本發明涉及一種活性污泥中聚磷菌的分離鑒定方法，屬于污水生物處理
技術領域：
：，用于對污水生物處理系統中不同電子受體聚磷菌的分離鑒定。
背景技術：
：：生物脫氮除磷技術是目前應用最為廣泛的污水處理技術。傳統的除磷技術基于厭氧釋磷和好氧吸磷原理，吸磷過程是在好氧條件下，聚磷菌以分子氧作為電子受體，消耗體內的phb和外源基質進行好氧呼吸。傳統的脫氮和除磷技術對碳源的利用是分開的，脫氮過程在缺氧階段利用碳源進行反硝化，除磷過程在好氧階段利用碳源進行吸磷，為了保證脫氮和除磷過程碳源充足，傳統的脫氮除磷過程對進水中碳源濃度要求高。隨著對生物處理脫氮除磷的深入研究，人們發現了反硝化除磷現象。反硝化除磷過程可在一定程度上緩解傳統生物脫氮除磷工藝中脫氮和除磷對碳源的競爭，該過程可以節約50％的碳源消耗，減少50％的污泥產量，并可減少30％左右的曝氣量，對生物脫氮除磷工藝的發展具有重要的指導意義和應用價值，尤其對提高低c/n比城市污水的脫氮除磷效率有著重要意義。反硝化除磷過程在缺氧階段進行吸磷，有悖于傳統除磷在好氧階段以氧氣為電子受體的吸磷過程，所以確定反硝化除磷的聚磷菌在缺氧除磷過程中的電子受體，是強化污水生物處理反硝化除磷過程，優化污水處理工藝的一個關鍵問題。目前對反硝化除磷電子受體種類的研究大多通過測定混合液中電子受體濃度的變化過程，確定微生物對電子受體的代謝情況，研究過程基于宏觀的基質去除層面，沒有與微觀的基因水平相結合。穩定同位素核酸探針技術的發展為從基因水平研究反硝化除磷過程電子受體的種類提供了新的途徑。穩定同位素核酸探針技術dna-sip(stableisotopeprobing)，是將復雜環境中微生物物種組成及其生理功能耦合分析的有力工具。采用穩定同位素核酸探針技術原位培養不同菌群的微生物，標記目標基因，從而將標記與非標記的dna進行分離，并采用pcr技術，實時熒光定量pcr技術，高通量測序技術等分子生物學方法測定分離后的dna樣品，從群落水平分析不同微生物的生理生態機制。在以不同無機物為電子受體的反硝化除磷過程中，加入穩定同位素原位培養污泥混合液，定向培養不同電子受體的聚磷菌，分析以不同電子受體培養時優勢生長的聚磷菌菌群結構，將反硝化除磷過程的基質去除與菌群結構相結合，指導實際污水處理廠的調控運行，為污水生物反硝化除磷系統的長期穩定運行提供有力保障。本發明以13c-乙酸鈉作為實驗組碳源，12c-乙酸鈉作為對照組碳源，分別以氧氣、硝酸鹽和亞硝酸鹽為電子受體，定向培養聚磷菌，用分子生物學方法分析超高速離心分離純化后的dna樣品，從而分析鑒別利用不同種類電子受體的反硝化聚磷菌的菌群結構。本發明在技術上不同于現有技術，主要體現在以下兩方面：(1)菌群分離水平。現有技術對菌群的分離主要針對可分離純化的菌群，大多提供給目標菌群特定的生長基質，純化培養得到單一的微生物，分離過程提供給微生物的生長環境有別于實際的生長環境，而且分離水平局限于種群水平。本發明對微生物的分離基于dna水平。在不改變微生物生長環境的前提下，原位培養微生物，并提純培養得到的混合菌群的dna，進而因為穩定同位素的作用，目標微生物的dna有別于其它菌群的dna，分離得到目標dna，該過程在dna水平上將目標菌群從其它菌群中分離出來。這種基因水平上的分離過程，保證了微生物在實際生長環境中的特性，提高了分析的準確度。(2)dna分析方法。常規分子生物學對dna的測定是直接分析從環境樣品中純化得到的dna，分析對象為所有純化得到的環境微生物的dna樣品。本發明是將純化得到的環境dna樣品超高速離心分離后，利用分子生物學方法研究分離后不同浮力密度層的dna樣品。不同浮力密度層的dna樣品中穩定同位素含量不同，代表穩定同位素所標記的微生物菌群或數量不同。所以相對于現有技術，本發明將環境樣品dna有效分離后再進行分析，目標性更強，并且可以分析離心分層后不同種類dna樣品中特定菌群的特性，針對性地研究穩定同位素標記的dna樣品，為微生物種群的鑒定分離提供了新方法。故本發明利用13c-乙酸鈉作為實驗組碳源，12c-乙酸鈉作為對照組碳源，分別以氧氣、硝酸鹽和亞硝酸鹽為電子受體，厭氧釋磷，好氧或缺氧吸磷交替，原位培養活性污泥，利用超高速密度梯度離心分離純化得到dna，然后用分子生物學技術分別測定不同電子受體培養得到的聚磷菌菌群，分析活性污泥系統中不同種類電子受體對聚磷菌菌群結構的影響，未見相關研究報道。技術實現要素：本發明的目的在于提供一種可靠的活性污泥系統中不同電子受體聚磷菌的分離鑒定方法。分離鑒定不同種類的聚磷菌，利用聚磷菌對不同種類電子受體的需求，通過投加穩定同位素標記培養活性污泥，三種電子受體定向培養聚磷菌，采用超高速密度梯度離心技術，以13c-標記碳源和12c-標記碳源培養樣品作對照得到重浮力密度梯度層級的dna，采用普通pcr技術，實時定量pcr技術，高通量測序技術測定不同電子受體培養得到的dna樣品，分析污水處理系統中發揮反硝化除磷功能的微生物，對比得到不同聚磷菌吸磷過程所需的電子受體，指導實際污水處理廠對反硝化除磷過程的調控，優化污水生物處理反硝化除磷過程。本發明根據厭氧釋磷，好氧或缺氧吸磷的特點，加入13c-乙酸鈉作為實驗組，12c-乙酸鈉作為對照組，厭氧階段釋磷培養2小時，靜置去掉上清液，淘洗污泥，加入含有磷酸鹽的基質，分別以氧氣、硝酸鹽和亞硝酸鹽作為電子受體，好氧或缺氧吸磷培養3小時，共培養8個周期。冷凍干燥培養后的污泥，提取dna，采用穩定同位素核酸探針技術，超高速離心分離并純化dna，利用普通pcr技術，實時定量pcr技術和高通量測序技術測定分離后的dna樣品，分析不同電子受體時聚磷菌的菌群結構。本發明的技術方案：一種活性污泥系統中不同電子受體聚磷菌的分離鑒定方法，其特征在于:根據厭氧釋磷，好氧或缺氧吸磷的特點，將活性污泥分為6份，其中三份加入13c-乙酸鈉作為實驗組，另一份加入12c-乙酸鈉作為對照組。厭氧培養2小時候后，淘洗污泥。在不同標記物培養的三份污泥中分別加入磷酸鹽并曝氣、加入磷酸鹽和硝酸鈉、加入磷酸鹽和亞硝酸鈉，培養3小時，淘洗污泥進入下一個周期。共培養8個周期。提取6組培養后活性污泥微生物的基因組dna，采用穩定同位素核酸探針技術，超高速密度梯度離心分離并純化基因組dna，得到不同浮力密度的dna樣品。利用普通pcr技術、實時定量pcr技術和高通量測序技術測定分離后實驗組中5-9層級的dna樣品，比較以不同電子受體培養的聚磷菌的群落結構。上述分離鑒定過程如下：1按照微生物在污水生物處理系統中的生長環境，配制5種基質，分別為1號基質(含有13c-乙酸鈉)、2號基質(含有12c-乙酸鈉)、3號基質(含有磷酸鹽)、4號基質(含有磷酸鹽和硝酸鹽)和5號基質(含有磷酸鹽和亞硝酸鹽)。2取生物處理反應器中的污泥混合液，用蒸餾水淘洗離心三次，將離心后的污泥定容至淘洗前體積的一半。3取6個150ml的錐形瓶，標號1-6，分別為以13c-乙酸鈉為碳源，氧氣為電子受體(1號)；以13c-乙酸鈉為碳源，硝酸鹽為電子受體(2號)；以13c-乙酸鈉為碳源，亞硝酸鹽為電子受體(3號)；以12c-乙酸鈉為碳源，氧氣為電子受體(4號)；以12c-乙酸鈉為碳源，硝酸鹽為電子受體(5號)；以12c-乙酸鈉為碳源，亞硝酸鹽為電子受體(6號)。4在150ml的錐形瓶中加入50ml淘洗并定容的污泥。5在1-3號錐形瓶中加入50ml1號基質，4-6號中加入50ml2號基質，保證錐形瓶中反應溫度與生物處理反應器中一致，攪拌反應2小時。62小時候后靜置去掉錐形瓶中的上清液，淘洗污泥，轉移污泥至對應錐形瓶，并將混合液定容至50ml。7在1號和4號錐形瓶中加入3號基質，在2號和5號錐形瓶中加入4號基質，在3號和6號錐形瓶中加入5號基質，并對1號和4號錐形瓶曝氣，反應3小時。8反應結束后，靜置錐形瓶，去掉上清液，淘洗污泥，轉入對應錐形瓶，并定容至50ml。9按5-8步驟，每周期厭氧反應2小時，好氧或缺氧反應3小時，共進行8個周期。10反應后的污泥冷凍干燥，并提取dna。11采用穩定同位素核酸探針技術，超高速密度梯度離心分離并純化dna，得到不同浮力密度的dna樣品。12將含13c-乙酸鈉的三組dna樣品與含12c-乙酸鈉的三組dna樣品作比較，得到重浮力密度層級的dna，采用pcr技術、qpcr技術、高通量測序技術分析不同浮力密度層級中的聚磷菌，比較以不同電子受體培養的聚磷菌的群落結構。本發明的有益效果污水生物處理系統中反硝化除磷過程的實現，對目前低c/n比生活污水的處理意義重大。反硝化除磷過程不同于傳統的生物除磷過程，二者發生反應的環境中電子受體的種類與濃度有很大區別，所以探討反硝化除磷菌在缺氧區的電子受體種類，是指導實際污水處理廠調控運行反硝化除磷過程的關鍵。本發明提供了一種在基因水平上分離鑒別以不同物質為電子受體聚磷菌的方法，在微生物學領域將脫氮與除磷過程相結合，可用于脫氮除磷菌群結構、代謝機制、生理特性的研究，也可作為實際污水處理廠強化反硝化除磷過程的監控手段，實用性較強。本發明將具有反硝化除磷現象的反應器中的污泥淘洗后，與相似于反應器中的基質混合，以13c-乙酸鈉為實驗組，12c-乙酸鈉為對照組，厭氧培養2小時，好氧或缺氧培養3小時，共培養8個周期。提純培養后污泥的dna，采用穩定同位素核酸探針技術，超高速離心分離純化dna樣品，采用pcr技術，qpcr技術，高通量測序技術測定不同密度層級的dna樣品，將實驗組與對照組相比較，得到重密度層級的目標dna，分析不同電子受體時聚磷菌的菌群結構。本發明將環境樣品中純化得到的dna分離后再鑒定，豐富了研究菌群結構的分子生物學方法；將反硝化除磷過程的研究水平從常規的基質代謝水平提高到了基因水平，有利于深入研究該過程的微生物學機制。本發明的創新點(1)本發明以不同種類電子受體為培養基質，原位培養得到聚磷菌的dna，培養時間短，不因培養馴化改變污泥混合液中微生物的菌群結構，并通過超高速離心技術分離純化得到以不同物質為電子受體的聚磷菌，研究實際污水處理系統中脫氮除磷菌群的電子受體，指導實際污水處理系統的運營調控。(2)本發明利用穩定同位素標記污水處理系統中不同電子受體聚磷菌的dna，分離純化得到不同聚磷菌的dna，在基因水平上分離以氧氣、硝酸鹽和亞硝酸鹽為電子受體的聚磷菌，確定實際污水處理反硝化除磷過程中所需要的電子受體，以及發揮反硝化除磷功能的主要菌群，為研究反硝化除磷所需的電子受體種類提供技術支持。具體實施方式1按照微生物在污水生物處理系統中的生長環境，配制5種基質，分別為1號基質(含有13c-乙酸鈉590mg/l)、2號基質(含有12c-乙酸鈉590mg/l)、3號基質(含有kh2po4272mg/l)、4號基質(含有kh2po4272mg/l和nano3366mg/l)和5號基質(含kh2po4272mg/l和nano2198mg/l)。2取生物處理反應器中的污泥混合液，用蒸餾水淘洗離心三次，將離心后的污泥定容至淘洗前體積的一半。3取6個150ml的錐形瓶，標號1-6，分別為以13c-乙酸鈉為碳源，氧氣為電子受體(1號)；以13c-乙酸鈉為碳源，硝酸鹽為電子受體(2號)；以13c-乙酸鈉為碳源，亞硝酸鹽為電子受體(3號)；以12c-乙酸鈉為碳源，氧氣為電子受體(4號)；以12c-乙酸鈉為碳源，硝酸鹽為電子受體(5號)；以12c-乙酸鈉為碳源，亞硝酸鹽為電子受體(6號)。4在150ml的錐形瓶中加入50ml淘洗并定容的污泥。5在1-3號錐形瓶中加入50ml1號基質，4-6號中加入50ml2號基質，保證錐形瓶中反應溫度與生物處理反應器中一致，攪拌反應2小時。62小時候后靜置去掉錐形瓶中的上清液，淘洗污泥，轉移污泥至對應錐形瓶，并將混合液定容至50ml。7在1號和4號錐形瓶中加入3號基質，在2號和5號錐形瓶中加入4號基質，在3號和6號錐形瓶中加入5號基質，并對1號和4號錐形瓶曝氣,保證溶解氧濃度為1.5mg/l，反應3小時。8反應結束后，靜置錐形瓶，去掉上清液，淘洗污泥，轉入對應錐形瓶，并定容至50ml。9按5-8步驟，每周期厭氧反應2小時，好氧或缺氧反應3小時，共進行8個周期。10反應后的污泥冷凍干燥，并提取dna。11采用穩定同位素核酸探針技術，超高速密度梯度離心分離并純化dna，得到不同浮力密度的dna樣品。12將含13c-乙酸鈉的三組dna樣品與含12c-乙酸鈉的三組dna樣品作比較，得到重浮力密度層級的dna，采用pcr技術、qpcr技術、高通量測序技術分析不同浮力密度層級中的聚磷菌，比較以不同電子受體培養的聚磷菌的群落結構。當前第1頁12當前第1頁12