一種牛副流感3型病毒3種基因型多重RT?PCR檢測方法與流程

本發明屬于病毒檢測領域，具體涉及病毒性傳染病的檢測方法，特別是涉及一種牛副流感3型病毒3種基因型的檢測方法及應用領域。

背景技術：

牛副流感是由牛副流感3型病毒引起的一種急性、接觸性傳染病，以呼吸道癥狀為主，單一病毒感染癥狀較輕，混合感染其他病毒細菌或在應激因素的作用下會引起嚴重的臨床癥狀甚至導致病牛的大量死亡。牛副流感3型病毒（bovineparainfluenza3virus，bpi3v），是副黏病毒科呼吸道病毒屬的單股負鏈rna病毒，基因組由約15000多個核苷酸組成，至少編碼6種結構蛋白。該病毒目前分為bpi3v基因a型、bpi3v基因b型和bpi3v基因c型3個基因型。牛副流感3型病毒自1959年被美國的reisinger等從犢牛腎臟中首次分離之后，陸續被世界上許多國家分離。國內首次關于bpi3v的報道是在2001年童澤恩等對有呼吸道癥狀死牛剖檢后發現疑似牛副流感。我國牛群中第一次被分離到bpi3v是在2009年，由劉鵬等分離內蒙分離株(nm09)并在2012年由中國學者wen等鑒定為bpi3v基因a型，中國學者zhu等分離并鑒定出bpi3v基因c型山東分離株(sd0835)。我國目前沒有分離到bpi3v基因b型。到目前為止，國內外許多學者都建立了針對檢測bpi3v的rt-pcr方法，但沒有針對bpi3v的3種亞型的rt-pcr檢測方法。隨著國內外對bpi3v的廣泛研究，越來越多地區被發現有bpi3v的流行，而近幾年我國多個省份的血清學調查也顯示牛副流感3型病毒抗體陽性率較高，其中內蒙古血清陽性率達84.31%（霍志云，2012）和95.20%（張欣欣，2016）。鑒于內蒙古部分地區牛副流感血清學調查陽性率高，但對其病原學調查尚不充分。同時多重rt-pcr以其操作簡便、快速的優點常用于臨床實踐。本研究以建立了bpi3v的hn基因為靶序列，建立了檢測bpi3v和區分其3種基因型的多重rt-pcr檢測方法。為該病檢驗檢疫提供有效實用的檢測方法。

技術實現要素：

根據genbank上發表的bpi3v的3種基因型分離株nm09（登錄號：jq063064)、tvmdl15（登錄號：kj647284)、sd0835（登錄號：hq530153)各自的hn基因進行序列比較分析，設計了3對特異性引物，建立了檢測bpi3v的3種基因型的多重rt-pcr檢測方法，從而實現對bpi3v的高效、快速、準確檢測分型。

本發明的目的在于除通過多重rt-pcr方法可用于bpi3v的臨床檢測，還能同時鑒別檢測bpi3v的3種基因型。

本發明的目的在于提供一種多重rt-pcr檢測牛副流感3型病毒（bpi3v）3種基因型的引物，所述引物如表一所示。

本發明的目的在于提供一種多重rt-pcr檢測牛副流感3型病毒（bpi3v）3種基因型的試劑盒，所述試劑盒包括檢測牛副流感3型病毒（bpi3v）3種基因型的引物。

本發明具體提供了一種多重rt-pcr檢測牛副流感3型病毒（bpi3v）3種基因型檢測方法，具體步驟如下。

1.引物和探針的設計與合成：

根據genbank上發表的牛副流感3型病毒a型分離株nm09、b型分離株tvmdl15、c型分離株sd0835各自的hn基因序列比較分析，使用oligo6.0軟件設計了特異性引物，引物交由寶生物工程(大連)有限公司合成，擴增長度分別為：150bp、253bp、342bp。

2.陽性克隆質粒模板的制備

取毒液200μl，根據takara病毒dna/rna提取試劑盒的說明書提取。a型bpi3v和b型bpi3v陽性克隆質粒由寶生物工程（大連）有限公司合成。利用c型bpi3v的cdna、a型bpi3v和b型bpi3v陽性克隆質粒分別進行pcr反應，同時設定陰性對照（ddh2o）。反應采用25μl的體系包括：mix12.5μl、上下游引物各1.0μl、dna模板1.0μl、加ddh2o至25μl。循環參數為：95℃預變性5min；95℃20s，50℃～52℃30s，72℃40s，共35個循環，最后72℃延伸8min；目的片段長度分別為150bp、253bp、342bp，

c型bpi3v的cdna的pcr產物回收經試劑盒純化后連接入pmd19-t載體，轉化至dh5a大腸埃希菌，選取經雙酶切鑒定和通過序列測定分析驗證的c型陽性克隆質粒作為其標準陽性。

3.多重rt-pcr反應體系及參數：

50μl體系中加入高保真酶1μl，10×pcrbuffer5μl，dntp5μl、mgso42μl、（bpi3va、bpi3vb、bpi3vc的引物按4:4:1混合）上下游混合引物各1.5μl、dna模板3.0μl、ddh2o31μl。循環參數為：95℃預變性5min；95℃20s，51.5℃30s，72℃40s，共35個循環，最后72℃延伸8min；目的片段為150bp+253bp+342bp。

本發明中，參照基因庫中編號為jq063064、kj647284、hq530153的bpi3v的3種基因型分離株nm09、tvmdl15、sd0835的hn基因序列設計引物，其全基因序列長度分別為15474bp、15456bp、15474bp，本領域普通技術人員可以通過公眾的渠道獲知。

本發明中，以bpi3v的c基因型cdna為模板，用c型引物擴增出長度為342bp的片段，該片段克隆至pmd-19t載體，得到標準陽性模板。

本發明中，以bpi3v的a型和b型陽性克隆質粒基因為模板，用a型和b型引物引物擴增出長度為150bp和253bp的片段，確認合成標準陽性模板可用。

同時，本發明充分考慮到，當bpi3v的a型、b型和c型三模板同時擴增時，會競爭酶、引物，對擴增產生影響，對共擴增體系的反應條件和檢測低限進行了優化研究。三重rt-pcr體系則按照4:1:1的比例配制。反應參數為：95℃5min；95℃20s，51.5℃30s，72℃40s，共35個循環；最后72℃延伸8min。

進一步本發明對牛傳染性鼻氣管炎病毒檢測方法的特異性、靈敏性和可重復進行了確證。

用本發明提供的擴增體系分別擴增了牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛支原體、牛病毒性腹瀉病毒、小反芻獸疫的等核酸樣品，均未出現條帶，表明該方法具有較好的特異性。

選取pmd19-t-hna、pmd19-t-hnb、pmd19-t-hnc濃度分別為28ng/μl、30ng/μl、51ng/μl的混合陽性質粒依次進行10倍倍比稀釋，稀釋的9個梯度分別為模板進行擴增，結果可知混合引物對混合模板擴增的最低陽性質粒檢測分別為0.89×10⁴copies/μl、0.92×10⁴copies/μl、1.53×10⁴copies/μl，表明該方法具有良好的靈敏性。

分別以pmd19-t-hna、pmd19-t-hnb、pmd19-t-hnc、pmd19-t-hna+pmd19-t-hnb、pmd19-t-hnb+pmd19-t-hnc、pmd19-t-hna+pmd19-t-hnc、pmd19-t-hna+pmd19-t-hnb+pmd19-t-hnc為模板，進行每類模板3個重復的擴增，擴增條帶穩定，表明該方法具有良好的重復性。

通過實施本發明具體的發明內容，可以達到以下有益效果。

針對鑒定區分bpiv3的3種基因型的rt-pcr方法是首次被建立，通過此法可了解在家畜群里感染bpi3v的基因型等信息，以此進一步進行病毒分子流行病學的研究以及相應的疫苗研制。本方法檢測快速方便，傳統的病毒分離法的檢測時間至少要在7d以上，該發明檢測時間包括樣品前處理到獲得檢測結果在3h之內。檢測靈敏度高，該方法可檢測到1pg的重組質粒。特異性好，通過對牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛支原體、牛病毒性腹瀉病毒、小反芻獸疫等核酸樣品檢測，只有bpiv3陽性模板擴增出預期條帶。重復性好，通過分別對7種混合和單一模板進行三次重復性檢測，條帶均得到一致性結果。本方法可進行定性檢測快速分型，方法流程簡單，易于操作，可快速掌握，只要具備分子生物學基礎知識，無需特別訓練就能快速完成。用該發明方法對a型bpi3v病毒cdna、c型bpi3v病毒cdna及混合其cdna作為模板進行擴增來驗證本方法的準確性，同時臨床收集的33份鼻拭子和12份牛肺用該體系進行檢測，均得到預期結果。

本方法能同時鑒別檢測bpiv3的3個基因型，對相關病毒檢驗檢疫技術的研究有實際的借鑒意義。通過此法可了解在家畜群里bpi3v的基因型信息，同時對部分地區飼養的奶牛進行病毒分子流行病學的研究，以此了解疾病流行情況，為預防和控制牛副流感提供數據和技術支持。該方法能夠廣泛應用于出入境檢驗檢疫部門、畜牧獸醫部門和養殖單位，為疫病的有效防控具有重要意義。

附圖說明

圖1：病毒3種亞型單重pcr擴增結果：其中1為陰性對照，2、3、4為bpi3va、bpi3vb、bpi3vc的擴增片段（342bp、150bp、253bp），m為dl500marker。

圖2：病毒的3種亞型陽性克隆質粒多重pcr結果：其中1為陰性對照，2、3、4為bpi3va、bpi3vb、bpi3vc的擴增片段（150bp、253bp、342bp），5、6、7為bpi3va+bpi3vb、bpi3vb+bpi3vc、bpi3va+bpi3vc的擴增片段（150bp+253bp、253bp+342bp、150bp+342bp），8為bpi3va+bpi3vb+bpi3vc的擴增片段（150bp+253bp+342bp），m為dl500marker。

圖3：多重rt-pcr方法靈敏性試驗結果：其中1為陰性對照，2~10為pmd19-t-hna:0.89×10¹⁰copies/μl~0.89×10²copies/μl,pmd19-t-hnb:0.92×10¹⁰copies/μl~0.92×10²copies/μl,pmd19-t-hnc:1.53×10¹⁰copies/μl~1.53×10²copies/μl;m為dl500marker。

圖4：多重rt-pcr方法特異性試驗結果：其中1為陰性對照，2為陽性對照，3～9分別為牛傳染性鼻氣管炎病毒、山羊痘病毒、綿羊痘病毒、牛病毒性腹瀉病毒、羊口瘡病毒、小反芻獸疫病毒、牛支原體，m為dl500marker。

圖5：多重rt-pcr方法重復性試驗結果：其中1～3為bpi3va，4～6為bpi3vc，7～9為bpi3vb，10～12為bpi3va+bpi3vb，13～15為bpi3vb+bpi3vc，16～18為bpi3va+bpi3vc，19～21為bpi3va+bpi3vb+bpi3vc，22為陰性對照，m為dl500marker。

圖6：多重rt-pcr方法對病毒核酸的檢測結果：其中1為陰性對照，2為陽性對照，3為bpi3va+bpi3vc，4為bpi3vc；5為bpi3va，m為dl500marker。

具體實施方式

實施例一：牛副流感3型病毒3種基因型多重rt-pcr檢測方法引物和探針的設計與合成：

根據genbank上發表的牛副流感3型病毒a型分離株nm09、b型分離株tvmdl15、c型分離株sd0835各自的hn基因序列比較分析，使用oligo6.0軟件設計了特異性引物，引物交由寶生物工程(大連)有限公司合成，擴增長度分別為：150bp、253bp、342bp。本發明中的引物代號序列見表1，其中參照基因庫中編號為jq063064、kj647284、hq530153的bpi3v的3種基因型分離株nm09、tvmdl15、sd0835的hn基因序列設計引物，其全基因序列長度分別為15474bp、15456bp、15474bp，本領域普通技術人員可以通過公眾的渠道獲知。

表1多重rt-pcr擴增3種bpi3v基因型基因的引物序列.

實施例二：陽性克隆質粒模板的制備

取毒液200μl，根據takara病毒dna/rna提取試劑盒的說明書提取。a型bpi3v和b型bpi3v陽性克隆質粒由寶生物工程（大連）有限公司合成。利用c型bpi3v的cdna進行pcr反應，同時設定陰性對照（ddh2o）。反應采用25μl的體系包括：mix12.5μl、上下游引物各1.0μl、dna模板1.0μl、加ddh2o至25μl。循環參數為：95℃預變性5min；95℃20s，52℃30s，72℃40s，共35個循環，最后72℃延伸8min；目的片段長度為342bp。pcr產物回收經試劑盒純化后連接入pmd19-t載體，轉化至dh5a大腸埃希菌，選取經pcr擴增鑒定和通過序列測定分析驗證陽性克隆質粒作為其標準陽性模板。

1.重組質粒的pcr擴增鑒定：3基因型重組質粒分別取1μl為模板，加入premix12.5μl，上、下游引物(10pmol)各1μl，補水至25μl，進行pcr擴增，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果參見附圖1。

2.重組質粒的測序鑒定：將pcr擴增鑒定為陽性質粒的菌液過夜培養，送公司測序。瓊脂糖凝膠電泳可知，分別以bpi3v的a型、b型和c型重組質粒為模板進行單重pcr反應，擴增出大小相符的150bp、253bp和342bp的片段，測序鑒定均正確，經鑒定正確的重組質粒即為陽性模板。

實施例三：多重rt-pcr擴增體系的建立

采用單一模板和混合模板，其中混合模板的組分均為等濃度混合，同時設定陰性對照（ddh2o）。反應采用50μl的體系，包括：高保真酶1μl，10×pcrbuffer5μl，dntp5μl、mgso42μl、（bpi3va、bpi3vb、bpi3vc的引物按4:4:1混合）上下游混合引物各1.5μl、dna模板3.0μl、ddh2o31μl。反應條件為：95℃預變性5min；95℃20s，51.5℃30s，72℃40s，共35個循環，最后72℃延伸8min。結果表明，引物對各自模板具有較好的特異性，凝膠電泳結果參見附圖2。

實施例四：靈敏性試驗、特異性試驗和重復性試驗

選取pmd19-t-hna、pmd19-t-hnb、pmd19-t-hnc濃度分別為28ng/μl、30ng/μl、51ng/μl的混合陽性質粒依次進行10倍倍比稀釋，稀釋的9個梯度分別為模板進行擴增，取制備的標準陽性混合質粒作為陽性對照，同時設立陰性對照。2%瓊脂糖凝電泳檢測。反應結果由附圖3可知，混合引物對混合模板擴增的靈敏度較高，對pmd19-t-hna、pmd19-t-hnb、pmd19-t-hnc的最低陽性質粒檢測分別為0.89×10⁴copies/μl、0.92×10⁴copies/μl、1.53×10⁴copies/μl。特異性試驗用牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛支原體、牛病毒性腹瀉病毒、小反芻獸疫的等核酸樣品按優化后的反應體系和反應參數進行pcr反應。同時設立陰性對照和陽性對照，2%瓊脂糖凝電泳檢測。反應結果由附圖4可知除陽性對照出現3個目的條帶外，其余包括陰性對照均未出現條帶，表明本法特異性高。分別以pmd19-t-hna、pmd19-t-hnb、pmd19-t-hnc、pmd19-t-hna+pmd19-t-hnb、pmd19-t-hnb+pmd19-t-hnc、pmd19-t-hna+pmd19-t-hnc、pmd19-t-hna+pmd19-t-hnb+pmd19-t-hnc為模板，進行每類模板3個重復的擴增，同時設立陰性對照和陽性對照，2%瓊脂糖凝電泳檢測。反應結果由附圖5可知擴增條帶穩定，表明該方法具有良好的重復性。

實施例五：多重rt-pcr方法對病毒核酸及臨床樣品的檢測結果

采用所建多重rt-pcr方法，以a型bpi3v病毒cdna、c型bpi3v病毒cdna及混合其cdna作為模板分別擴增出150bp、342bp、150bp+342bp的目的片段，證實了本方法的準確性。結果參見附圖6。應用本法檢測的臨床33份鼻拭子樣品和11份牛肺樣品均為陰性。

以上實施例進一步說明了本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所做的修改或替換，均屬于本發明的范疇。