核苷酸組合物、試劑盒及其用途的制作方法

本發明涉及分子生物學領域，具體涉及用于乙型肝炎病毒檢測的核苷酸組合物及試劑盒以及它們的用途。
背景技術：
：在我國，乙型肝炎病毒(hbv)慢性感染所致疾病仍是嚴重威脅國人健康的重大傳染性疾病。全國現有慢性hbv感染者約7000萬，其中慢性乙型肝炎(慢乙肝)患者約2000萬。慢乙肝難以治愈和引起停藥后病毒學反彈的主要原因是存在于感染肝細胞核內的病毒復制模板-hbv共價閉合環狀dna(cccdna)難以清除。因此，肝組織內hbvcccdna的清除被認為是慢乙肝患者最接近完全治愈的標志。但由于hbvcccdna的檢測需要進行肝組織活檢，限制了其在臨床上的應用。目前，臨床上多以乙肝表面抗原(hbsag)消失和/或其抗體陽轉作為評價慢乙肝“臨床治愈”的標準。但現有的藥物和治療手段很少能使慢乙肝患者血清hbsag陰轉。為減少停藥帶來的病毒學反彈和疾病復發，各國的慢乙肝防治指南多強調患者需要長期甚至終生用藥，而實際上約20％的患者停藥后不發生反彈。因此，臨床上仍缺乏甄別和確定慢乙肝患者安全停藥的可靠指標。近年的研究表明，血清中的hbsag不僅來自感染肝細胞核內的cccdna，而且整合的hbvdna片段也能轉錄翻譯產生hbsag(cornbergm,etal.jhepatol2017,66:398-411；rivkinamb,etal.gene1988,64:285-296；kaplanpm,etal.jvirol1976,17:885-893.)。因此，hbsag不能很好反映肝組織內cccdna的活性。目前臨床上已經常規定量檢測血液中的hbvdna，為診斷hbv感染及評價其抗病毒療效提供了重要的檢測手段。然而，血液中除了存在hbvdna外，也存在hbvrna。我們和其它課題組證實血液中的hbvrna為包裹在病毒樣顆粒內的未經或部分逆轉錄的前基因組rna(wangj,etal.jhepatol2016,65:700-710；jansenl,etal.jhepatol2016,213:224-232.)，并且血液中的hbvrna能很好地反映肝細胞內cccdna的活性(wangj,etal.jhepatol2017,66:462-463；gierschk,etal.jheptol2017,66:460-462.)。隨著核苷(酸)類藥物在抗病毒治療中的廣泛應用，hbvdna的合成被有效阻斷，血液中的hbvdna水平經過一段時間抗病毒治療后迅速下降并消失。然而，由于核苷(酸)類藥物主要作用于hbv復制的逆轉錄過程，對于cccdna轉錄形成hbvrna無明顯影響，因此，即使血液中檢測不到hbvdna，由于cccdna的持續存在，血液中仍存在hbvrna。所以，血液中hbvdna和rna均為hbvcccdna存在和復制的標志，血液中hbv總核酸(hbvdna+rna)的定量檢測顯得尤為重要。然而，目前針對hbv的基因檢測主要集中于hbvdna的檢測。如果能夠一次性檢測出樣品中hbv總核酸(dna+rna)，則對于評價慢乙肝患者抗病毒治療的療效和預后以及指導安全停藥非常有利。然而，目前hbv基因的檢測，或者僅檢測dna，或者僅檢測rna，例如中國專利申請公布cn105907891a公開了只檢測pgrna的方法。現有技術中沒有公開能夠一次性檢測樣品中hbv總核酸(dna+rna)的任何有效試劑，因此，迫切需要高度靈敏和精確的新型血液hbv總核酸檢測方法。技術實現要素：為了解決至少部分上述技術問題，發明人在對我國存在的不同基因型hbv序列進行分析后，設計多條高度保守的核苷酸組合物。利用該核苷酸組合物能夠在一次檢測中同時高靈敏和精確地檢測出我國目前存在的各種基因型hbv，并且可以一次檢測樣品中的全部核酸，包括hbvdna和hbvrna。具體地，本發明包括以下內容。本發明的一方面，提供核苷酸組合物，其包含序列分別為選自seqidno:1的連續的部分序列的第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸，其中：所述第一核苷酸的序列長度為15-30bp；所述第二核苷酸的序列如式：(n)xaggcgaggg(n)y所示，其中n選自a、t、g和c組成的組；x和y各自為選自0-21的整數，且6≤x+y≤21。所述第三核苷酸的序列的長度為15-35bp，其5’端與所述第一核苷酸的序列3’端的距離為1-25bp，其3’端與所述第二核苷酸的序列5’端的距離為1-25bp；在某些實施方案中，第一核苷酸的序列包含ccaccaaatgccccct。在某些實施方案中，第三核苷酸的序列包含caacacttccggaaactactg。在某些實施方案中，第二核苷酸的序列中，x＝0，且y為3-7的整數；或者x為10-15的整數，且y＝0。在某些實施方案中，所述第一核苷酸、所述第二核苷酸和所述第三核苷酸以混合物的形式存在。在某些實施方案中，所述第一核苷酸、所述第二核苷酸和所述第三核苷酸以各自獨立的形式存在。本發明的另一方面，提供試劑盒，其包含本發明所述的核苷酸組合物。本發明的再一方面，提供檢測樣品中是否存在乙型肝炎病毒的非診斷性方法，其包括使用本發明的核苷酸組合物或試劑盒。在某些實施方案中，本發明的非診斷性方法包括在一次反應中同時檢測乙型肝炎病毒的dna和rna的步驟；或者包括在檢測之前將樣本中的rna逆轉錄為cdna的步驟。在某些實施方案中，所述樣品為血液樣品，例如血清。本發明的又一方面，提供本發明的核苷酸組合物或試劑盒在制備用于乙型肝炎病毒檢測的試劑中的用途。通過本發明的核酸組合物能夠在一次檢測中同時高度靈敏和精確地檢測出我國目前存在的各種基因型的hbv，例如a-d四種基因型，包括我國主要存在的b型和c型hbv，在我國新疆、西藏等地分布的d型hbv、以及散發分布的a型hbv。可選地，可以一次檢測樣品中的全部核酸，包括dna和rna。這對于以hbvdna+rna檢測在指導慢乙肝患者抗病毒治療中的應用具有極其重要的意義。此外，本發明的核酸組合物還可以避免與其它病毒或人類基因發生非特異結合，進而防止了假基因的擴增，提高了檢測的準確性。附圖說明圖1本發明示例性引物和探針所在hbv基因組中的位置圖。圖2不同引物組合的pcr產物凝膠電泳圖，其中的數字表示序列號，例如，1表示seqidno:1的序列。圖3探針濃度梯度檢測結果。圖4溫度梯度檢測結果。圖5檢測a基因型hbv靈敏度檢測結果。圖6檢測b基因型hbv靈敏度檢測結果。圖7檢測c基因型hbv靈敏度檢測結果。圖8檢測d基因型hbv靈敏度檢測結果。圖9特異度檢測結果。圖10精密度檢測結果。具體實施方式現詳細說明本發明的多種示例性實施方式，該詳細說明不應認為是對本發明的限制，而應理解為是對本發明的某些方面、特性和實施方案的更詳細的描述。應理解本發明中所述的術語僅僅是為描述特別的實施方式，并非用于限制本發明。另外，對于本發明中的數值范圍，應理解為具體公開了該范圍的上限和下限值以及它們之間的每個中間值。在任何陳述值或陳述范圍內的中間值以及任何其他陳述值或在所述范圍內的中間值之間的每個較小的范圍也包括在本發明內。這些較小范圍的上限和下限可獨立地包括或排除在范圍內。除非另有說明，否則本文使用的所有技術和科學術語具有本發明所述領域的常規技術人員通常理解的相同含義。雖然本發明僅描述了優選的方法和材料(例如，組合物或試劑盒)，但是在本發明的實施或測試中也可以使用與本文所述相似或等同的任何方法和材料。本說明書中提到的所有文獻通過引用并入，用以公開和描述與所述文獻相關的方法和/或材料。在與任何并入的文獻沖突時，以本說明書的內容為準。本發明中，名詞術語既包括單數形式，也包括復數形式，除非上下文另行明確指出。“樣品”包括一種或多種樣品和為本領域技術人員所已知的其等同物等等。本發明中所述的“至少之一”或“至少一種”不僅僅指包含“一個”或“一種”的情況，更重要的還包含“多個”或“多種”的情況。如本發明所用術語“核苷酸”是指長度為10-40bp之間的短核苷酸或寡核苷酸，優選單鏈核苷酸，更優選在反應條件下核苷酸保持單鏈狀態，不會因核苷酸自身相互作用而形成環狀結構或發卡結構。在設計能夠準確和靈敏地檢測多種不同基因型的核苷酸時，通常選擇不同基因型之間高度保守的區域作為核苷酸的結合區域。然而，發明人發現，雖然在hbv基因組2355位上游存在多個可變區域，例如2354位和約2280-2310之間的區域，但是在seqidno:1(2221-2401)所示序列對應的區域(可變區+保守區)中，仍然可以設計得到具有高準確性和靈敏度的引物和/或探針，這對于本領域技術人員而言是出乎意料之外的。具體地，在seqidno:1所示的序列中選擇包含aggcgaggg的約15-30bp的序列作為第二核苷酸，同時選擇距離aggcgaggg的5’端約超過150bp，例如超過200bp的序列作為第一核苷酸，利用第一和第二核苷酸的組合可準確和靈敏地檢測多種不同基因型的hbv是否存在及其濃度。本領域技術人員在設計引物時，通常需要將核苷酸中gc的含量控制為40％-60％之間，優選45-55％。因此，盡量避免高gc含量。而發明人發現選擇包含gc含量高達近78％的aggcgaggg區域的序列仍然可以作為有效引物。此外，通過以(n)xaggcgaggg(n)y所示的結構作為第二核苷酸，并通過特定的位置關系來設計其它核苷酸可以避免與其它病毒或人類基因發生非特異結合，進而防止了假基因的擴增，提高了檢測的準確性。這對于當使用來源于人類的樣品作為檢測物時是特別有益的。在某些實施方案中，第二核苷酸的序列為包含seqidno:1所示的部分連續序列，其具有式：(n)xaggcgaggg(n)y所示的結構，其中n選自a、t、g和c組成的組；x和y各自為選自0-21的整數，且6≤x+y≤21。在某些實施方案中，第二核苷酸的序列中的x＝0，且y為3-7的整數，例如6或7。在某些實施方案中，x為10-15的整數，例如13，且y＝0。在某些實施方案中，第二核苷酸的序列如seqidno:3所示。在某些實施方案中，第一核苷酸的序列為seqidno:1所示的序列中的部分連續的序列，且包含ccaccaaatgccccct，以便與第二核苷酸具有相似的tm值。在某些實施方案中，第一核苷酸的序列如seqidno:2所示。在某些實施方案中，進一步包含第三核苷酸，其長度為15-35bp，第三核苷酸序列的5’端與第一核苷酸的序列3’端的距離為1-25bp，第三核苷酸序列的3’端與第二核苷酸中aggcgaggg的距離為至少28bp。在某些實施方案中，第三核苷酸的序列如seqidno:4所示。在某些實施方案中，第三核苷酸的序列為seqidno:1所示的序列中的部分連續的序列，且包含caacacttccggaaactactg，以便使第三核苷酸的tm值高于第一和第二核苷酸。在某些實施方案中，第三核苷酸的序列如seqidno:4所示，其中在其5’端標記有fam，在其3’端標記有bhq1。在某些實施方案中，第三核苷酸為探針。作為探針的實例包括，但不限于taqman探針、mgb探針、雜交探針。優選地，在探針5’端標記熒光發光基團。所述熒光發光基團的實例包括，但不限于fam、vic、tet、joe、rox、cy3、cy5、hex。在某些實施方案中，本發明可使用上述熒光發光基團中的一種或多種。另外，優選地，在探針3’端標記熒光猝滅基團。所述熒光猝滅基團的實例包括bhq1、bhq2、bhq3、tamra、dabcyl、nfq。在某些實施方案中，本發明可使用上述熒光猝滅基團中的一種或多種。在某些實施方案中，本發明的組合物中第一核苷酸的序列如seqidno:2所示(其中y為簡并堿基，本文中的序列中“y”具有與此處相同的含義)，第二核苷酸的序列如seqidno:3所示，和第三核苷酸的序列如seqidno:4所示。此組合物的組合經過多輪篩選和優化，具有優異的靈敏度和特異度。在某些實施方案中，本發明的組合物進一步包含其它核苷酸。所述其它核苷酸的實例包括，例如逆轉錄引物。在某些實施方案中，所述逆轉錄引物的序列如seqidno:5所示。在某些實施方案中，所述逆轉錄引物使用中國專利公布號cn20160706a中公開的引物。在某些實施方案中，本發明的核苷酸序列如下表1所示，引物和探針所在位置如圖1所示。表1primer名稱seqidno序列(5’to3’)2264p-f1ttyggagtgtggattcgc2269p-f2ggagtgtggattcgcactcc2297p-f3agaccaccaaatgcccct2381p-r4cgtctgcgaggcgaggg2374p-r5cgaggcgagggagttctt2298-p6gaccaccaaatgcccctatcytat2312p-p7cctatcttatcaacacttccggaaactactg2322-p8caacacttccggaaactactgttgttagacg在某些實施方案中，所述第一核苷酸序列包含5’端引物。所述5’端引物可作為本發明中所述核酸擴增的特異性引物，其可用于擴增核酸內作為目標的特定區域，所述目標的特定區域根據不同需求而選定，并不特別限定。例如，特定區域一般為50-500pb長度，優選60-400pb，更優選70-300pb，還優選80-200pb。對于特定區域并不特別限定，只要所選定的區域對應的引物滿足作為引物的基本條件即可，所述基本條件是本領域技術人員已知的條件。具體可參見，冷泉港的《分子克隆實驗指南》第四版等公開出版物。在某些實施方案中，所述第二核苷酸序列包含3’端引物。3’端引物可作為核酸擴增的統一引物。本發明中，所述第一核苷酸序列和/或所述第二核苷酸序列可包含其他序列，包括但不限定于，例如，索引序列、標記序列等。關于這些序列的連接方式，并不特別限定。例如，在第一核苷酸序列中，從5’端至3’方向，可以標記序列(例如，p7序列)、索引序列、5’端引物這樣的順序進行連接。在某些實施方案中，核苷酸可分別提供，或者將兩者作為混合物一起提供。核酸的濃度或含量并不特別限定，并且這些參數是本領域技術人員能夠根據不同的需求而調整變化的。第一核苷酸序列和第二核苷酸序列的濃度或含量通常情況下相同，本領域技術人員根據不同需求，也可將兩者的濃度或含量配制為不同。在某些實施方案中，在一次反應中同時檢測乙型肝炎病毒的dna和rna的步驟中，可包括建立反應環境，從而使本發明核苷酸與靶序列結合。所述反應環境通常為水性環境，并且溫度為20-40℃之間，優選37℃左右。所述環境條件是本領域技術人員能夠確定的。在某些實施方案中，檢測步驟可采用本領域內通常使用的方法，例如各種類型的pcr方法。本發明所述的組合物和試劑盒包含第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸。在某些實施方案中，任何上述物質之一可以與其他物質分離的狀態單獨存在，例如，第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸分別存放于不同的容器(例如，小瓶)中，只要在使用時它們能夠相互接觸，從而作為一套或一組成分即可。另外，優選地，任何兩種以上的上述物質可混合作為混合物存在。例如，將第一核苷酸和第二核苷酸兩者作為混合物，而其他物質單獨存在的狀態；或者，將第一核苷酸、第二寡核苷酸和第二核苷酸三者的混合物作為一體而存在。在示例性實施方式中，本發明的第一核苷酸、第二核苷酸和第三核苷酸分別以干燥粉末的形式提供。可選地，上述三種物質的至少之一為溶液，例如水溶液的狀態存在。在以水溶液狀態存在的情況下，這些物質的濃度或含量是本領域技術人員能夠根據不同需求而方便地確定的。例如，用于儲存的目的時，所述物質，例如核苷酸的濃度可以較高的形式存在，當處于工作狀態或使用時，可通過例如稀釋上述較高濃度的溶液來將濃度降低至工作濃度。優選地，本發明的組合物或試劑盒可進一步包含其他試劑或成分。例如，用于進行pcr所需的dna聚合酶、各類dntp和離子如mg2+等。這些其他試劑或成分是本領域技術人員已知的，并且可通過例如冷泉港的《分子克隆實驗指南》第四版等公開出版物容易地獲知。優選地，本發明中的試劑盒還進一步包含使用說明書，其中在使用說明書中給出或教導了實施本發明所述方法或使用本發明所述組合物或試劑盒的指導、指引或教導。實施例在沒有特別說明的情況下，本發明中使用的任何試劑均為市場購買的一般試劑。血液樣本來自首都醫科大學附屬佑安醫院收集的樣本。檢測方法和體系的建立采用的taqman探針法定量檢測血液hbv核酸。其中第一核苷酸為正向引物，seqidno:1，第二核苷酸為反向引物，seqidno:5，第三核苷酸為探針，seqidno:6。先利用逆轉錄引物hr-rt將所提樣本中的rna逆轉錄為cdna。然后利用hbv特異性正、反向序列引物進行擴增，taqman探針序列緊靠正向引物。為了確定本發明所確定引物和探針的檢測體系，發明人首先采用瓊脂糖凝膠的方法檢測了引物的特異性。結果顯示，本發明中pcr產物條帶單一，沒有雜帶，引物的特異性高(圖2)。此外，發明人分別嘗試檢測體系中探針用量和退火溫度兩個關鍵因素對熒光定量pcr反應的影響。結果顯示，不同濃度的探針對于熒光定量pcr反應的擴增強度和靈敏度無明顯影響，所得擴增曲線基本重疊。不同退火溫度對熒光定量pcr反應的擴增強度和靈敏度有一定的影響，具體參見圖3和圖4。實驗步驟：樣本處理：血清或血漿常規制備方法。hbvpgrna的提取:使用病毒核酸提取試劑盒(全式金-easypureviraldna/rnakit)，提取乙型肝炎(c型)患者血清或血漿中hbvrna和dna，得到檢測樣本。采用一步法逆轉錄-熒光定量pcr(qrt-pcr)方法檢測hbv總核酸(dna+rna)，將提取的病毒總核酸(hbvdna+rna)中的hbvrna逆轉成cdna后進行熒光定量pcr擴增。配制一步法qrt-pcr反應體系(20μl)輕彈混勻，瞬離，在abisteponeplus熒光定量pcr儀中，25℃10分鐘，50℃30分鐘；94℃預變性5分鐘；然后94℃25秒，55℃30秒，40個循環；在每個循環的延伸階段(55℃)同步采集熒光。構建診斷試劑標準品取1.2×hbvdna質粒，將質粒轉入大腸桿菌進行培養，試劑盒提取質粒，nanodrop檢測所提質粒濃度，換算成拷貝濃度，然后稀釋到特定濃度作為標準品使用。試劑性能檢測：1.靈敏度：將構建好的a、b、c和d基因型質粒標準品進行10倍倍比稀釋，濃度分別為3.00e+09、3.00e+08、3.00e+07、3.00e+06、3.00e+05、3.00e+04、3.00e+03、3.00e+02copies/ml。用上述確定的檢測體系和循環參數對倍比稀釋的標準品進行定量檢測。結果顯示，本發明的熒光定量檢測方法具有較高的靈敏度，在3.00e+02copies/ml時也可檢出，結果如圖5-8所示。結果參見圖3。2.特異度：選取感染hbv患者血液，提取hbv核酸樣本，將之分成四組，一組經逆轉錄處理后上機檢測(dna+rna)，一組用dna酶處理后直接上機檢測，第三組用dna酶處理后，再經過逆轉錄后上機檢測(rna)，第四組為正常人血清樣本直接上機檢測(陰性樣本)。結果如圖9所示。在不背離本發明的范圍或精神的情況下，可對本發明說明書的具體實施方式做多種改進和變化，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。由本發明的說明書得到的其他實施方式對技術人員而言是顯而易見得的。本申請說明書和實施例僅是示例性的。3.精密度：選取質粒濃度為3.00e+06copies/ml的標準品進行檢測，重復10次。結果顯示，10次重復檢測的ct值的標準差(sd值)均小于2％，重復性較好。參見圖10。sequencelisting<110>北京大學<120>核苷酸組合物、試劑盒及其用途<130>1700061cn<160>10<170>patentinversion3.3<210>1<211>18<212>dna<213>waldsteiniafragarioides<400>1ttyggagtgtggattcgc18<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2ggagtgtggattcgcactcc20<210>3<211>18<212>dna<213>人工序列<400>3agaccaccaaatgcccct18<210>4<211>17<212>dna<213>人工序列<400>4ccctcgcctcgcagacg17<210>5<211>18<212>dna<213>人工序列<400>5aagaactccctcgcctcg18<210>6<211>24<212>dna<213>人工序列<400>6gaccaccaaatgcccctatcytat24<210>7<211>31<212>dna<213>人工序列<400>7cctatcttatcaacacttccggaaactactg31<210>8<211>31<212>dna<213>人工序列<400>8caacacttccggaaactactgttgttagacg31<210>9<211>31<212>dna<213>人工序列<400>9cacacgacactttcccaccttatgagtccaa31<210>10<211>240<212>dna<213>hepatitisbvirus<400>10tcttacttttggaagagaaactgttcttgagtatttggtatcttttggagtgtggattcg60cactcctccagcttacagaccaccaaatgcccctatcttatcaacacttccggaaactac120tgttgttagacgacgaggcaggtcccctagaagaagaactccctcgcctcgcagacgaag180gtctcaatcgccgcgtcgcagaagatctcaatctcgggaatctcaatgttagtatccctt240當前第1頁12