特異性抑制MSI?1基因表達的siRNA及其重組載體和應用的制作方法

本發明涉及分子生物學與生物醫藥技術領域，具體為一種特異性抑制msi-1基因表達的sirna及其重組載體和應用。

背景技術：

rna干擾(rnainterference，rnai)，又叫基因沉默，是動植物中廣泛存在的序列特異性轉錄后基因沉默機制。2001年tuschl和他同事發現體外培養的哺乳動物細胞轉染人工合成的21-23nt的雙鏈sirna分子可以模擬rnai作用，進一步研究發現短于21bp或者長于25bp的雙鏈rna(dsrna)均不能有效啟動rnai，而且其中間序列只要有一個堿基的錯配，基因沉默的效應就明顯減退甚至消失，充分體現了其作用的特異性。

正因為rnai作用具有很高的特異性和高效性，為基因的功能研究提供了強有力的研究工具，利用小分子干擾rna(sirna)作為基因沉默的方法被廣泛用于惡性腫瘤機制的研究，大力推動了以該技術為基礎的腫瘤特異高效治療策略的研發進程。

卵巢癌是女性第二大常見惡性腫瘤，是女性因癌致死的主要原因，在早期很少有癥狀表現，60％以上的婦女在明確診斷時已是iii期或iv期，已發生廣泛轉移，預后很差。標準的治療手段為卵巢腫瘤細胞減滅術加后續化療，但大多數的患者還是會因為化療耐藥、腫瘤復發最終死亡，五年生存率極低(30％左右)。如何改善卵巢癌的治療效果、尋找卵巢癌化療耐藥的解決方案，是婦科腫瘤學家面臨的最嚴峻挑戰。

分子靶向藥物和化療聯合應用是目前提高惡性腫瘤患者生存率最有前景的治療方法。研究發現腫瘤細胞中的一類亞群，腫瘤干細胞樣細胞(cancerstem-likecells，cscs)，能導致腫瘤形成和藥物耐藥，cscs的抗藥性和一些關鍵基因的表達有明顯相關性。在卵巢癌細胞中也陸續發現了一些cscs標記分子和耐藥相關，musashi-1(msi-1)基因就是其中一個。最近有文獻報道在卵巢漿液性腺癌、粘液性腺癌和透明細胞癌中msi-1蛋白表達明顯高于正常組織，臨床資料分析發現還和預后密切相關，msi-1高表達預后就差。

msi-1是在研究神經元前體細胞不對稱分裂過程中首次被發現和報道的一種rna結合調控基因，是一個干細胞早期調控的重要基因，在小鼠小腸和人結腸憩室干細胞中也有表達。最近發現干細胞標記分子msi-1在實體腫瘤，如神經膠質瘤、結直腸癌和子宮內膜癌中表達均有上調，同時msi-1可以作為疾病進展、轉移和預后的判斷指標。進一步研究發現msi-1可能通過抑制numb基因表達進而激活了notch信號傳導途徑。msi-1不僅是細胞干細胞的標記，還是腫瘤細胞化療和放療耐藥的信號傳導分子。這些途徑可能是msi-1基因參與卵巢癌發病和耐藥的主要機制。

因此，采用rnai技術進行msi-1基因在卵巢癌中的研究將是對卵巢癌發病機制的重要補充，是對卵巢癌及其耐藥治療的重要探索和應用。

技術實現要素：

本發明的目的在于提供一種特異性抑制msi-1基因表達的sirna，用于卵巢癌發病機制研究。本發明的另一個目的在于提供該sirna在制備治療卵巢癌和紫杉醇耐藥的卵巢癌藥物中的應用。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

本發明設計、合成3對特異性抑制msi-1基因表達的sirna，分別轉染到卵巢癌細胞株a2780及其紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，結果發現s2抑制msi-1基因表達的干擾效果最明顯。

本發明提供了一種特異性抑制msi-1基因表達的sirna(s2)，包括正義鏈和反義鏈，

所述正義鏈：5’-aauuucacacacuuucuccac-3’(seqidno.1)；

所述反義鏈：5’-ggagaaagugugugaaauuca-3’(seqidno.2)。

作為優選，所述正義鏈和反義鏈的5’和3’端的3個堿基進行2’-甲氧基-4’-硫代修飾。本發明研究證明，2’-甲氧基-4’-硫代修飾后的sirna(s2)穩定性增加，提高其在體內抵抗核糖酶的水解的能力，降低免疫刺激反應，延長sirna干擾基因表達下調的作用時間，使其作用具有高效性、特異性。

本發明提供了一種包含編碼所述sirna的dna序列的rna干擾試劑盒。所述試劑盒中包含克隆了所述sirna的dna質粒載體，應用時，該質粒載體在真核細胞中轉錄表達所需的sirna，從而達到沉默msi-1基因的表達。

本發明提供了一種含有編碼所述sirna的dna序列的重組載體。作為優選，采用的原始載體為慢病毒載體plko.1puro。

本發明還提供了重組載體的構建方法，包括：

(1)合成msi-1-s2片段，選擇agei和ecori兩個酶切位點，根據s2的序列，設計其shrna序列，序列如下：

正義鏈：

5’-ccggtgaatttcacacactttctccacttcaagagagtggagaaagtgtgtgaaattcattttttggtacc-3’(seqidno.8)；

反義鏈：

5’-aattggtaccaaaaaatgaatttcacacactttctccactctcttgaagtggagaaagtgtgtgaaattca-3’(seqidno.9)；

(2)退火得到msi-1-s2的dna片段；

(3)用慢病毒載體plko.1puro構建plko.1-msi-1-s2重組載體。

本發明提供的sirna能夠高效特異性抑制卵巢癌細胞msi-1基因的表達，減少細胞增殖，增加細胞凋亡，降低細胞遷移和侵襲能力，因此，所述sirna和重組載體作為msi-1基因表達抑制劑可以應用于腫瘤疾病發病機制的研究當中。所述msi-1基因序列如seqidno.3所示。

本發明提供了所述sirna和重組載體在制備msi-1基因表達抑制劑中的應用。

本發明提供了所述sirna和重組載體在制備治療卵巢癌、神經膠質瘤、結直腸癌或子宮內膜癌藥物中的應用。

本發明研究表明，紫杉醇耐藥株a2780/taxol轉染所述sirna后，該細胞株對紫杉醇的敏感性明顯提高，逆轉指數為9.08，說明本發明提供的sirna對紫杉醇耐藥株a2780/taxol耐藥的逆轉效果非常明顯，因此，所述sirna對逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的治療具有潛在應用價值。

本發明提供了所述的sirna和重組載體在制備逆轉卵巢癌紫杉醇耐藥的藥物中的應用。

本發明具備的有益效果：

本發明提供的sirna能夠特異性、高效地抑制msi-1基因的mrna和蛋白表達，減少細胞增殖，增加細胞凋亡，降低細胞遷移和侵襲能力，并能有效逆轉卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥。將其應用于腫瘤發病機制研究、腫瘤治療及逆轉卵巢癌耐藥治療中，具有重要意義。

附圖說明

圖1為qrt-pcr檢測s1，s2，s3轉染48h后a2780細胞msi-1mrna表達。

圖2為qrt-pcr檢測s1，s2，s3轉染48h后a2780/taxol細胞msi-1mrna表達。

圖3為westernblotting檢測s1，s2，s3轉染72h后a2780細胞msi-1蛋白表達。

圖4為westernblotting檢測s1，s2，s3轉染72h后a2780/taxol細胞msi-1蛋白表達。

圖5為qrt-pcr篩選不同濃度s2轉染48h后a2780細胞msi-1mrna表達。

圖6為qrt-pcr篩選不同濃度s2轉染48h后a2780/taxol細胞msi-1mrna表達。

圖7為westernblotting篩選不同濃度s2轉染72h后a2780細胞msi-1蛋白表達。

圖8為westernblotting篩選不同濃度s2轉染72h后a2780/taxol細胞msi-1蛋白表達。

圖9為plko.1-msi-1-s2重組質粒及插入酶切位點示意圖。

圖10為小發卡shrna示意圖。u6啟動子指導下游小發卡shrna的轉錄；包括23個s2正義鏈堿基，23個s2反義鏈堿基。

圖11為westernblotting檢測plko.1-msi-1-s2轉染后a2780細胞msi-1蛋白表達。

圖12為westernblotting檢測plko.1-msi-1-s2轉染后a2780/taxol細胞msi-1蛋白表達。

圖13為相差顯微鏡觀察轉染plko.1-msi-1-s2后a2780和a2780/taxol細胞數量和形態變化。

圖14為溴標法檢測轉染plko.1-msi-1-s2后a2780和a2780/taxol細胞增殖。

圖15為caspase3活性檢測轉染plko.1-msi-1-s2后a2780和a2780/taxol細胞凋亡。

圖16為細胞劃痕實驗檢測轉染plko.1-msi-1-s2后a2780細胞遷移能力。

圖17為細胞劃痕實驗檢測轉染plko.1-msi-1-s2后a2780/taxol細胞遷移能力。

圖18為transwell檢測轉染plko.1-msi-1-s2后a2780和a2780/taxol細胞遷移能力。

圖19為transwell檢測轉染plko.1-msi-1-s2后a2780和a2780/taxol細胞侵襲能力。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步說明。以下的實施例中采用的方法目的是更好地理解本發明，但并不限于本發明。如無特殊說明，實施例中涉及的實驗方法均為常規方法，所用的實驗材料均為常規試劑公司購買。

采用spss16.0統計分析軟件，各樣本數據以均數±標準差表示，兩組之間的差異用t檢驗(independent-samplettest)，多組之間的檢驗用單因素方差分析(one-wayanova)，p＜0.05有統計學差異。

卵巢癌細胞株a2780及卵巢癌a2780紫杉醇耐藥細胞株a2780/taxol由浙江省女性生殖健康研究重點實驗室細胞庫保存；

兔抗人msi-1一抗(cat.27185-1-ap)、鼠抗人gapdh一抗(cat.60004-1-ig)、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(cat.sa00001-1)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔igg(h+l)二抗(cat.sa00001-2)均購自proteintech公司；

westernblottingluminolreagent檢測試劑盒(cat.sc-2048)購自santacruz公司；

cdna逆轉錄試劑盒primescript^tmrtmastermix(cat.rr036a)、熒光定量pcr檢測試劑盒sybrpremixextaq(perfectrealtime,cat.drr041a)購自takara公司；lipofectamine3000轉染試劑盒(cat.l3000008)購自invitrogen公司；

限制性內切酶agei(cat.r0552s)、ecori(cat.r0101s)、kpni(cat.r0142s)購自neb公司；t4連接酶(cat.2011a)、dna片段純化試劑盒(cat.9761)、dna凝膠回收試劑盒(cat.9762)、質粒dna小量純化試劑盒(cat.9760)均購自takara公司；

sirna由takara公司合成；pcr引物及克隆用dna由上海生工生物工程公司合成；

預染蛋白marker(cat.26616)購自fermentas公司；

溴標法細胞增殖檢測試劑盒cellproliferationelisa,brdu(colorimetric,cat.11647229001)購自roche公司；

caspaceassaysystem(colorimetric，cat.g7351)購自promega公司；細胞遷移、侵襲模型transwellpermeablesupports(cat.3428)購自corning公司；

lab-tekiichamberslidesystem—lab-tek腔室玻片系統購自nunc公司(cat.154526)；

bdmatrigel^tmbasementmembranematirx基質膜(cat.356234)購自bd公司；

sirna陰性對照allstarsnegativecontrolsirna(cat.1027281)購自qiagen公司；

sds-page凝膠配置試劑盒(cat.cw0022m)購自康為世紀公司；

0.45umpvdf膜(cat.ipvh00010)購自millipore公司；

紫杉醇(cat.p106868)購自aladdin公司。

實施例1.msi-1sirna設計合成

在genebank中查獲musashi-1基因序列(nm_002442.3)，用sidirectver2.0軟件(http://sidirect2.rnai.jp/)在線設計獲得3對sirna序列，設計過程中選擇同時滿足文獻報道的三種算法(ui-tei×reynolds×amarzguioui)的序列，并選擇sirna作用特異性最高的23nt長度片段，該設計可避免將來體內實驗時發生干擾素樣免疫反應，選擇起始密碼子后100nt，避開5’和3’端utr區，gc含量控制在30-70％。共選擇3對23nt長度的sirna作為實驗篩選干擾片段，結構特征表現為正義鏈和反義鏈3’端各有兩個堿基外掛，結構特點如下

隨后用blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)在線進行同源性搜索，排除有同源性的序列，盡可能避免非特異性片段對sirna特異性作用效應的影響。

最后在化學合成時對正義鏈和反義鏈的5’和3’端連續3個嘌呤(嘧啶)堿基進行2’-ome-4’-thio(2’-甲氧基-4’-硫代)修飾，增加sirna分子在細胞內的化學穩定性，延長sirna干擾基因表達下調的時間和效應。最終的序列和修飾如表1和式(ⅰ)如下：

表1

實施例2.三對msi-1sirna在卵巢癌細胞株a2780及其紫杉醇耐藥株a2780/taxol中對msi-1基因干擾效果的檢測和篩選

一、實驗分組：

1.a2780正常組(不轉染sirna)。以下稱作a；

2.a2780陰性對照組(轉染陰性對照sirna)，以下稱作a-n；

3.a2780實驗組(轉染s1)，以下稱作a-s1；

4.a2780實驗組(轉染s2)，以下稱作a-s2；

5.a2780實驗組(轉染s3)，以下稱作a-s3；

6.a2780/taxol正常組(不轉染sirna)，以下稱作ar；

7.a2780/taxol陰性對照組(轉染陰性對照sirna)，以下稱作ar-n；

8.a2780/taxol實驗組(轉染s1)，以下稱作ar-s1；

9.a2780/taxol實驗組(轉染s2)，以下稱作ar-s2；

10.a2780/taxol實驗組(轉染s3)，以下稱作ar-s3。

二、分組轉染

為確保轉染效率，降低細胞毒性，我們采用lipofectamine3000轉染試劑進行sirna轉染。轉染前一天，胰酶消化細胞并計數，細胞鋪板在六孔板中，使其在轉染日密度0.5×10⁶/ml，細胞融合至70-90％。每孔用125μl無血清opti-mem培養基稀釋5ullipofectamine3000試劑并充分混勻；制備sirna預混液，用125μl無血清opti-mem培養基稀釋sirna至終濃度為50nm，并充分混勻；在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入sirna預混液(1:1)，室溫孵育5min；最后將sirna-脂質體復合物加入細胞中，37℃，5％的co2中繼續培養。48h后檢測msi-1mrna表達，72h后檢測msi-1蛋白表達。

三、實時熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測msi-1基因mrna表達

培養48h后吸棄6孔板中的培養基，用pbs洗滌兩次后用trizol抽提總rna，thermonanodrop2000分光光度儀測定rna濃度，并按sybrpremixextaq(perfectrealtime)試劑盒說明書操作。第一步rna變性。反應體系：rna0.5ug，去rna酶depc水補足至6.8ul；反應條件：70℃孵育10min后置于冰上。第二步逆轉錄。反應體系：按照primescriptrtmastermix試劑盒說明書進行逆轉錄；反應條件：42℃孵育60min，85℃滅活5min后，-20℃保存。取1ul逆轉錄產物進行熒光定量pcr反應。pcr引物序列：

5’-gtctcgagtcatgccctacg-3’；5’-aggaatggctgtaagctcgg-3’，產物長度：202bp，反應條件：95℃10s，95℃5s，6℃30s，共40個循環。采用2^-△ct法計算各組樣本中msi-1mrna的表達量。

結果：如圖1所示，a2780細胞分別轉染s1、s2、s3后，msi-1mrna的表達均有明顯下降，其中a-s2干擾效果最好，與陰性對照組比較，msi-1mrna下調了96.84％(p＜0.05)。同樣如圖2所示，在a2780/taxol細胞中，ar-s2干擾效果最好，與陰性對照組比較，msi-1mrna下調了95.18％(p＜0.05)。結果表明，在a2780和紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，s2對msi-1的mrna表達有最好的干擾效果。

四、westernblotting檢測msi-1蛋白表達

培養72h后吸棄6孔板中的培養基，pbs洗滌3次，加入ripa蛋白裂解液(100ul/孔)，吹打數次，冰上孵育5min，使之充分裂解，4℃，12000轉離心5分鐘，收集上清，分裝-20℃貯存；每個樣品95℃變性5min后取10ul上樣，8％sds-page電泳，200v，10min；100v，100min；轉至pvdf膜：110v，120min；用含5％脫脂奶粉的tbs封閉液封閉60min；一抗孵育：msi-1一抗(1：2000)、gapdh一抗(1：5000)室溫下孵育2h；tbs洗膜10min×3次；二抗孵育：辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠igg(h+l)二抗(1：10000)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔igg(h+l)二抗(1：10000)孵育1h；tbst洗膜10min×3次，tbs洗膜10min×1次；ecl顯影后，用imagequantlas4000mini(gehealthcare)對圖象掃描處理。

結果：如圖3、圖4所示，與陰性對照相比，s2轉染后，a2780細胞和a2780/taxol細胞中msi-1蛋白表達顯著下降(p﹤0.05)，且與s1和s3相比有顯著差異(p﹤0.05)。結果表明，在a2780和紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，s2對msi-1的蛋白表達具有最好的干擾效果。故經過篩選，s2被選擇作為后續研究的sirna。

實施例3.篩選和優化s2干擾msi-1基因表達的作用劑量

研究發現，越是小劑量能高效起到干擾效果的片段，特異性越高，同時對細胞的毒副作用也越小。因此在實施例2中篩選獲得了干擾效果最好的sirna片段(s2)的基礎上，需要進一步優化s2的轉染劑量，使之達到最佳量效比。該部分設立了50nm，10nm，2nm，400pm，80pm五個劑量梯度轉染細胞。

一、實驗分組：

1.a2780正常組(不轉染sirna)，以下稱作a；

2.a2780陰性對照組(轉染陰性對照sirna)，以下稱作a-n；

3.a2780實驗組1(轉染50nms2)；

4.a2780實驗組2(轉染10nms2)；

5.a2780實驗組3(轉染2nms2)；

6.a2780實驗組4(轉染400pms2)；

7.a2780實驗組5(轉染80pms2)；

8.a2780/taxol正常組(不轉染sirna)，以下稱作ar；

9.a2780/taxol陰性對照組(轉染陰性對照sirna)，以下稱作ar-n；

10.a2780/taxol實驗組1(轉染50nms2)；

11.a2780/taxol實驗組2(轉染10nms2)；

12.a2780/taxol實驗組3(轉染2nms2)；

13.a2780/taxol實驗組4(轉染400pms2)；

14.a2780/taxol實驗組5(轉染80pms2)。

二、分組轉染

轉染過程同前。轉染48h后檢測msi-1mrna表達，72h后檢測msi-1蛋白表達。

三、實時熒光定量rt-pcr(qrt-pcr)檢測msi-1基因mrna表達

細胞轉染后繼續培養48h，抽提總rna，經過rna變性、逆轉錄后取1ul逆轉錄產物進行熒光定量pcr反應，具體步驟和反應體系同前。采用2^-△ct法計算各組樣本中msi-1mrna的表達量。

結果：如圖5所示，a2780細胞中，當s2的劑量為50nm，10nm，2nm時，msi-1mrna的表達量分別下降了95.78％，94.72％和91.25％，三種劑量之間無明顯差異；當s2的劑量400pm，80pm時，msi-1mrna的表達量分別下降了73.45％和56.71％，提示s2在低濃度(2nm)時有最高的量效比，能抑制超過90％msi-1mrna的表達，同時我們也發現，即使在極低的轉染濃度(80pm)時，s2仍然能對msi-1mrna的表達達到近50％的抑制效果，是特異性和效果非常好的干擾片段。

同樣如圖6所示，在a2780/taxol細胞中，當s2的劑量為50nm，10nm，2nm時，msi-1mrna的表達量分別下降了95.74％，94.15％和92.29％，三種劑量之間無明顯差異；當s2的劑量400pm，80pm時，msi-1mrna分別下降了72.61％和51.20％，提示在a2780/taxol細胞中，2nm仍然是最高量效比的濃度。

四、westernblotting檢測msi-1蛋白表達

細胞轉染后培養72后，抽提蛋白，8％sds-page電泳，轉膜，一抗孵育，二抗孵育，ecl顯影后分析圖像，具體步驟同前。

結果：如圖7所示，a2780細胞中，當s2的劑量為50nm，10nm，2nm時，msi蛋白表達量與陰性對照相比，分別下降了93.84％，94.02％和91.23％，三種劑量之間無明顯差異；當s2的劑量400pm，80pm時，msi-1蛋白表達量分別下降了69.87％和58.91％。

同樣如圖8所示，在a2780/taxol細胞中，當s2的劑量為50nm，10nm，2nm時，msi-1蛋白表達量與陰性對照相比，分別下降了92.15％，91.87％和91.03％，三種劑量之間無明顯差異；當s2的劑量400pm，80pm時，msi蛋白分別下降了61.13％和50.66％。

以上結果顯示，當s2的劑量為2nm時，無論在mrna水平還是在蛋白水平都能特異性、高效抑制msi-1基因的表達。

實施例4.真核載體plko.1-msi-1-s2的構建及對msi-1基因表達的干擾效果檢測

一、實驗分組：

1.a2780正常組(不轉染任何載體)，以下稱作a；

2.a2780陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作a-n；

3.a2780實驗組1(轉染plko.1-msi-1-s2)；以下稱作a-s2；

4.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)，以下稱作ar；

5.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

6.a2780/taxol實驗組1(轉染plko.1-msi-1-s2)；以下稱作ar-s2；

二、合成msi-1-s2片段

選擇agei和ecori兩個酶切位點，根據s2的序列，設計其shrna序列并構建到真核表達載體plko.1puro中。序列如下：

正義鏈

5’-ccggtgaatttcacacactttctccacttcaagagagtggagaaagtgtgtgaaattcattttttggtacc-3’

反義鏈

5’-aattggtaccaaaaaatgaatttcacacactttctccactctcttgaagtggagaaagtgtgtgaaattca-3’

三、真核載體plko.1-msi-1-s2的構建

用真核表達載體plko.1puro構建plko.1-msi-1-s2重組表達載體(圖9和10)，具體方法參見美國冷泉港出版社《分子克隆實驗指南》。

將msi-1-s2正義鏈和反義鏈經退火程序(95℃變性2min；緩慢冷卻退火至25℃)，4℃保存。agei和ecori完全酶切載體plko.1puro，37℃過夜；酶切產物用dna凝膠回收試劑盒回收dna。退火產物與載體酶切回收片段進行連接反應，反應體系(10ul)：t4連接酶1ul，t4連接酶緩沖液1ul，退火產物與載體酶切回收片段混合物(摩爾比3:1)；去離子水補至10ul，16℃連接過夜；取5ul連接產物置于100uljm109感受態細菌中，冰浴30min，42℃熱休克90s，冰浴5min，加lb培養基1000ul，37℃搖床培養30min，5000rpm離心5min，棄上清，將細菌均勻涂布于lb平板上(含50ug/ml氨芐青霉素)，37℃倒置培養過夜；挑選若干獨立菌落接種于含相應抗性的lb培養基中，37℃震蕩過夜擴菌；收集細菌，用質粒dna純化試劑盒抽提獲得質粒dna，kpni酶切鑒定，獲得plko.1-msi-1-s2重組質粒。

四、plko.1-msi-1-s2重組質粒轉染細胞后觀察干擾效果

將plko.1-msi-1-s2轉染入對數生長期的a2780及a2780/taxol細胞中。轉染參照lipofectamine3000操作說明書，每孔用125μl無血清opti-mem培養基稀釋5ullipofectamine3000試劑并充分混勻；在125μl無血清opti-mem培養基中加入5ug重組質粒dna，加入p3000試劑10ul，充分混勻，制備重組質粒預混液；在已稀釋的lipofectamine3000試劑中加入重組質粒預混液(1:1)，室溫孵育5mim；最后將重組質粒-脂質體復合物250ul加入細胞中，37℃，5％的co2中繼續培養。72h后檢測msi-1蛋白表達。

如圖11和圖12所示，轉染plko.1-msi-1-s2重組質粒后，與陰性對照(轉染空質粒)相比，a2780細胞和a2780/taxol細胞中msi-1蛋白表達均顯著下降(p﹤0.05)，結果表明，在a2780和紫杉醇耐藥株a2780/taxol中，轉染plko.1-msi-1-s2重組質粒能有效干擾msi-1的蛋白表達。

實施例5.plko.1-msi-1-s2特異性阻斷msi-1表達后對腫瘤細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

一、實驗分組：

1.a2780正常組(不轉染任何載體)，以下稱作a；

2.a2780陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作a-n；

3.a2780實驗組1(轉染plko.1-msi-1-s2)；以下稱作a-s2；

4.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)，以下稱作ar；

5.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)，以下稱作ar-n；

6.a2780/taxol實驗組1(轉染plko.1-msi-1-s2)；以下稱作ar-s2。

二、分組轉染

轉染步驟同前，轉染后繼續培養細胞，用于檢測細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲。

三、細胞增殖試驗

細胞在96孔板中轉染plko.1-msi-1-s2后繼續培養72h，每孔加入10ulbrdu標記液至brdu終濃度為10um，37℃孵育2h；吸除brdu標記液，每孔加入200ulfixdenat，20℃孵育30min；吸除fixdenat，每孔加入100ulanti-brdu-pod，20℃孵育90min；每孔200ulwashingsolution洗滌3次；加入100ul/孔底物溶液，20℃孵育20min，檢測波長370nm(參考波長492nm)測吸光度(a)，細胞增殖的能力用a實驗組/a對照組表示。

結果如圖13和圖14所示，在a2780和a2780/taxol細胞中，轉染plko.1-msi-1-s2后，相差顯微鏡下觀察可見，實驗組細胞數量明顯減少，懸浮細胞數量增加，可見較多細胞碎片；溴標法測試細胞增殖結果也顯示：與陰性對照相比，a2780和a2780/taxol實驗組細胞增殖能力分別下降了72.60％和65.02％，有顯著性差異(p＜0.05)。說明特異性阻斷msi-1的表達后，能抑制腫瘤細胞增殖。

四、caspase3活性檢測細胞凋亡

轉染72h后收集細胞，裂解液調整細胞密度為1×10⁸/ml，冰上裂解15min，15000g×20min，收集上清。按照caspaceassaysystem(colorimetric)說明書同時制備陽性和陰性對照樣品，測定并調整各組蛋白濃度相同。96孔板中每孔加入caspaceassaybuffer32ul，dmso2ul，100nmdtt10ul，去離子水調整體積為98ul，加入2uldevd-pna底物，37℃孵育4h，檢測波長405nm測吸光度，用δa法計算每組樣品caspase3活性。

結果如圖15所示，a2780和a2780/taxol細胞轉染plko.1-msi-1-s2后，caspase3活性分別增加了2.29倍和2.33倍，與陰性對照比較，均有顯著性差異(p＜0.05)說明特異性阻斷msi-1的表達后，能促進腫瘤細胞凋亡。

五、細胞劃痕試驗檢測細胞遷移能力

在六孔板背后用直尺均勻劃橫線，約0.5cm劃一道，橫穿過孔，每孔至少有6條橫線。細胞轉染plko.1-msi-1-s2后，繼續培養24h細胞融合成單層狀態時，在選定區域用200ul的槍頭在六孔板中垂直劃痕，pbs洗3次去除劃下的細胞，加入無血清培養基繼續培養。0h，24h，48h時間點拍照，隨機選取6條水平線，計算細胞間距離均值。

結果如圖16和圖17所示，plko.1-msi-1-s2轉染細胞24h和48h后，a2780和a2780/taxol細胞間距離顯著大于陰性對照組，細胞劃痕后愈合能力顯著下降，說明特異性阻斷msi-1的表達后，能抑制腫瘤細胞的遷移。

六、transwell試驗檢測細胞遷移能力

細胞轉染48h后，用胰酶消化收集，用無血清培養基重懸，調整細胞密度為5×10⁵/ml，上室加2ml細胞懸液，下室加10％fbs完全培養基2ml，繼續培養24h，取出小室，pbs洗3次，用棉簽小心去除上室上層表面的細胞，倒置晾干，95％乙醇固定25min，蘇木素染色，顯微鏡下觀察、計數、拍照。每個小室計數10個視野，取平均值統計并分析細胞遷移能力的改變。

細胞遷移實驗結果如圖18所示，轉染plko.1-msi-1-s2后，a2780實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數量分別是272±25與81±11，兩者有統計學差異(p＜0.05)；a2780/taxol實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數量分別是239±21與69±12，兩者有統計學差異(p＜0.05)；該結果表明，特異性阻斷msi-1的表達后，能抑制腫瘤細胞的遷移。

七、transwell試驗檢測細胞侵襲能力

將-20℃保存的基質膠先在4℃復溫液化，取基質膠與opti-mem以1:6冰上混勻稀釋，包被小室底部膜的上室面，37℃固化30min，吸除小室內析出的液體。基質膠包被后其余步驟同上，每個小室計數10個視野，取平均值統計并分析細胞侵襲能力的改變。

細胞侵襲實驗結果如圖19所示，a2780實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數量分別是178±19與33±5，兩者有統計學差異(p＜0.05)；a2780/taxol實驗組與陰性對照組穿透小室的細胞數量分別是162±21與37±6，兩者有統計學差異(p＜0.05)；該結果表明，特異性阻斷msi-1的表達后，能抑制腫瘤細胞浸潤。

實施例6.plko.1-msi-1-s2特異性阻斷msi-1表達后對卵巢癌耐藥的逆轉作用

一、實驗分組：

1.a2780正常組(不轉染任何載體)；

2.a2780/taxol正常組(不轉染任何載體)；

3.a2780/taxol陰性對照組(轉染plko.1puro空載體)；

4.a2780/taxol實驗組(轉染plko.1-msi-1-s2)。

二、分組轉染

轉染步驟同前，轉染后繼續培養細胞24h。

三、轉染plko.1-msi-1-s2后細胞對紫杉醇敏感性的檢測

各組取對數生長期細胞，胰酶消化后細胞重懸，細胞計數并調整細胞懸液的密度為1×10⁵/ml，接種到96孔板繼續培養24h。次日，各組中加入紫杉醇，濃度梯度分別設200ug/ml，100ug/ml，50ug/ml，25ug/ml，12.5ug/ml，6.25ug/ml，3.125ug/ml，0ug/ml，作用24h后，用溴標法在波長370nm(參考波長492nm)測吸光度(a)，計算紫杉醇對每組細胞的抑制率，抑制率＝a實驗組/a陰性對照組。每個濃度設3個復孔，取平均值。

抑制率為50％時的藥物濃度為半數抑制濃度(ic50)；

耐藥株a2780/taxol的ic50與其親本細胞株a2780的ic50的比值為耐藥倍數(resistantfolder,rf)；

耐藥株a2780/taxol的ic50與其轉染plko.1-msi-1-s2(逆轉劑)后的ic50的比值為耐藥逆轉指數(reversalindex,ri)。

結果如表2和表3所示，a2780/taxol對紫杉醇的ic50(38.95±3.87ug/ml)顯著高于親本a2780對紫杉醇的ic50(1.302±0.24ug/ml)，耐藥倍數高達29.92，提示a2780/taxol對紫杉醇的敏感性顯著低于親本細胞a2780，高度耐藥。而當a2780/taxol轉染plko.1-msi-1-s2之后，對紫杉醇的敏感性明顯提高(4.32±0.96ug/ml)，plko.1-msi-1-s2對a2780/taxol紫杉醇耐藥的逆轉效果非常明顯，逆轉指數為9.08。

表2.a2780及a2780/taxol對紫杉醇的藥物敏感性

表3.轉染plko.1-msi-1-s2后a2780/taxol對紫杉醇藥物敏感性的逆轉

sequencelisting

<110>浙江大學

<120>特異性抑制msi-1基因表達的sirna及其重組載體和應用

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