葡萄早熟基因VvWRKY13在調控植物中乙烯生物合成中的應用的制作方法

本發明屬于葡萄早熟有利基因挖掘和功能鑒定
技術領域：
，具體涉及葡萄早熟基因vvwrky13在調控植物中乙烯生物合成中的應用。
背景技術：
：葡萄作為一種世界廣適性水果，以其獨特的釀酒特性風靡全球。隨著經濟增長，中國葡萄酒消費呈上升趨勢，葡萄種植面積隨之增加。據“國際葡萄與葡萄酒組織”(internationalorganizationofvineandwine，oiv)發布的統計數據顯示，2014年中國用于釀造葡萄酒的葡萄種植面積為79.9萬公頃，占全球葡萄種植面積的11%，超過79.2萬公頃的法國躍居世界第二。目前，葡萄產業已經成為我國農業產業化的一個重要產業。因此，探明葡萄果實生長發育的分子調控機制，對促進葡萄研究，提高我國葡萄的產量和品質，增加我國葡萄在國內和國際市場的競爭力具有極為重要的現實意義。葡萄果實的生長發育呈現出一種典型的雙“s”型曲線，總體上分為3個生長階段：第一生長周期(幼果膨大期)、停滯期(硬核期)和第二生長周期。葡萄果實的第一生長周期(幼果膨大期)從開花期持續將近60天。在這一生長周期結束時，漿果和種胚基本形成，漿果普遍呈橢圓形并生長到成熟果實體積的70%。第二個時期叫做停滯期(硬核期)。這一時期持續時間的長短與葡萄品種特性有關，無核葡萄這一時期相對短些，有核葡萄主要進行種胚的發育、種皮的硬化。此期還進行風味物質和芳香族化合物的合成、以及一些前體物質的形成。停滯期(硬核期)結束的標志是葡萄果皮的顏色開始發生變化，因此這個轉折點也叫轉色期。一般認為葡萄果實的停滯期在很大程度上決定了漿果成熟時的品質。之后，葡萄果實的發育進入最后一個時期——第二生長周期，漿果體積再次快速增大，含糖量急劇上升，含酸量迅速下降，單寧含量顯著降低，花色苷和芳香族化合物大量合成，從而使果實呈現出特有的色、香、味，達到最佳的食用狀態。目前，對果實生長發育的研究主要集中在第二生長周期即從果實轉色到成熟的階段，而對前兩個時期的關注很有限。技術實現要素：本發明涉及葡萄早熟基因vvwrky13在調控植物中乙烯生物合成中的應用，同時不改變果實成熟時品質的功能和應用，可以為葡萄早熟有利基因挖掘做出貢獻，從而解決縮短果實生長期的時候，難以保持果實品質的生產問題。為達到解決上述生產問題的目的，本發明采用以下技術方案予以實現：本發明提供了葡萄早熟基因vvwrky13在調控植物中乙烯生物合成中的應用。進一步的：所述植物為番茄。進一步的：將含有葡萄早熟基因vvwrky13的農桿菌菌株侵染番茄，進行共培養；將共培養后的外植體置于芽誘導培養基中進行繼代培養；待外植體發芽后轉入芽伸長培養基培養；之后將芽轉入生根培養基中培養至獲得轉基因vvwrky13番茄植株。進一步的：在花后7天和轉色期，乙烯在轉基因vvwrky13番茄株系中的釋放速率顯著高于野生型番茄，vvwrky13影響番茄果實發育前期乙烯的生成量。進一步的：乙烯合成關鍵酶基因slacs1b、slaco1和slaco4在轉基因vvwrky13番茄果實中的表達量顯著升高，vvwrky13通過影響番茄果實發育過程中乙烯合成相關基因的表達來調控番茄果實中乙烯的生物合成。進一步的：轉基因vvwrky13番茄植株種子具有典型的組成型三重反應表型。進一步的：轉基因vvwrky13番茄植株中vvwrky13基因的相對表達量與野生型番茄相比顯著增加，vvwkry13過表達促進了乙烯的過量生成。進一步的：基因vvwrky13的過表達縮短了果實發育過程中的膨大期。進一步的：基因vvwrky13過表達番茄株系果實從開花到轉色比野生型早2-3天，vvwrky13縮短了果實幼果發育的時間。進一步的：基因vvwrky13過表達番茄株系果實中的番茄紅素、可溶性糖和可滴定酸的含量與野生型相比均無變化。與現有技術相比，本發明的優點和有益技術效果是：1、本發明通過實驗證明所述vvwrky13基因在果實的幼果膨大期大量表達，在停滯期和第二生長期表達量迅速降低；并且經轉基因番茄表型性狀驗證只在幼果膨大期起作用，對停滯期和第二生長期幾乎沒有影響。2、本發明所述vvwrky13基因通過調控內源乙烯的生成量起作用，沒有新物質的生成，安全可靠。3、本發明所述vvwrky13基因通過促進幼果膨大期內源乙烯的生成，縮短幼果膨大期，從而達到縮短果實發育期，促進果實早熟的效果。4、本發明所述vvwrky13基因在影響果實品質的重要階段—停滯期和第二生長期--表達量很低，幾乎不影響這兩個時期果實的生長發育，從而最后對果實品質完全沒有負面影響。5、完熟后果實的品質指標可溶性總糖、可滴定酸含量和番茄紅素的含量均無明顯變化。本發明選用漿果研究的模式作物—番茄為實驗材料。通過對vvwrky13轉基因番茄株系生長發育相關表型性狀的研究，證明vvwrky13通過調控果實幼果膨大期乙烯的生成，縮短果實的幼果膨大期，從而使果實早熟但不改變果實的品質。附圖說明圖1是本發明中葉盤法轉化觀賞番茄品種‘micro-tom’的過程。從左至右的5幅圖片分別是萌發的番茄幼苗、預培養的番茄子葉、發芽的愈傷組織、生根培養和轉移至土壤中的轉基因番茄植株。圖2是本發明中觀賞番茄品種‘micro-tom’的轉基因株系中vvwrky13的相對表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖3是本發明中vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實的乙烯生成量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖4是本發明中乙烯合成關鍵酶基因slacs1a在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖5是本發明中乙烯合成關鍵酶基因slacs1b在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖6是本發明中乙烯合成關鍵酶基因slacs2在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖7是本發明中乙烯合成關鍵酶基因slacs4在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖8是本發明中乙烯合成關鍵酶基因slacs6在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖9是本發明中乙烯合成關鍵酶基因slaco1在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖10是本發明中乙烯合成關鍵酶基因slaco3在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖11是本發明中乙烯合成關鍵酶基因slaco4在vvwkry13過表達番茄株系不同時期果實中的表達量。其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖12是本發明中vvwkry13過表達番茄株系的生長情況，其中a、b、c分別代表30天、45天和60天番茄植株的生長狀況。wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖13是本發明中vvwkry13過表達番茄株系的果實，其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖14是本發明中vvwkry13過表達番茄株系果實橫切圖，其中wt代表野生型番茄，l3、l9、l14分別是所篩選的3個獨立的純和的轉基因株系。圖15是本發明中栽培番茄品種‘ailsacraig’的vvwrky13過表達株系的pcr鑒定。s1-s3：轉基因樣品；w：野生型對照；o：陰性對照。圖16是本發明中栽培番茄品種‘ailsacraig’的轉基因株系中vvwrky13的相對表達量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖17是本發明中vvwrky13過表達番茄株系對乙烯的三重反應。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖18是本發明中acc對vvwrky13過表達番茄株系胚軸長度的影響。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖19是本發明中aoa對vvwrky13過表達番茄株系三重反應的影響。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖20是本發明中aoa對vvwrky13過表達番茄株系三重反應中胚軸長度的影響。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖21是本發明中轉基因植株不同時期的果實中果膠酶基因slpg1的相對表達量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖22是本發明中轉基因植株不同時期的果實中果膠酶基因slpg3的相對表達量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖23是本發明中vvwkry13過表達番茄株系完熟果實中番茄紅素的含量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖24是本發明中vvwkry13過表達番茄株系完熟果實中可溶性總糖的含量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。圖25是本發明中vvwkry13過表達番茄株系完熟果實中可滴定酸的含量。其中wt代表野生型番茄，l1、l2、l3分別是所篩選的3個獨立的純合的轉基因株系。具體實施方式以下結合附圖、附表和具體實施例對本發明的技術方案做進一步詳細的說明。實施例1本發明所闡明的vvwrky13基因在乙烯生物合成中的功能和應用的證明，具體包括如下步驟：1、vvwrky13過表達番茄的轉化和篩選：(1)取一定量的市售觀賞番茄品種‘micro-tom’的種子，用75%的乙醇浸泡消毒30s，迅速倒掉。再用4%的次氯酸鈉浸泡消毒15min，消毒后用無菌水洗滌7-8次，每次需充分洗滌，徹底去掉殘留的消毒劑。種子洗滌干凈后，將種子播在種子萌發培養基（1/2ms）。黑暗培養3-4天待種子發芽，發芽后移至25℃，光周期為16h/8h（光照/黑暗）的條件下培養。待長出子葉，子葉剛剛打開、未長出真葉之前的小苗用于轉化。(2)將vvwrky13的cds序列(genbank登錄號：jq692108)轉入含35s啟動子的super1300質粒。之后，將該質粒轉入農桿菌菌株eha105中，并保存于-80℃的超低溫冰箱中，備用。將保存于-80℃的含vvwrky13質粒的農桿菌菌株在yeb液體培養基中恢復培養和擴大培養。其中培養農桿菌所用的yeb液體培養基配方為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物1g/l，蔗糖5g/l，mgso4?7h2o0.5g/l，ph7.0。分裝后121℃高壓滅菌20min，待冷卻至室溫后加入50mg/l過濾滅菌的卡那霉素和利福平。(3)取步驟(1)未長出真葉的無菌子葉，剪去葉尖及葉柄部，將剩余子葉剪成3mm×3mm的大小的方塊，置于無抗生素的ms固體培養基上，28℃預培養2天。(4)將步驟(2)擴搖后的菌液在5000r/min離心10min，沉淀用無菌水稀釋至od600=0.5-0.6作為侵染液。將步驟(3)預培養2天后的外植體在侵染液中侵染5min。置于無抗生素的ms固體培養基上共培養，在28℃暗室共培養2天。共培養培養基成分是ms+2mg/lzt+0.2mg/liaa+100mg/l特美汀+10mg/l潮霉素。(5)將共培養2天后的外植體從暗室取出，全部置于芽誘導培養基，在光下培養7天后轉入新的培養基中進行繼代培養。第一次繼代培養后，一般每隔2周進行下一次繼代培養，直至外植體發芽完全。芽誘導培養基成分是ms+2mg/lzt+0.2mg/liaa。(6)經過芽誘導期后，待外植體發芽芽長約為2-3cm時轉入芽伸長培養基中，培養3-4周。芽伸長培養基成分是ms+0.5mg/lzt+0.2mg/liaa+100mg/l特美汀+10mg/l潮霉素。(7)當芽伸長至4-5cm時，剪掉愈傷組織后將芽轉入到生根培養中，培養3-4周。其中生根培養基成分是1/2ms+10mg/l潮霉素+2mg/liba。(8)將生根旺盛，生長到一定高度的小苗即時轉入土盆里。葉盤法轉化番茄的整個過程如圖1所示。2、vvwrky13轉基因番茄的篩選和純合（1）提取土培階段正常生長的番茄葉片dna，用基因的特異引物進行pcr鑒定。將檢測得到的陽性植株進行正常培養，并標記為t1代。檢測vvwrky13基因所用的pcr引物序列為：vvwrky13-fp1：5’-gctctagaatgtctactacttctcaagcc-3’；vvwrky13-rp1：5’-gctctagaatgtctactacttctcaagcc-3’；（2）為得到純合的轉基因株系，單株收獲t1代種子并播種，得到t2代轉基因番茄幼苗。（3）提取t2代轉基因番茄葉片dna，去除產生基因分離植株，收獲t2代種子。種植收獲的種子，得到t3代的轉基因番茄幼苗。（4）pcr檢測t3代轉基因番茄群體的分離情況。在t3代中不出現基因分離的株系即為純合的轉基因株系。檢測vvwrky13基因所用的pcr引物序列與(1)中的一致。（5）采用qrt-pcr技術檢測轉基因株系中vvwrky13基因的相對表達量。檢測結果如圖2所示。檢測vvwrky13基因表達量所用的qrt-pcr引物序列為：vvwrky13-fp：5’-ggttgccaacaatccct-3’；vvwrky13-rp：5’-gtcatctccaccgatacttc-3’；（6）收集純合的轉基因番茄株系的種子，用于后續實驗。3、vvwrky13過表達番茄株系乙烯生成量、三重反應和乙烯合成基因表達量的檢測（1）以野生型和vvwrky13異源過表達番茄植株果實為材料，分別選取大小均勻的果實3-4個，測定花后7天、轉色期和完熟期果實的乙烯釋放速率。結果如圖3所示，在花后7天和轉色期乙烯在vvwrky13異源過表達株系中的釋放速率顯著高于野生型，而在完熟期差別不明顯，表明vvwrky13影響了番茄果實幼果的乙烯生成量。在乙烯合成途徑中，acc合成酶與acc氧化酶為該途徑的限速酶和關鍵酶。關鍵酶基因的表達決定著乙烯的生成量，以同時期的野生型和vvwrky13異源過表達番茄植株果實為材料，選取大小均勻的野生型和過表達植株的番茄果實3-4個，測定花后7d、轉色期和完熟期果實的乙烯合成途徑相關基因表達量。結果如圖4-11所示，slacs1b、slaco1和slaco4在轉基因果實中比野生型的相對表達量高；其余則無較大差異。綜合分析表明，vvwrky13主要影響了番茄幼果發育過程中乙烯合成關鍵酶基因的表達，進而影響番茄乙烯的生成。檢測slacs1b、slaco1和slaco4基因表達量所用的qrt-pcr引物序列為：slacs1b-fp：5’-tgttctgaacctggttggt-3’；slacs1b-rp：5’-taaaatcatccaatcttcga-3’；slaco1-fp：5’-gtacccgatcttgacga-3’；slaco1-rp：5’-gaagtatgatgcctcctg-3’；slaco4-fp：5’-ctgtcatatttccagcacc-3’；slaco4-rp：5’-aagttgacagtagtctccacag-3’。（2）植物對乙烯的三重反應是植物所特有的反應，可以用于乙烯的生物鑒定。被乙烯處理后的植物幼苗呈現出上下胚軸伸長生長的抑制，上胚軸的橫向加粗，和頂點鉤的擴大。將野生型和vvwkry13過表達番茄種子，無菌處理之后，點種在含有10μmacc和10μmol/laoa的ms培養基上，28℃正常培養12h后，進行黑暗照培養7d，觀測其生長情況。結果顯示：相對于野生型番茄，vvwrky13過表達番茄植株在沒有外源乙烯處理下，上下胚軸生長受抑制，表現出對乙烯的組成型三重反應。在含有10μm乙烯合成抑制劑aoa的培養基上，vvwkry13過表達番茄株系和野生型番茄的三重反應差異變小。以上結果在表型上證明了vvwkry13過表達促進了乙烯的過量生成。4、vvwrky13過表達番茄株系果實各生長期長短的檢測（1）觀察同時播種的野生型番茄和vvwrky13過表達的番茄株系果實的發育情況。結果如圖12、表1和表2所示，vvwrky13過表達株系番茄果實從開花到轉色的時間大約提前2-3天，而轉色到完熟時間均為10天。表明vvwrky13縮短了番茄果實幼果的發育時間。表1從開花至果實轉色的時間統計株系轉色時間（dpa）wt42.67a±1.15l136.33b±1.52l239.33ab±4.0l336.33b±1.52表2果實從轉色至成熟的時間統計株系轉色到成熟（d）wt10a±1.15l110a±1.52l210a±4.04l310a±1.52（2）多聚半乳糖醛酸酶屬于果膠酶類，能降解細胞壁中的果膠使細胞壁分解，參與果實的軟化，其合成酶基因為slpg。檢測其合成基因slpg1和slpg3的表達量，發現其在野生型和vvwrky13過表達番茄株系中的相對表達量并無差異。vvwkry13過表達番茄株系的果實如圖13和圖14所示。檢測slpg1和slpg3基因表達量所用的引物序列為：slpg1-fp：5’-tgaggaccaaatcggaatc-3’；slpg1-rp：5’-tgtcggactaagaaagaataacc-3’；slpg3-fp：5’-atacaacagttttcagcagttcaagt-3’；slpg3-rp：5’-ggttttccactttcccctactaa-3’。5、vvwrky13過表達番茄株系完熟果實品質的檢測番茄紅素屬于類胡蘿卜素，是一種天然的食用色素，主要集中在各種果菜和水果的紅色果肉或組織當中，因其缺乏維生素原活性，對氧自由基具有粹滅作用，因此有預防癌癥、養顏美容、預防心腦血管疾病，也是衡量番茄果實品質的關鍵指標之一。以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系果實為材料，測定完熟期果實中番茄紅素的含量。結果顯示番茄紅素在野生型和vvwrky13過表達番茄植株果實中的含量沒有發生明顯變化。由此可知vvwrky13的過量表達并沒有對番茄果實中的番茄紅素含量產生影響。6、番茄甜度是番茄品質性狀的重要組成部分，它主要取決于番茄果實中可溶性糖含量，因此可以用可溶性糖含量來評價番茄的品質。以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系的果實為材料，測定可溶性糖含量。結果顯示vvwrky13轉基因株系果實與野生型果實的糖含量沒有發生明顯改變，表明vvwrky13的過表達沒有影響番茄果實中可溶性糖含量。7、果實中的酸主要是指總有效有機酸根的陰離子，在番茄中主要可滴定酸為檸檬酸，在番茄的風味中發揮著重要作用。我們以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系的果實為材料檢測可滴定酸的含量。結果表明二者并無明顯差異，說明vvwrky13不影響番茄中可滴定酸含量。綜上表明葡萄vvwrky13通過促進幼果膨大期內源乙烯的生成，縮短幼果膨大期，從而達到縮短果實發育期，促進果實早熟的效果，但對果實品質沒有負面影響。實施例2本發明所闡明的vvwrky13在乙烯生物合成中的功能和應用的證明，具體包括如下步驟：1、vvwrky13過表達番茄的轉化和篩選：（1）取一定量的市售栽培番茄品種‘ailsacraig(ac)’的種子，用75%的乙醇浸泡消毒30s，迅速倒掉。再用4%的次氯酸鈉浸泡消毒15min，消毒后用無菌水洗滌7-8次，每次需充分洗滌，徹底去掉殘留的消毒劑。種子洗滌干凈后，將種子播在種子萌發培養基（1/2ms）。黑暗培養3-4天待種子發芽，發芽后移至25℃，光周期為16h/8h（光照/黑暗）的條件下培養。待長出子葉，子葉剛剛打開、未長出真葉之前的小苗用于轉化。（2）將保存于-80℃的含35s啟動子質粒的eha105農桿菌菌株在yeb液體培養基中恢復培養和擴大培養。其中培養農桿菌所用的yeb液體培養基配方為：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物1g/l，蔗糖5g/l，mgso4?7h2o0.5g/l，ph7.0。分裝后121℃高壓滅菌20min，待冷卻至室溫后加入50mg/l過濾滅菌的卡那霉素和利福平。（3）取步驟(1)未出真葉的無菌子葉，剪去葉尖及葉柄部，將剩余子葉剪成3mm×3mm的大小的方塊，置于無抗生素的ms固體培養基上，28℃預培養2天。（4）將步驟(2)擴搖后的菌液在5000r/min離心10min，沉淀用無菌水稀釋至od600=0.5-0.6作為侵染液。將預培養2天后的外植體在侵染液中侵染5min。置于無抗生素的ms固體培養基上共培養，在28℃暗室共培養2天。共培養培養基成分是ms+2mg/lzt+0.2mg/liaa+100mg/l特美汀+10mg/l潮霉素。（5）將共培養2天后的外植體從暗室取出，全部置于芽誘導培養基，在光下培養7天后轉入新的培養基中進行繼代培養。第一次繼代培養后，一般每隔2周進行下一次繼代培養，直至外植體發芽完全。芽誘導培養基成分是ms+2mg/lzt+0.2mg/liaa。（6）經過芽誘導期后，待外植體發芽芽長約為2-3cm時轉入芽伸長培養基中，培養3-4周。芽伸長培養基成分是ms+0.5mg/lzt+0.2mg/liaa+100mg/l特美汀+10mg/l潮霉素。（7）當芽伸長至4-5cm時，剪掉愈傷組織后將芽轉入到生根培養基中，培養3-4周。其中生根培養基成分是1/2ms+10mg/l潮霉素+2mg/liba。（8）將生根旺盛，生長到一定高度的小苗即時轉入土盆里。2、vvwrky13轉基因番茄的篩選和純合（1）提取土培階段正常生長的番茄葉片dna，用基因的特異引物進行pcr鑒定。結果如圖15所示。將檢測得到的陽性植株進行正常培養，并標記為t1代。檢測vvwrky13基因所用的pcr引物序列為：vvwrky13-fp1：5’-gctctagaatgtctactacttctcaagcc-3’；vvwrky13-rp1：5’-gctctagaatgtctactacttctcaagcc-3’。（2）為得到純合的轉基因株系，單株收獲t1代種子并播種，得到t2代轉基因番茄幼苗。（3）提取t2代轉基因番茄葉片dna，去除產生基因分離植株，收獲t2代種子。種植收獲的種子，得到t3代的轉基因番茄幼苗。（4）pcr檢測t3代轉基因番茄群體的分離情況。在t3代中不出現基因分離的株系即為純合的轉基因株系。檢測vvwrky13基因所用的pcr引物序列與(1)中的一致。（5）采用qrt-pcr技術檢測轉基因株系中vvwrky13基因的相對表達量。檢測結果如圖16所示。檢測vvwrky13基因表達量所用的qrt-pcr引物序列為：vvwrky13-fp：5’-ggttgccaacaatccct-3’；vvwrky13-rp：5’-gtcatctccaccgatacttc-3’；（6）收集純合的轉基因番茄株系的種子，用于后續實驗。3、vvwrky13過表達番茄株系乙烯生成量、三重反應和乙烯合成基因表達量的檢測（1）以野生型和vvwrky13異源過表達番茄植株果實為材料，分別選取大小均勻的果實3-4個，測定花后7天、轉色期和完熟期果實的乙烯釋放速率。結果顯示，在花后7天和轉色期乙烯在vvwrky13異源過表達株系中的釋放速率顯著高于野生型，而在完熟期差別不明顯，表明vvwrky13影響了番茄果實幼果的乙烯生成量。在乙烯合成途徑中，acc合成酶與acc氧化酶為該途徑的限速酶和關鍵酶。關鍵酶基因的表達決定著乙烯的生成量，以同時期的野生型和vvwrky13異源過表達番茄植株果實為材料，選取大小均勻的野生型和過表達植株的番茄果實3-4個，測定花后7d、轉色期和完熟期果實的乙烯合成途徑相關基因表達量。結果顯示，slacs1b、slaco1和slaco4在轉基因果實中比野生型的相對表達量高；其余則無較大差異。綜合分析表明，vvwrky13主要影響了番茄幼果發育過程中乙烯合成關鍵酶基因的表達，進而影響番茄乙烯的生成。檢測slacs1b、slaco1和slaco4基因表達量所用的qrt-pcr引物序列為：slacs1b-fp：5’-tgttctgaacctggttggt-3’；slacs1b-rp：5’-taaaatcatccaatcttcga-3’；slaco1-fp：5’-gtacccgatcttgacga-3’；slaco1-rp：5’-gaagtatgatgcctcctg-3’；slaco4-fp：5’-ctgtcatatttccagcacc-3’；slaco4-rp：5’-aagttgacagtagtctccacag-3’。（2）植物對乙烯的三重反應是植物所特有的反應，可以用于乙烯的生物鑒定。被乙烯處理后的植物幼苗呈現出上下胚軸伸長生長的抑制，上胚軸的橫向加粗，和頂點鉤的擴大。將野生型和vvwkry13過表達番茄種子，無菌處理之后，點種在含有10μmacc和10μmol/laoa的ms培養基上，28℃正常培養12h后，進行黑暗照培養7d，觀測其生長情況。結果如圖17-20所示：相對于野生型番茄，vvwrky13過表達番茄植株在沒有外源乙烯處理下，上下胚軸生長受抑制，表現出對乙烯的組成型三重反應。在含有10μm乙烯合成抑制劑aoa的培養基上，vvwkry13過表達番茄株系和野生型番茄的三重反應差異變小。以上結果在表型上證明了vvwkry13過表達促進了乙烯的過量生成。4、vvwrky13過表達番茄株系果實各生長期長短的檢測（1）觀察同時播種的野生型番茄和vvwrky13過表達的番茄株系果實的發育情況。結果顯示，vvwrky13過表達株系番茄果實從開花到轉色的時間大約提前2-3天，而轉色到完熟時間均為10天。表明vvwrky13縮短了番茄果實幼果的發育時間。（2）多聚半乳糖醛酸酶屬于果膠酶類，能降解細胞壁中的果膠使細胞壁分解，參與果實的軟化，其合成酶基因為slpg。檢測其合成基因slpg1和slpg3的表達量。結果如圖21和圖22所示，其在野生型和vvwrky13過表達番茄株系中的相對表達量并無差異。檢測slpg1和slpg3基因表達量所用的引物序列為：slpg1-fp：5’-tgaggaccaaatcggaatc-3’；slpg1-rp：5’-tgtcggactaagaaagaataacc-3’；slpg3-fp：5’-atacaacagttttcagcagttcaagt-3’；slpg3-rp：5’-ggttttccactttcccctactaa-3’。5、vvwrky13過表達番茄株系完熟果實品質的檢測（1）番茄紅素屬于類胡蘿卜素，是一種天然的食用色素，主要集中在各種果菜和水果的紅色果肉或組織當中，因其缺乏維生素原活性，對氧自由基具有粹滅作用，因此有預防癌癥、養顏美容、預防心腦血管疾病，也是衡量番茄果實品質的關鍵指標之一。以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系果實為材料，測定完熟期果實中番茄紅素的含量。結果如圖23所示，番茄紅素在野生型和vvwrky13過表達番茄植株果實中的含量沒有發生明顯變化。由此可知vvwrky13的過量表達并沒有對番茄果實中的番茄紅素含量產生影響。（2）番茄甜度是番茄品質性狀的重要組成部分，它主要取決于番茄果實中可溶性糖含量，因此可以用可溶性糖含量來評價番茄的品質。以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系的果實為材料，測定可溶性糖含量。結果如圖24所示vvwrky13轉基因株系果實與野生型果實的糖含量沒有發生明顯改變，表明vvwrky13的過表達沒有影響番茄果實中可溶性糖含量。（3）果實中的酸主要是指總有效有機酸根的陰離子，在番茄中主要可滴定酸為檸檬酸，在番茄的風味中發揮著重要作用。我們以完熟期野生型和vvwrky13過表達番茄株系的果實為材料檢測可滴定酸的含量。結果如圖25所示，二者并無明顯差異，說明vvwrky13不影響番茄中可滴定酸含量。綜上表明葡萄vvwrky13通過促進幼果膨大期內源乙烯的生成，縮短幼果膨大期，從而達到縮短果實發育期，促進果實早熟的效果，但對果實品質沒有負面影響。以上實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可以對前述實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。當前第1頁12