一種植物干旱誘導型人工合成啟動子SP2及應用的制作方法

本發明屬于基因工程領域，具體涉及一種植物干旱誘導型啟動子sp2及其在轉基因植物中的應用。

技術背景

啟動子通過與一種或多種轉錄因子結合而調控基因的表達。每個啟動子都有其特定的序列結構和結合位點，啟動子的主要結構包括核心啟動子序列和上游啟動子元件，可以指導附近dna區段的轉錄。啟動子在基因轉錄的起始和調節中發揮非常重要的作用，在基因工程中是重要的組成構件。近年來，隨著合成生物學的發展，人工合成功能元件在代謝工程領域顯示出巨大應用潛力。細胞的代謝通量主要受到轉錄水平的調控，而啟動子是轉錄水平的重要調控元件，因此，啟動子被列為合成生物學的重要功能元件之一。

順勢作用元件是核心啟動子上游的一段序列，通過與轉錄因子結合調節基因轉錄起始頻率和轉錄效率。啟動子末端和近端的順式調節序列的排列和組合，與特定的反式作用因子結合時，可以調節相鄰的編碼蛋白質基因的表達。核心啟動子不僅是基礎轉錄的關鍵因素，對于調節轉錄和組織特異性也特別重要。通過設計核心啟動子序列上游的順式作用元件來調節啟動子的活性，可以驅動目的基因按照所需要的特性表達，比如能夠在特定的位點和時間調節基因表達的水平。植物中通過組合某些順式作用元件并連接一個核心啟動子構建誘導型啟動子，能夠使報告基因在受到信號刺激時直接表達。

干旱、鹽堿、低溫等逆境脅迫嚴重影響作物的生長和產量。通過脅迫誘導型啟動子驅動轉錄因子，進而激活多個逆境誘導基因的表達，是提高作物抗逆性的一個有效手段。然而，目前分離和鑒定的天然啟動子的活性都受到一定限制，比如低表達活性和低特異性等。因此，開發和應用高活性的人工合成啟動子，實現對基因的精細調控，具有重要的科學和現實意義。本專利公開了一種人工設計合成的植物逆境誘導型啟動子，該啟動子對干旱脅迫極為敏感，也可以受鹽、鹽堿、aba以及低溫脅迫誘導而驅動報告基因gus表達。

技術實現要素：

本發明的目的是為了實現對基因的精細調控，而提供一種植物干旱誘導型啟動子sp2。

一種植物誘導型啟動子sp2，它的核苷酸序列如seqidno.1所示。

一種植物表達載體，它是在植物表達載體中插入了如seqidno.1所示的核苷酸序列；

所述的植物表達載體為pbi121。

含有seqidno.1的互補及反向序列。

一種大豆誘導啟動子sp2在以干旱或鹽堿為選擇壓力的選擇標記方面的應用。

一種大豆誘導啟動子sp2在培育抗干旱或耐鹽堿轉基因植物的應用；

所述的的植物為單子葉植物或雙子葉植物。

本發明提供了一種大豆誘導啟動子sp2，屬于人工合成啟動子構建，它是以g-box、abre、abf、sorlip1、cca1、e2f為基本順式元件，每個元件串聯重復4次，兩元件中間以7-9個堿基的隨機序列間隔，將以上設計片段再與35s核心啟動子corecamv35s連接構建而成，命名為，簡稱為sp2。該啟動子是下述核苷酸序列之一：1）序列表中seqidno.1的dna序列；2）與序列表中seqidno.1限定的dna序列具有90%以上同源性且具有啟動基因轉錄功能的核苷酸序列。在轉基因煙草中鑒定sp2啟動子驅動報告基因gus的表達情況表明，sp2啟動子可以受干旱、鹽、鹽堿、aba以及低溫脅迫所誘導，對干旱脅迫極為敏感。本發明人工設計構建了一種植物干旱誘導型啟動子sp2，可直接應用于農作物轉基因抗逆育種。

附圖說明：

圖1為sp2與gus融合表達載體圖；

圖2為轉sp2基因煙草在不同脅迫條件下gus蛋白的染色情況；

圖3為轉sp2基因煙草在不同脅迫條件下gus蛋白的活性。

具體實施方式：

實施例1.植物逆境誘導型啟動子sp2的設計

通過將大豆逆境轉錄組測序數據與genbank中已有大豆逆境表達譜數據相結合，篩選出受干旱調控的目的基因63個，然后將它們列表進行cluster模塊分類。獲得4個cluster后，利用motif鑒定軟件分別對每個cluster進行motif的鑒定，最終獲得46個與逆境調控相關的啟動子共有表達元件。選擇其中的g-box、abre、abf、sorlip1、cca1、e2f為基本順式元件，每個元件串聯重復4次，兩元件中間以7-9個堿基的隨機序列間隔，將以上設計片段再與35s核心啟動子corecamv35s連接構建而成syntheticpromoter2，簡稱為sp2，其核苷酸序列為seqidno.1序列。

實施例2.啟動子sp2表達載體的構建

通過人工合成方法將sp2（seqidno.1）序列合成到載體puc57上，并在序列兩端添加酶切位點bamhl和hindiii。將puc57-sp2載體和pbi121質粒，分別用bamhl和hindiii進行雙酶切，分別回收酶切產物后，經連接、轉化、鑒定，獲得表達載體pbi121-sp2（如圖1）。將載體pbi121-sp2轉化至農桿菌eha105中，用于浸染煙草。

實施例3.轉sp2基因煙草的獲得

按照葉盤轉化法（horschetal.1988）進行。農桿菌菌液用滅菌水稀釋至106-107cells/ml（一般稀釋30倍左右）。取無菌煙草葉片，去掉主脈將葉片切成四方形狀，然后將其浸入到稀釋后的菌液中，侵染8-10分鐘。

1)共培養

取出葉片外植體后在滅菌濾紙上吸干菌液，將其葉表面向下倒置于ms培養基的表面，24°c-25°c暗培養2天。

2)選擇培養

將共培養葉片轉移到選擇分化培養基（含250mg/l頭孢；100mg/l卡那霉素）上，28°c，每日光照16小時，15-20天換一次培養基。

3)生根培養

當分化的抗性芽長到1cm左右，切下（最好不帶任何愈傷組織）轉移到生根培養基上，28°c，每日光照16小時。

4)土壤培養

當根長出約1-3cm長，且密度較大時，去除封口膜，室溫環境中進行煉苗2-3天，取出植株徹底洗凈培養基，同時注意盡量減少根的損傷，移入溫室土壤中培養。前2-3天需要遮陰培養。

5)煙草的繁種

將轉基因煙草播種與人工氣候室中，繁種至t2代后，收取種子用于gus染色分析。

實施例4gus組織化學染色

將轉sp2基因煙草種植于ms固體培養基中，待長至4片葉時將小苗移至液體培養基中，生長2天后進行鹽、鹽堿、干旱、低溫及aba處理，干旱處理1天，其他處理均處理6小時。將處理好的煙草幼苗置于固定液（1%甲醛，50mm磷酸鈉緩沖液ph7.0，0.05%tritonx-100）中，室溫靜置固定45-60min；然后用50mm，ph7.0的磷酸鈉緩沖液漂洗2-3次，每次10-15min；加入x-gluc染色液浸沒材料，蓋上管蓋，37℃避光保溫過夜。棄去染色液，50mm，ph7.0磷酸鈉緩沖液漂洗沖洗后，加入25%、50%、75%、90%、100%的梯度濃度乙醇分別浸泡1h進行脫色，體視顯微鏡下觀察并拍照記錄gus的表達情況。結果顯示（如圖sp2啟動子驅動的gus基因在鹽、鹽堿、干旱、aba以及低溫等處理下均有表達，其中干旱脅迫下gus染色較深，而未經處理的轉基因煙草中gus沒有表達，并且gus基因在煙草的各組織中均有表達。這些結果說明sp2啟動子為誘導型啟動子，可以受鹽、鹽堿、干旱、低溫以及aba處理所誘導，并且受干旱脅迫誘導顯著，適合作為利用植物基因工程手段培育抗逆作物新品種的候選啟動子。

實施例5gus活性測定

1gus酶提取

1)將0.1g的轉基因煙草材料置于研缽中，加入液氮研磨成粉末；

2)加入600μl的酶提取緩沖液，研磨成勻漿；

3)4℃，12000rpm離心10min，取上清，-20℃保存備用。

法測定gus提取液的蛋白含量

1）制作標準曲線：配置濃度0-100μg/ml的bsa梯度液（表1），與考馬斯亮藍g250按照1：5混勻，室溫靜置5min，595nm測量吸收值，以吸收值作縱坐標，蛋白濃度為橫坐標做回歸方程；

2)提取液蛋白含量的測定：取gus提取液20μl，加水至4ml，取出1ml，加入5ml考馬斯亮藍溶液混勻，595nm測量吸收值，根據回歸方程計算樣品中蛋白含量。

熒光測定

1）制作標準曲線：配制10μm4-mu母液，用反應終止液將其稀釋成依次為：62.5nmol/l，125nmol/l，250nmol/l，500nmol/l，1000nmol/l的濃度，用熒光分光光度計在激發光365nm，發射光455nm，狹縫10nm條件下測定各管熒光強度，制作一條標準曲線；

2）取6支1.5ml的離心管，各加入900μl的反應終止液，并編號；

3）取1支1.5ml的離心管，加入37℃預熱的檢測液2mmol/lmug1ml，根據測定蛋白的濃度加入適量的gus提取液，迅速充分混合，立即取出100μl加入1號管中，此時反應為0，嚴格計時；

4）反應管放入37℃水浴中進行酶反應，分別于5、10、15、30、60min時各取出100μl加入到900μl反應終止液，依次加入到2-6號管中混勻，分別為酶反應5、10、15、30、60min時的樣品，在激發光365nm，發射光455nm，狹縫10nm條件下測定各管熒光強度，并從標準曲線上讀取2-6號管中4-mu的含量。

酶活性計算

l)酶活力單位定義：每分鐘水解4-mug生成1nmol或1mg、1μg、1ng4-mu的酶量為一個活力單位，根據定義求出各樣品的酶活力；

2)gus基因表達活性：以每毫克蛋白的酶活力來計算，每毫克蛋白每分鐘催化生成1pmol4-mu作為gus的一個活力單位。

gus熒光檢測的gus活性用獲得的熒光值除以蛋白濃度和時間得到相對活性。熒光測定結果（如圖3）顯示，未處理的轉sp2基因煙草熒光值較低；不同脅迫處理條件下，轉基因煙草的gus熒光值均有所提高，其中干旱脅迫下提高的尤為顯著，約為未處理的8倍左右。這就表明，sp2啟動子為脅迫誘導型啟動子，能夠在脅迫條件下驅動gus基因表達而使對應的熒光值提高。

<110>吉林農業大學

<120>一種植物干旱誘導型人工合成啟動子sp2及應用

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<212>dna

<213>人工

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