；

處理3：小麥播種3周，施入t10木霉孢子懸浮液。

處理4：小麥播種3周，施入h18-1-1木霉孢子懸浮液；

試驗設在山東農業大學植物保護試驗站（常年人工接紋枯病菌，土壤中紋枯病菌有較多的積累），每個處理設置三個重復，每個小區的面積是2.5×2.5m²，每小區種植10行小麥，行長2.5米。配制木霉菌孢子懸浮液的濃度為2×10⁸cfu/ml，每行小麥澆灌200ml懸浮液。

田間樣品的采集與測定：

分別于小麥分蘗初期、拔節初期及灌漿后期取樣測定小麥的生長性狀指標、發病率、病情指數及千粒重、穗粒數等指標，評價不同木霉菌株的防病促生效果。

（1）分蘗期主要測定不同處理小麥的株高、根數、地上部鮮重、地下部鮮重等指標及不同木霉菌株在小麥根際的定殖情況。

（2）拔節初期主要測定不同處理小麥的株高、根數、地上部鮮重、地下部鮮重、地上部干重、地下部干重及小麥紋枯病的發病率。

（3）灌漿后期，測定不同處理小麥的千粒重、穗粒數及紋枯病的病情指數。

2.3.1分蘗初期不同木霉菌株對小麥性狀的影響

(1)采用五點取樣法對每個小區隨機采集20株小麥，室內測定小麥的分蘗數、根數、株高、鮮重等指標。

表14不同木霉菌株對小麥苗期性狀的影響

由表14中可知，h18-1-1菌株處理對小麥的分蘗數、根數、株高、鮮重等指標有明顯的促生效果，在分蘗數、根數多于對照，株高也明顯高于對照，整體生長性狀優于對照處理。此外接種的菌株tf28和t10對小麥的生長性狀有一定的促生效果。

（2）小麥根際木霉菌的定殖檢測

施入木霉孢子懸浮液30天后，采集小麥根際土壤，稀釋平板法分離木霉菌，如圖16，tf28、t10及h18-1-1處理分離的木霉菌落，菌落數量多，重復間菌落一致性強；純化后，經過形態學上的觀察與對比，與所施入的h18-1-1、t10及tf28菌落形態一致；對照處理培養皿中木霉菌落稀少，重復間菌落形態不一。說明施入土壤中的木霉菌株在小麥根際能夠定殖。

2.3.2拔節初期木霉對小麥的促生和防病效果

采用五點采樣法，小區內隨機采取20株小麥植株，帶回實驗室，測定小麥的分蘗數、根數、株高、鮮重、干重、發病率。

表15不同木霉處理對小麥生長性狀的影響

由表15可以看出，h18-1-1處理在分蘗數、根數、株高、鮮重、干重等生長指標，均優于對照處理，促生效果顯著。此外，tf28和t10與對照相比也有較明顯的促生效果。

木霉處理對小麥紋枯病發病率的防治效果如下表。

表16不同木霉處理對小麥紋枯病的防效

由表16中可見，h18-1-1處理的小麥發病率最低，發病率為56.67%，其防病效果最高，達到27.66%，其次是t10處理，防病效果為25.53%，再次是tf28處理，防病效果為17.02%，對照處理的小麥患病最嚴重，發病率達到78.33%。說明木霉能夠降低小麥紋枯病的發病率，減輕小麥紋枯病對小麥的危害。

2.3.3灌漿后期木霉對小麥的促生和防病效果

表17不同木霉處理對小麥紋枯病的防效

由表17可以看出，對照處理小麥的紋枯病病情指數為27.33，小麥患病嚴重。h18-1-1處理的小麥，其紋枯病的病情指數最低，病指為9.33，防病效果最好。其次是tf28和t10處理的小麥，其對紋枯病的防治效果也有較好的防治效果。說明木霉能夠減輕小麥紋枯病的病情，從而促進小麥健康生長。