一種融合蛋白及光敏劑復合物及其制備方法和應用與流程

本發明屬于光動力治療技術領域，尤其涉及一種融合蛋白及光敏劑復合物及其制備方法和應用。

背景技術：

白血病干細胞是患者體內存在的一種比例極少的腫瘤細胞，是白血病發生、發展和耐藥的根源。人il-3受體是由α和β亞基組成的異源二聚體，il-3受體α亞基(il-3rα、cd123)具有在急性髓性白血病(aml)干細胞中較高的表達量，而在正常造血干細胞表面不表達的特點，使其成為aml靶向治療的重要靶點。

已有研究利用il-3在正常造血干細胞上不表達，而在aml干細胞中高表達的特點，設計以il-3為靶頭的偶聯藥物，并在體內外體現出有很好的靶向性和治療效果。有研究已經報道il-3和化療藥物達托霉素偶聯形成的融合蛋白有更好的靶向性殺傷作用，明顯降低了達托霉素單獨使用時的毒副作用。但該融合蛋白基于化療藥物，系統毒性大。目前并沒有一種毒性更小的il-3偶聯藥物。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種融合蛋白及光敏劑復合物及其制備方法和應用，為了提供一種水溶性好、粒徑均一性好，且對il-3rα腫瘤細胞的主動靶向性高的光敏劑復合物，在體內外都顯示出增強的腫瘤細胞殺傷能力，以及良好的生物相容性和安全性。

本發明提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括il-3和hsa，所述il-3和hsa通過五肽進行偶聯。

優選的是，所述融合蛋白的序列如seqidno:11所示。

本發明還提供了編碼上述技術方案所述融合蛋白的基因，所述基因序列如seqidno:4所示。

本發明還提供了上述技術方案所述融合蛋白的表達載體，所述表達載體為融合有上述技術方案所述基因的pcdna3.0載體。

本發明還提供了上述技術方案所述融合蛋白的表達系統，為哺乳動物真核表達系統。

優選的是，所述哺乳動物真核表達系統的宿主細胞為hek293細胞。

本發明還提供了一種光敏劑復合物，所述光敏劑復合物為ce6以非共價鍵結合到上述技術方案所述融合蛋白的hsa部分得到。

優選的是，所述光敏劑復合物的平均水化粒徑為8.5nm。

本發明還提供了上述技術方案所述光敏復合物的制備方法，包括以下步驟：

在避光條件下，將上述技術方案所述融合蛋白與ce6溶液按照融合蛋白與ce6摩爾比為1：5混合，在旋轉條件下反應14h，得到光敏復合物。

本發明還提供了上述技術方案所述光敏劑復合物或上述技術方案所述制備方法得到的光敏劑復合物在制備靶向治療急性髓性白血病藥物中的應用。

本發明提供了一種融合蛋白、光敏劑復合物及所述光敏劑復合物的制備方法和應用。本發明提供的光敏劑復合物包括由il-3的c端和hsa的n端通過五肽連接而成的融合蛋白和以非共價鍵形式連接在所述融合蛋白的hsa部分的ce6。本發明的光敏劑復合物水溶性好、粒徑均一性好，對il-3rα腫瘤細胞的主動靶向性更高，在體內外都顯示出增強的腫瘤細胞殺傷能力，以及良好的生物安全性，所述光敏劑復合物在制備治療急性髓性白血病藥物中顯示出很好的應用前景。

附圖說明

圖1為本發明實施例1提供的核酸電泳圖：a：以人pbmc提取的mrna為模版，得到的pcr產物，m：marker，lane1：il-3，lane2：hsa；lane3：his-il-3-pa；b：重組載體pcdna3.0-his-il-3-pa的構建，m：marker，lane1：pmd-18t-his-il-3-pa的hindiii和bamhi雙酶切，lane2：pcdna3.0的hindiii和bamhi雙酶切；lane3：his-il-3-pa和pcdna3.0的酶連產物；c：重組載體pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa的構建，m：marker，lane1：pmd-18t-hsa的bamhi和noti雙酶切，lane2：pcdna3.0-his-il-3-pa的bamhi和noti雙酶切；lane3：hsa和pcdna3.0-his-il-3-pa的酶連產物；

圖2為本發明實施例1提供的表達載體pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa的構建流程圖；

圖3為本發明實施例2提供的wb驗證融合蛋白的正確表達：

a、b、c分別是用抗his、抗人il-3、抗hsa抗體檢測，其中lane1為轉染空載體pcdna3.0的hek293上清；lane2為轉染表達載體pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa的hek293上清；

圖4為本發明實施例3提供的sds-page檢測融合蛋白的表達：

m為marker，lane1為酶切前的ni柱純化產物；lane2為酶切后的ni柱純化產物；

圖5為本發明實施例3提供的wb驗證融合蛋白的純化；

a、b、c分別是用抗his、抗人il-3、抗hsa抗體檢測，其中，lane1為酶切前的ni柱純化產物；

lane2酶切后的ni柱純化產物；

圖6為本發明實施例5提供的il-3-hsa-ce6、hsa、ce6的熒光激發發射光譜測定；

圖7為本發明實施例6提供的dls法檢測il-3-hsa-ce6、ce6的水化粒徑；

圖8為本發明實施例7提供的il-3-hsa-ce6和ce6的單線態氧產量測定；

圖9為本發明實施例8提供的流式檢測各細胞表面的il-3rα的表達量；

圖10為本發明實施例9提供的il-3-hsa-ce6和ce6的細胞攝取量測定；

圖11為本發明實施例10提供的mtt檢測il-3-hsa-ce6和ce6對各個細胞的pdt毒性；

圖12為本發明實施例11提供的il-3-hsa-ce6和ce6對aml模型鼠體內pdt療效檢測。

具體實施方式

本發明提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括il-3和hsa，所述il-3的c端和hsa的n端通過五肽連接。在本發明中，所述五肽的氨基酸序列為papap。

具體的，所述融合蛋白的序列如seqidno:11所示，具體序列如下：kapmtqttplktswvncsnmideiithlkqpplplldfnnlngedqdilmennlrrpnleafnravkslqnasaiesilknllpclplataaptrhpihikdgdwnefrrkltfylktlenaqaqqttlslaifpapapgskwvtfisllflfssaysrgvfrrdahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktykttlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasraalgl。

本發明對所述il-3和hsa基因的獲得方式沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的il-3和hsa基因的常規獲得方法即可，如從人外周血單核細胞(peripheralbloodmononuclearcell，pbmc)中提取的mrna為模板，設計特異性引物，獲得人il-3和hsa的cdna序列。在本發明中，所述融合蛋白il-3-hsa優選通過重疊pcr反應獲得。本發明對所述提取的方法沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的從mrna中擴增基因片斷的常規方法即可。本發明對所述特異性引物的獲得方法沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的引物合成公司進行引物的合成即可。本發明對所述重疊pcr反應的條件沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的用于基因連接的重疊pcr反應條件即可。

本發明還提供了編碼上述技術方案所述融合蛋白的基因，所述基因序列如seqidno:4所示，具體序列如下：

aagcttatgcaccaccaccatcatcatgacgatgacgataaggctcccatgacccagacaacgcccttgaagacaagctgggttaactgctctaacatgatcgatgaaattataacacacttaaagcagccacctttgcctttgctggacttcaacaacctcaatggggaagaccaagacattctgatggaaaataaccttcgaaggccaaacctggaggcattcaacagggctgtcaagagtttacagaacgcatcagcaattgagagcattcttaaaaatctcctgccatgtctgcccctggccacggccgcacccacgcgacatccaatccatatcaaggacggtgactggaatgaattccggaggaaactgacgttctatctgaaaacccttgagaatgcgcaggctcaacagacgactttgagcctcgcgatctttcctgctccagctccaggatccaagtgggtaacctttatttcccttctttttctctttagctcggcttattccaggggtgtgtttcgtcgagatgcacacaagagtgaggttgctcatcggtttaaagatttgggagaagaaaatttcaaagccttagtgttgattgcctttgctcagtatcttcagcagtgtccatttgaagatcatgtaaaattagtgaatgaagtaactgaatttgcaaaaacatgtgttgctgatgagtcagctgaaaattgtgacaaatcacttcataccctttttggagacaaattatgcacagttgcaactcttcgtgaaacctatggtgaaatggctgactgctgtgcaaaacaagaacctgagagaaatgaatgcttcttgcaacacaaagatgacaacccaaacctcccccgattggtgagaccagaggttgatgtgatgtgcactgcttttcatgacaatgaagagacatttttgaaaaaatacttatatgaaattgccagaagacatccttacttctatgccccggaactccttttctttgctaaaaggtataaagctgcttttacagaatgttgccaagctgctgataaggctgcctgcctgttgccaaagctcgatgaacttcgggatgaagggaaggcttcgtctgccaaacagaggctcaagtgtgccagtctccaaaaatttggagaaagagctttcaaagcatgggcagtagctcgcctgagccagagatttcccaaagctgagtttgcagaagtttccaagttagtgacagatcttaccaaagtccacacggaatgctgccatggagatctgcttgaatgtgctgatgacagggcggaccttgccaagtatatctgtgaaaatcaagattcgatctccagtaaactgaaggaatgctgtgaaaaacctctgttggaaaaatcccactgcattgccgaagtggaaaatgatgagatgcctgctgacttgccttcattagctgctgattttgttgaaagtaaggatgtttgcaaaaactatgctgaggcaaaggatgtcttcctgggcatgtttttgtatgaatatgcaagaaggcatcctgattactctgtcgtgctgctgctgagacttgccaagacatataaaaccactctagagaagtgctgtgccgctgcagatcctcatgaatgctatgccaaagtgttcgatgaatttaaacctcttgtggaagagcctcagaatttaatcaaacaaaattgtgagctttttgagcagcttggagagtacaaattccagaatgcgctattagttcgttacaccaagaaagtaccccaagtgtcaactccaactcttgtagaggtctcaagaaacctaggaaaagtgggcagcaaatgttgtaaacatcctgaagcaaaaagaatgccctgtgcagaagactatctatccgtggtcctgaaccagttatgtgtgttgcatgagaaaacgccagtaagtgacagagtcaccaaatgctgcacagaatccttggtgaacaggcgaccatgcttttcagctctggaagtcgatgaaacatacgttcccaaagagtttaatgctgaaacattcaccttccatgcagatatatgcacactttctgagaaggagagacaaatcaagaaacaaactgcacttgttgagcttgtgaaacacaagcccaaggcaacaaaagagcaactgaaagctgttatggatgatttcgcagcttttgtagagaagtgctgcaaggctgacgataaggagacctgctttgccgaggagggtaaaaaacttgttgctgcaagtcgagctgccttaggcttataagcggccgc。

本發明還提供了上述技術方案所述融合蛋白的表達載體，所述表達載體為融合有上述技術方案所述基因的pcdna3.0載體。在本發明中，所述表達載體構建過程中，優選在il-3-hsa序列的5’端添加his標簽和酶切位點。在本發明中，所述酶切位點優選為腸激酶酶切位點，相應的酶為腸激酶。

本發明還提供了上述技術方案所述融合蛋白的表達系統，為哺乳動物真核表達系統。在本發明中，所述表達系統用表達宿主細胞優選為hek293細胞。本發明對所述hek293細胞的來源沒有特殊的限制，采用本領域技術人員熟知的hek293細胞常規市售產品即可。

本發明在所述表達系統表達得到蛋白后，優選對所述蛋白進行純化，得到上述技術方案所述融合蛋白；本發明對所述融合蛋白的純化方法沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的鎳柱純化方法即可。為了去除hek293細胞表達的融合蛋白的his標簽，所述純化過程優選依次包括：鎳柱吸附，酶切，鎳柱再吸附，得到蛋白序列如seqidno:11所示的融合蛋白。在本發明中，所述融合蛋白以單體形式存在，不會發生聚集或形成膠體。

本發明還提供了一種光敏劑復合物，所述光敏劑復合物為ce6以非共價鍵結合到上述技術方案所述融合蛋白的hsa部分得到。本發明的光敏劑復合物溶解度高，減少了光敏劑復合物在水或生理溶液中發生聚集產生沉淀和光漂白的幾率。在本發明中，所述光敏劑復合物(il-3-hsa-ce6)和游離的光敏劑ce6在特定激發波長下有相似的ros產量。在本發明中，所述光敏劑復合物保留了ce6對腫瘤細胞的被動靶向性，同時，對表面表達il-3rα分子的aml細胞還具有主動靶向性，具體表現為，在表達il-3rα的aml細胞中，il-3-hsa-ce6復合物有更高的細胞攝取量；在表達il-3rα的aml細胞中，il-3-hsa-ce6復合物有更強的細胞毒性。

等摩爾量的il-3-hsa-ce6和ce6具有相同的單線態氧產量，光敏劑復合物il-3-hsa-ce6保留了ce6的光動力學性質。本發明的光敏劑復合物在等摩爾量的情況下能更多的聚集在表面表達il-3rα的細胞內，具有更好的靶向性。在本發明中，所述光敏劑復合物對表達il-3rα的細胞系和來自aml患者的pbmc都有更強度細胞毒性，對于不表達il-3rα的細胞也有相似的細胞毒性；對于正常人pbmc幾乎沒有細胞毒性。相比于ce6，相同劑量(質量濃度)的光敏劑復合物有更強的pdt治療效果。

在本發明中，所述光敏劑復合物的平均水化粒徑為8.5nm。

本發明還提供了上述技術方案所述光敏復合物的制備方法，包括以下步驟：

在避光條件下，將上述技術方案所述融合蛋白與ce6溶液按照融合蛋白與ce6摩爾比為1：5混合，在旋轉條件下反應14h，得到光敏復合物。

在本發明中，所述光敏劑復合物的制備在避光條件下進行，本發明配制的ce6溶液時，優選將ce6溶解于雙蒸水中，滴加naoh使ce6完全溶解，加hcl將ph調節為7.5～8。本發明對所述氫氧化鈉和hcl的濃度沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的ph值調節用氫氧化鈉和hcl的常規濃度即可。在本發明中，所述ce6溶液的濃度優選為1～7mg/ml，優選的為4mg/ml。

得到ce6溶液后，本發明優選將il-3-hsa和ce6溶液按照il-3-hsa和ce6的摩爾比為1：5溶于pbs溶液中，室溫旋轉反應14h。本發明對所述pbs溶液沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的pbs溶液即可。在本發明中，所述旋轉的轉速優選為50～160rpm，更優選為80rpm。在本發明中，每0.1～0.2g融合蛋白優選溶于80～100ml的pbs，更優選溶于95mlpbs。

本發明旋轉反應14h后，優選將得到的產物進行超濾，除去游離的ce6，所述超濾膜的截留分子量優選為50kda。

本發明還提供了上述技術方案所述光敏劑復合物或上述技術方案所述制備方法得到的光敏劑復合物在制備靶向治療急性髓性白血病藥物中的應用。

本發明對所述藥物的劑型沒有特殊的限定，采用本領域技術人員熟知的常規藥物劑型即可。在本發明中，所述藥物的劑型優選為凍干粉末，優選采用生理鹽水在避光條件下溶解，所述藥物的濃度優選為5～10mg/ml。

下面結合具體實施例對本發明提供的一種抗cd33單鏈抗體及光敏劑復合物及其制備方法做進一步詳細的介紹，本發明的技術方案包括但不限于以下實施例。

實施例1

重組表達載體的構建

1)通過提取人外周血，分離其中的pbmc，利用逆轉錄試劑盒提取其中的mrna，設計引物：

2)il-3s、il-3a作為上下游引物，得到表達il-3的cdna(如seqidno:1所示)；hsas、hsaa作為上下游引物，得到表達hsa的cdna(如seqidno:2所示)；以he、te作為上下游引物，以得到的il-3的cdna為模版，在其基礎上，于5端添加6×his標簽和腸激酶酶切位點，于3端添加由5個氨基酸組成的剛性肽(papap)(如seqidno:3所示)，記為his-il-3-pa(如seqidno:4所示)，結果如圖1a所示。

各引物對應的序列編號如表1所示：

表1引物序列表

3)將pcr得到的序列：hsa和his-il-3-pa，分別連接入pmd-18t載體，進行t-a克隆，依次得到相應的重組克隆載體：/pmd-18t-hsa；pmd-18t-his-il-3-pa。分別將這2個載體轉化入dh5α，經菌落pcr驗證，篩選陽性克隆并進行dna測序，分別得到序列正確的菌株：dh5α/pmd-18t-hsa；dh5α/pmd-18t-his-il-3-pa。

4)將質粒pmd-18t-his-il-3-pa和pcdna3.0用hindiii和bamhi雙酶切，隨后酶連，得到重組表達載體：pcdna3.0-his-il-3-pa，結果如圖1b所示。

5)將質粒pmd-18t-hsa和重組表達載體pcdna3.0-his-il-3-pa用bamhi和noti雙酶切，隨后酶連，得到最終的重組表達載體：pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa，結果如圖1c所示。

以上構建流程見圖2。

實施例2

瞬時轉染驗證融合蛋白的表達

將重組表達載體pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa通過pei法轉染入hek293中進行瞬時表達，

轉染48h后，取上清分別用抗his、hsa、il-3的抗體進行wb驗證，證明目的蛋白能以分泌的形式正確表達，結果如圖3所示。

實施例3

融合蛋白的純化

1)將對數期的hek293細胞消化，然后按10⁶個細胞/皿，鋪20個皿。

2)于37℃，5％co2的條件下培養72h，將重組表達載體pcdna3.0-his-il-3-pa-hsa利用pei法瞬時轉染。

3)收集轉染后72h的表達上清，3000rpm，5min離心，將上清過0.22um濾膜后，通過ni柱純化，純化步驟如下：

①平衡：用10倍體積的平衡緩沖液平衡ni柱，流速：1ml/min。

②上樣：將細胞培養上清進行ni柱上樣，流速：0.5ml/min。

③洗滌：用至少10倍體積的平衡緩沖液洗滌ni柱至基線，流速：1ml/min。

④洗脫：依次用咪唑濃度為10mm、20mm、50mm、100mm、200mm、500mm的洗脫緩沖液進行梯度洗脫，每個濃度洗脫15倍體積。

4)洗脫產物經sds-page驗證，確定含有目的蛋白的洗脫組分。將含有目的蛋白的組分合并，置于透析袋中，用1lpbs透析3次，每次12h。

5)由于得到的產物中其5端的his標簽后面含有一個腸激酶酶切位點，可以用重組腸激酶切除his標簽。

6)得到的透析液中按100iu/ml加入含his標簽的重組腸激酶，于37℃反應16h。

7)反應產物再次經ni柱吸附，收集流出液，去除含his標簽的重組腸激酶和切除下來的his標簽，流出液利用超濾管(wmco：50kda)，超濾3次得到濃縮液，得到濃縮的產物經sds-page和wb驗證，結果如圖4和圖5所示。得到的最終il-3-hsa融合蛋白序列如seqidno:11所示。

實施例4

ce6裝載反應

1)配制ce6溶液母液(1mg/ml)：稱取35mgce6溶解于7mlddh2o中，滴加1m的naoh溶液全部溶解ce6，加入hcl調節ph至7.5-8，再用ddh2o定容至35ml，制備過程全程避光，配制完后溶液避光保存。

2)在避光條件下，稱取0.174g融合蛋白il-3-hsa溶于94ml的pbs中，然后加入6mlce6溶液母液，(il-3-hsa和ce6的摩爾比為1：5)，并在室溫條件下，旋轉反應14h。

3)采用超濾法，將上述反應產物于超濾管(wmco：50kda)中，超濾3次，去除游離的ce6，得到復合物il-3-hsa-ce6。

實施例5

熒光激發發射光譜測定

由于ce6的最大激發波長和最大發射波長分別為671nm和715nm，hsa的最大激發波長和最大發射波長分別為280nm和443nm。同等濃度(10μm)的il-3-hsa-ce6、hsa、ce6在280nm波長的激發下，檢測發射光譜，

結果如圖6所示：可以看出，ce6和hsa分別在715nm和443nm處出現特征單發射峰，而復合物il-3-hsa-ce6在在715nm和443nm兩處出現雙發射峰。說明復合物il-3-hsa-ce6是由il-3-hsa和ce6兩部分組成的。

實施例6

dls法檢測粒徑

將合成的溶解于pbs，得到濃度為1mg/ml的溶液。應用動態光散射儀(dls)，測得化合物平均水化粒徑。

結果如圖7顯示，il-3-hsa融合蛋白的水化粒徑平均值為7.5nm，而il-3-hsa-ce6復合物的水化粒徑平均值為8.5nm，并且該復合物的水化粒徑均一性好，在水中有很好的分散度，沒有出現任何膠狀物或沉淀物。說明，由于裝載了ce6后，復合物的構象改變，粒徑變大。而這種裝載只是在單個il-3-hsa分子水平上的，不會發生沉淀，或相互聚集產生膠體。

實施例7

單線態氧釋放實驗

利用rno脫色反應檢測單線態氧的釋放量，具體步驟如下。

1)將rno溶于重水(d2o)，配成終濃度為250μm的溶液a。

2)將組氨酸溶于重水(d2o)，配成終濃度為0.03m的溶液b。

3)將溶液a和溶液b按體積比1：3混合，得到溶液c。

4)6.67μm游離的ce6溶解在700μl含有1％dmso的重水中，隨后加入400μl溶液c，將混合溶液置于石英皿中，立刻檢測440nm處的發光強度，記為初始發光強度。

5)用波長為671nm、強度為6j/cm²的光源照射上述石英皿中的溶液30min。并且在此期間，每隔2min檢測440nm的發光強度。每個時間點的單線態氧產量的比例為：(初始發光強度-該時間點的發光強度)/初始發光強度×100％。

6)以時間為橫坐標，以該時間點的單線態氧產量比例為縱坐標，得到單線態氧產量曲線。

7)用同樣的方法檢測等摩爾il-3-hsa-ce6在各個時間點的單線態氧產量。

結果如圖8所示，可以看出，il-3-hsa-ce6和游離的ce6在671nm的激發下，都能逐步產生單線態氧，且產量基本一致，都隨時間的延長而增加，說明il-3-hsa-ce6復合物沒有影響其中ce6的產生單線態氧的能力。

實施例8

檢測各細胞表面il-3rα表達量

利用流式方法，取10⁵個對數生長期的細胞，離心，細胞沉淀重懸于500μl帶有pe熒光標簽的鼠抗人il-3rα抗體中，另用500μl帶有pe熒光標簽的同型抗體作對照，檢測kg-1a、tf-1、k562細胞表面的il-3rα表達量。

取2名急性髓性白血病(aml)患者和1名健康者的血液100ml，ficoll淋巴細胞分離液分離其中的pbmc，采用相同的方法檢測其中il-3r的表達量。

流式結果見如圖9，結果顯示，il-3rα在kg-1a細胞中的表達量最高，幾乎為100％，其次為tf-1細胞，表達量約為75％，k562細胞表面幾乎不表達。aml患者1和患者2中分別有70％的il-3rα表達量，而il-3rα在正常人血pbmc中沒有表達。

實施例9

細胞攝取量測試

1)收集pbs洗滌后的5×10⁷個對數生長期的tf-1細胞，3000rpm離心5min，得到細胞沉淀，加入1ml細胞裂解液(0.1mnaoh,1％sds)，得到細胞裂解產物。

2)將10μl不同劑量的il-3-hsa-ce6，加入100μl上述細胞裂解產物中，依次得到il-3-hsa-ce6終濃度為0.1μm、1μml、5μm、10μm、20μm的裂解液混合物。

3)于671nm的激發波長下，檢測715nm處相應濃度的吸光度數值，得到吸光值與il-3-hsa-ce6濃度的關系。

4)采用同樣的方法，得到ce6的吸光值與濃度的關系。

5)將處于對數生長期的tf-1細胞鋪于6孔板的6個孔中，1×10⁶細胞/孔。

6)24h后，更換新鮮培養基，加入用pbs稀釋的光敏劑il-3-hsa-ce6和ce6至終濃度為1μm，再孵育0h、1h、2h、4h、8h、16h。

7)到取樣時間點時，將對應孔中的細胞懸液移至一干凈ep管，3000rpm離心5min，得到細胞沉淀，經pbs洗滌2次后，加入100ul細胞裂解液(0.1mnaoh,1％sds)，獲得均勻的細胞裂解產物，

8)細胞裂解產物于671nm的激發波長下，檢測715nm發射波長處的吸光度數值，再根據前面得到的吸光值與濃度的關系，轉換為光敏劑復合物il-3-hsa-ce6或光敏劑ce6的含量。

9)將k562細胞、人新鮮pbmc細胞也按上述方法進行細胞攝取量的測試。

10)以孵育的時間為橫坐標，以相應的il-3-hsa-ce6或ce6的含量為縱坐標，得到上述3個細胞的細胞攝取量曲線。

結果見圖10，在il-3rα表達的tf-1細胞中，il-3-hsa-ce6的細胞攝取量顯著高于ce6，且呈很好的時間依賴性，而單純的ce6在4h的細胞攝取量即達到飽和，不再變化。

在il-3不表達的k562細胞中，il-3-hsa-ce6的細胞攝取量略高于ce6，時間依賴性不明顯。

在人新鮮pbmc細胞中，il-3-hsa-ce6和ce6的細胞攝取量都很低，沒有時間依賴性。

實施例10

mtt檢測細胞毒性

1)將處于對數生長期的kg-1a細胞、tf-1細胞、k562細胞、2名急性髓性白血病患者的pbmc和1名健康者的pbmc重懸于1640+10％fbs培養基，鋪96孔板，1×10⁴細胞/孔。

2)培養24h后，換成無血清的1640培養基，每個細胞分為3組，每組3復孔，分別加入pbs、ce6(終濃度為5ug/ml)、il-3-hsa-ce6(等摩爾量的ce6，終濃度為150ug/ml)。

3)于培養箱中避光溫育1h后，換成新鮮的1640+10％fbs培養基，100μl/孔，進行671nm波長光照射，光照時間為10min，光照能量為9j/cm²。此后，再于培養箱中避光培養24h。

4)每孔加入11μlmtt溶液(5mg/ml)，孵育4h，3000rpm離心5min，棄上清，每孔加入dmso200μl溶解甲臜，于酶標儀570nm處檢測吸光度。細胞抑制率(％)＝1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值×100％。

結果如圖11所示，

相比于游離的光敏劑ce6，光敏劑復合物il-3-hsa-ce6對表面il-3rα有一定表達量的腫瘤細胞(kg-1a、tf-1)有更強的殺傷能力；同時，對于表面不表達il-3rα的腫瘤細胞(k562)也有相同的殺傷效果。

對于2例不同程度il-3rα表達的aml患者的pbmc，光敏劑復合物il-3-hsa-ce6也顯示出比游離的ce6更好的殺傷效果。

對于正常人pbmc，游離的ce6有很輕微的細胞毒性，而光敏劑復合物il-3-hsa-ce6幾乎沒有顯示出細胞毒性。

實施例11

體內實驗評價pdt效果：

1)將kg-1a細胞，經尾靜脈植入9只scid鼠(雌性，4周齡)體內，每只鼠植入7×10⁷個細胞，進行aml造模。一周后，將鼠分為3組，3只/組。通過尾靜脈分別注射ce6(2.5mg/kg)、il-3-hsa-ce6復合物(2.5mg/kg)，以及等體積的pbs，避光培養1天。

2)1天后，在暗室中進行pdt治療，采用埋針法：將鼠尾固定于37℃的恒溫版上，采用浸潤肝素溶液(250mg/ml)的g24留置針(直徑0.75mm)穿刺入小鼠尾靜脈中，

3)隨后將碘酒消毒的光導纖維(直徑0.5mm)伸進留置針內，光導纖維的另一端連接血液內照射ne-he激光治療儀，發光功率：9j/cm²。

4)每隔一小時，重新將g24留置針和配套的光導纖維沿尾靜脈的近心端方向換一個部位穿刺，一共進行3h的激光照射治療，期間，使鼠尾保持靜止固定狀態。

5)將以上小鼠處死后，解剖剝離出雙側股骨，將股骨減斷后，抽取其中的骨髓，利用ficoll淋巴細胞分離液，分離得到其中的骨髓細胞。

6)利用帶pe標簽的鼠抗人il-3rα的抗體，流式檢測其中各組骨髓中表達il-3rα的細胞比例，計算平均值。

結果如圖12所示，由于植入的kg-1a細胞表面高豐度表達人il-3rα蛋白，而scid鼠本身細胞表面沒有il-3rα分子，因而骨髓中il-3rα的細胞所占比例反應了治療效果。

可以看出，pbs組中，表達il-3rα細胞所占比例最高，約為55％，而在ce6治療組中，這個比例下降為20％左右，在il-3-hsa-ce6治療組中，比例更低，為10％左右。因此，相比于單純的ce6，il-3-hsa-ce6復合物在體內能更有效地清除aml細胞。

以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。

sequencelisting

<110>李斯文

<120>一種融合蛋白及光敏劑復合物及其制備方法和應用

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