四色TORCH熒光檢測試劑盒的制作方法

本發明屬于分子生物學領域，涉及一種torch熒光檢測試劑盒，特別涉及一種四色torch熒光檢測試劑盒。
背景技術：
：torch是指可導致先天性宮內感染及圍產期感染而引起圍產兒畸形的病原體，在婦女孕前和孕期能夠引起宮內和胎兒感染的微生物主要有弓形體(toxoplasmagondii，toxo)、風疹病毒(rubellavirus，rv)、巨細胞病毒(cytomegalovirus，cmv)、單純皰疹i型和ii型病毒(herpessimplexvirus，hsv)五種，他們對優生優育的危害比較嚴重。1971年nalmias特就這幾個微生物英文名稱的第一個字母撰造出“torch”一詞，to代表弓形體；r代表風疹病毒；c代表巨細胞病毒；h代表單純皰疹i型和ii型病毒。torch感染在圍產醫學中稱之為“torch綜合癥”。這組微生物感染有著共同的特征，即可造成母嬰感染。孕婦由于內分泌改變和免疫力下降易發生原發感染，既往感染的孕婦體內潛在的病毒也容易被激活而發生復發感染。孕婦發生病毒血癥時，病毒可通過胎盤或產道傳播感染胎兒，引起早產、流產、死胎或畸胎等，以及引起新生兒多個系統、多個器官的損害，造成不同程度的智力障礙等癥狀。特別在懷孕初的三個月胚胎處于器官形成期，此時受病毒感染，可破壞細胞或抑制細胞的分裂和增殖。器官形成期以后感染病毒，可破壞組織和器官結構，并可形成持續感染，出生后繼續排毒，能引起相應的病變。其中弓形蟲寄生于細胞內，隨血液流動，到達全身各部位，破壞大腦、心臟、眼底，致使人的免疫力下降；風疹病毒主要通過呼吸道傳播，孕婦感染后能使胎兒致畸，病毒通過胎盤感染胎兒形成先天性感染，稱為先天性風疹綜合癥(crs)，主要是先天性白內障、先天性心臟病和神經性耳聾，風疹感染發生在孕期越早，胎兒的致畸也越嚴重；巨細胞病毒感染能引起宮內胎兒生長遲緩、小頭形、腦炎、視網膜脈膜炎、黃疸、肝脾腫大、溶血性貧血等，新生兒死亡率較高；懷孕早期感染單純皰疹病毒(hsvi、ii型)能破壞胚芽面導致流產，孕中晚期雖少發畸胎，但可引起胎兒和新生兒發病。torch的感染影響著人口素質，與優生優育有重要關系。目前，臨床上最常用的torch檢測是elisa法，常規的elisa檢測的是抗體，常檢測igm和igg抗體，即可判斷近期感染(igm指標)，又可檢測人群抗體(免疫力)水平(igg指標)，但是如果要對5種病原體進行檢測，就需要十幾種試劑盒才能將所有的igm和igg檢測完畢，每次反應只能檢測一個指標，速度慢，效率低，費用昂貴，需要樣本量大，并存在一定的窗口期，可能導致假陰性。現有的運用熒光pcr方法進行torch病原體檢測的技術的缺點主要是擴增靈敏度低，耗時長。前期一般都需要經過步驟繁瑣的核酸提取，然后運用普通taqman探針的方法進行多重pcr擴增，而且一般都是fam和hex兩通道檢測，所以一管只能檢測一種病原體，難以滿足實際使用的需要。開發出可以快速、高效的四色torch熒光檢測試劑盒，具有非常實際的意義。技術實現要素：本發明主要是提供一種四色torch熒光檢測技術，能夠解決現有技術擴增靈敏度低、耗時長等問題。本發明所采取的技術方案是：四色torch熒光檢測試劑盒，包括dna提取液、熱啟動taq酶系統、引物、熒光探針、陰性對照和陽性對照，熒光探針為torch特異性mgb探針，torch特異性mgb探針的序列如下：探針1catcgcgtctgtagtccccttcga（seqidno：1）探針2cgaattgccacggccccga（seqidno：2）探針3agccatccacatctcccgcttatcctc（seqidno：3）探針4tggggttgggtggtggaggaga（seqidno：4）探針5cgacaccctccatactgccgaag（seqidno：5）；上述探針的3’端連接有mgb，5’端連接有熒光基團，其中，四色torch熒光檢測試劑盒探針1用于檢測弓形蟲；探針2用于檢測風疹病毒；探針3用于檢測巨細胞病毒；探針4～5用于檢測單純皰疹i型和ii型病毒。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒中所使用的通用引物為：引物1tcatctacagtcctgatatctctcct（seqidno：6）引物2ggagccacagaagggacag（seqidno：7）引物3acaccggcaatcagcagtcc（seqidno：8）引物4gcgagcagtcaggggaatg（seqidno：9）引物5ctatgcagagcatgtatgagaac（seqidno：10）引物6cacatcatgcagctcctt（seqidno：11）引物7ttatcccattccttttggttctt（seqidno：12）引物8gggtcatgttgggggctt（seqidno：13）引物9gtcagcccatcctccttcg（seqidno：14）引物10gggaagcatttacgagagcg（seqidno：15）。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒中所使用的熱啟動taq酶系統中添加有udg酶。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒中所使用的熱啟動taq酶系統含有經過化學修飾的熱啟動taq酶、dntps和udg酶，其中每人份體系中熱啟動taq酶為4~7u，dntps為0.1~0.4mmol/l，udg酶為0.1~0.5u。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒的dna提取液的組成為edta的濃度為0.15~0.75mol/l、乙酸鈉的濃度為15~35mmol/l和dtt的濃度為1~5mmol/l。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒中所使用的探針16～18連接的熒光基團不同于探針1～15連接的熒光基團。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒所使用的內標探針上連接的熒光基團不同于探針1～18的。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒所使用的探針1連接的熒光基團不同于探針2～5連接的熒光基團。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒所使用的探針2連接的熒光基團不同于探針1，3～5連接的熒光基團。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒所使用的探針3連接的熒光基團不同于探針1，2，4，5連接的熒光基團。優選的，上述四色torch熒光檢測試劑盒所使用的探針4～5連接的熒光基團不同于探針1～3連接的熒光基團。本發明的有益效果是：本發明的試劑盒適用于定性檢測血清或血漿樣本中弓形體、風疹病毒、巨細胞病毒、單純皰疹i型和ii型病毒。本發明應用多重熒光pcr技術實現了在同一管擴增體系中檢測5種病原體，本發明的檢測試劑盒，檢測通量高，大大降低了篩查成本。通過加入udg酶防污染，使得本發明試劑盒的靈敏度更高，最低檢出量為1.0e+03拷貝/反應。附圖說明圖1：弓形體陽性樣本檢測結果示意圖圖2：風疹病毒陽性樣本檢測結果示意圖圖3：巨細胞病毒陽性樣本檢測結果示意圖圖4：單純皰疹i型陽性樣本檢測結果示意圖圖5：單純皰疹ii型陽性樣本檢測結果示意圖圖6：陰性樣本檢測結果示意圖圖7：風疹病毒最低檢出量檢測結果示意圖。具體實施方式下面結合實施例，進一步說明本發明。四色torch熒光檢測試劑盒，包括dna提取液、熱啟動taq酶系統、引物、熒光探針、陰性對照和陽性對照，熒光探針為torch特異性mgb探針，hpv特異性mgb探針的序列如下：探針1catcgcgtctgtagtccccttcga（seqidno：1）探針2cgaattgccacggccccga（seqidno：2）探針3agccatccacatctcccgcttatcctc（seqidno：3）探針4tggggttgggtggtggaggaga（seqidno：4）探針5cgacaccctccatactgccgaag（seqidno：5）；上述探針的3’端連接有mgb，5’端連接有熒光基團，其中，探針1連接的熒光基團為fam，探針2連接的熒光基團為hex，探針3連接的熒光基團為texasred，探針4連接的熒光基團為cy5。上述四色torch熒光檢測試劑盒中所使用的通用引物為：引物1tcatctacagtcctgatatctctcct（seqidno：6）引物2ggagccacagaagggacag（seqidno：7）引物3acaccggcaatcagcagtcc（seqidno：8）引物4gcgagcagtcaggggaatg（seqidno：9）引物5ctatgcagagcatgtatgagaac（seqidno：10）引物6cacatcatgcagctcctt（seqidno：11）引物7ttatcccattccttttggttctt（seqidno：12）引物8gggtcatgttgggggctt（seqidno：13）引物9gtcagcccatcctccttcg（seqidno：14）引物10gggaagcatttacgagagcg（seqidno：15）。上述四色torch熒光檢測試劑盒中所使用的熱啟動taq酶系統含有經過化學修飾的熱啟動taq酶、dntps和udg酶，其中每人份體系中熱啟動taq酶為5u，dntps為0.2mmol/l，udg酶為0.3u。上述四色torch熒光檢測試劑盒中所使用的dna提取液的組成為edta的濃度為0.25mol/l、乙酸鈉的濃度為25mmol/l和dtt的濃度為1mmol/l，1200μl/管。陰性質控品：滅菌純化水，100μl/管；陽性質控品：五種病毒靶核酸拼接在一起的質粒，100μl/管。實施例1四色torch熒光檢測試劑盒的檢測操作方法：1.樣本處理與dna提取向50ul血清或血漿樣本中加入50μl病毒提取液，震蕩60秒，充分懸浮細胞沉淀，備用。核酸的提取也可以使用其他公知的方法進行；質控品處理取裝有陽性質控品、陰性質控品的離心管，10,000rpm離心30秒，備用；核酸擴增試劑準備（試劑準備區，冰上操作）1)從試劑盒中取出torchpcr反應管，瞬時離心備用；2)往上述反應管中分別加入提取后的待測樣本核酸20μl（如樣本不足20μl，請用滅菌純化水補足20μl后加樣）、陰性質控品、陽性質控品各20μl。蓋緊管蓋，5000rpm離心30秒后轉移至擴增檢測區；擴增pcr參數為：50℃，15min；95℃，5min；95℃，5s，58℃，31s，循環45次；在58℃時測定熒光值；根據熒光值變化曲線，確定檢測結果；質量控制樣品名稱fam通道hex通道texasred通道cy5通道結果陰性質控品無對數擴增曲線無對數擴增曲線無對數擴增曲線無對數擴增曲線陰性陽性質控品有對數擴增曲線，ct≤37有對數擴增曲線，ct≤37有對數擴增曲線，ct≤37有對數擴增曲線，ct≤37陽性使用本試劑盒和對照試劑盒對臨床樣本進行檢測，兩者不符的使用復核試劑盒進行檢測，并根據對照與復核檢測結果將樣本分為陽性組和陰性組，對比本試劑盒檢測的ct值，從而確定本試劑盒參考值，當本試劑盒ct值大于37時，均屬于陰性組，當本試劑盒ct值小于等于37時，均屬于陽性組。因此，將ct值大于37作為為本試劑盒的參考值（cutoff值）。使用本發明檢測試劑盒的檢測結果示意圖如圖1～7所示。從圖中可以清楚地看出，本發明的檢測試劑盒可以有效地檢測出torch病原體，檢測結果準確可靠。上述實施例只是對本發明方案的舉例說明或解釋，而不應理解為對本發明方案的限制，顯然，本領域的技術人員可對本發明進行各種修改和變型而不脫離本發明的精神和范圍。倘若這些修改和變型屬于本發明權利要求及其等同技術的范圍之內，則皆應屬本發明的保護范圍。sequencelisting<110>廣州和實生物技術有限公司<120>四色torch熒光檢測試劑盒<130>2017<160>15<170>patentinversion3.5<210>1<211>24<212>dna<213>人工序列<400>1catcgcgtctgtagtccccttcga24<210>2<211>19<212>dna<213>人工序列<400>2cgaattgccacggccccga19<210>3<211>27<212>dna<213>人工序列<400>3ag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