檢測MPL基因全外顯子的試劑盒和方法與流程

本發明屬醫學生物技術領域，特別涉及檢測mpl基因全外顯子突變的試劑盒、引物和方法

背景技術：

無巨核細胞性血小板減少可分為先天性和獲得性兩種，先天性無巨核細胞性血小板減少(camt)是新生兒的一種少見病，伴有多種先天性異常，畸形及再生障礙性貧血。新生兒期發病，皮膚可見紫癜、瘀斑。50％有先天性畸形，小頭、發育遲緩、小腦及腦萎縮、先天性心臟病(房室間隔缺損、動脈導管未閉、法洛四聯癥、主動脈縮窄)，其他如兔唇或高弓形腭、腎、眼、足異常。人類c-mpl基因(mpl)在巨核細胞和血小板的生長發育及造血干細胞的自我更新中都起到重要作用，然而，在造血系統疾病中，檢測到很多的mpl基因突變，這些突變改變了正常的調控機制，并導致自主性激活或信號傳導缺陷。自從1999年，在先天性無巨核細胞性血小板減少(camt)患者中檢測到第一例mpl突變，在原發性血小板增多癥(ht)、骨髓增生性腫瘤(mpns)，伴環形鐵粒幼細胞與血小板顯著相關的難治性貧血((rars-t))，急性髓系白血病(aml)都已檢測到mpl基因突變。

mpl(myeloproliferativeleukaemiavirusoncogene)位于人染色體lp34，包括12個外顯子，并編碼人血小板生成素受體。與camt疾病相關的mpl基因突變是常染色體，隱形基因突變，在疾病的發生中起到決定性作用。根據ballmaier等人收集的數據顯示，61例camt患者進行mpl基因突變檢測，56例檢測出mpl基因突變，突變率高達91.8％。據文獻報道，在camt患者中發現了41種不同的mpl基因突變，包括無義突變、缺失突變和移碼突變，錯義突變和剪接位點突變等。

多種基因突變檢測技術包括蛋白截斷試驗(ptt)、單鏈構象多態性(sscp)、異源雙鏈分析(ha)、變性梯度凝膠電泳(dgge)和溫度梯度凝膠電泳(tgge)等方法。但所有這些方法均有一定的局限性,從而限制了基因突變的檢出率。目前常用的基因突變檢測的方法是基因測序和熒光定量pcr等。由于mpl容量大、突變類型多、突變位點散在分布，故而阻止了對mpl基因突變的深入研究，熒光定量pcr法并不適用。

技術實現要素：

本發明提供檢測mpl基因全外顯子的引物，采用sanger測序法，可用于快速檢測mpl基因全外顯子突變的情況，用于mpl的基因診斷。

本發明的目的在于提供檢測mpl基因全外顯子的引物，包括：擴增覆蓋檢測mpl基因全外顯子突變的8對正、反向引物；其堿基序列分別是：

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進一步地，所述8對正、反向引物的使用濃度比為：

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進一步的，還包括測序引物m12-f和m12-r：

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本發明的目的還在于提供一種檢測mpl基因全外顯子的方法，其包括如下步驟：

(1)提取樣品dna；

(2)利用8對擴增引物mpl-1-2f與mpl-1-2r；mpl-3f與mpl-3r；mpl-4f與mpl-4r；mpl-5-6f與mpl-5-6r；mpl-7-8f與mpl-7-8r；mpl-9f與mpl-9r；mpl-10f與mpl-10r；mpl-11-12f與mpl-11-12r，對(1)中的dna進行擴增，獲得覆蓋檢測mpl基因全外顯子序列的擴增產物；

(3)利用1對測序引物m13-f與m13-r對(2)中的擴增產物進行正向和反向測序，獲得所述擴增產物的基因序列；

(4)將(3)中的基因序列與野生型mpl基因序列進行比較，確定突變位點是否存在；其中所述引物序列為：

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進一步的，還包括測序引物m12-f和m12-r：

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本發明的目的還在于提供一種檢測mpl基因全外顯子的試劑盒，包括樣品dna抽提試劑、無水乙醇、檢測體系pcr反應液、測序體系反應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中檢測體系pcr反應液包括8對擴增引物mpl-1-2f與mpl-1-2r；mpl-3f與mpl-3r；mpl-4f與mpl-4r；mpl-5-6f與mpl-5-6r；mpl-7-8f與mpl-7-8r；mpl-9f與mpl-9r；mpl-10f與mpl-10r；mpl-11-12f與mpl-11-12r，測序體系包括1對測序引物m13-f與m13-r，包括：

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進一步地，所述檢測體系pcr反應液還包括2×pcrbuffer、dntps、kodfxdnapolymerase。

進一步地，所述測序體系還包括測序純化液、edta、無水乙醇、75％乙醇、hidi和bigdyeterminatorv3.1。

進一步地，所述測序純化液包括蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶i。

本發明設計了擴增覆蓋檢測mpl基因全外顯子序列的8對正、反向引物，并創新性的在pcr擴增的上游引物5’端和下游引物5’端分別加了一段長18bp的m13-f引物序列和長16bp的m13-r引物序列。這樣擴增產物兩端都會帶上所引入的m13-f及m13-r引物序列，隨后進行測序反應的時候，所有的擴增產物可以使用統一的m13-f和m13-r引物進行正反向測序。因為mpl基因有12個外顯子，每個樣本檢測需要擴增12個pcr產物，如果每個產物使用各自的測序引物進行測序，操作將會十分繁瑣，也極易引起污染。而本試劑盒這樣的設計有效的避免了這一問題，大大簡化了測序反應的操作步驟，使整個過程非常便捷。同時通過調整正反向引物的濃度、退火溫度等反應條件，可使擴增效率達到最佳。

有益效果：利用本發明所述擴增引物和測序引物，可以擴展整個全外顯子序列，通過sanger測序法對測序結果的分析，可以很直觀了解mpl基因全外顯子的基因突變情況，并不受mpl突變多樣化以及沒有突變熱點的影響，可覆蓋待檢測的所有突變位點；具有很高的特異性及準確性；采用pcr方法擴增目的基因并測序檢測其基因多態性，具有靈敏度高，操作簡單、成本低等優點。

附圖說明

圖1樣品1的檢測結果圖。

圖2樣品2的檢測結果圖。

圖3樣品3的檢測結果圖。

圖4樣品4的檢測結果圖。

圖5樣品5的檢測結果圖。

圖6樣品6的檢測結果圖。

圖7樣品7的檢測結果圖。

圖8樣品8的檢測結果圖。

具體實施方式

下面結合具體實施例和附圖，進一步闡述本發明。應當注意的是，實施例中未說明的常規條件和方法，通常按照所屬領域實驗人員常規采用方法：譬如，奧斯柏和金斯頓主編的《精編分子生物學實驗指南》第四版，或者按照制造廠商所建議的步驟和條件。

實施例1

檢測檢測mpl基因全外顯子的引物，包括：擴增覆蓋檢測mpl基因全外顯子的8對正、反向引物；所述擴展引物的堿基序列為：

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所述引物還包括1對測序引物，其堿基序列為

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在檢測中，先利用上述8對正、反向擴增引物對覆蓋檢測mpl基因全外顯子的dna片段進行擴增，獲得擴增產物，然后利用上述1對測序引物對擴增產物進行測序，獲得擴增產物的基因序列。

在引物設計上，所設計的每對引物都位于所要擴增的外顯子序列兩側，即擴增區域包括了該外顯子的全部序列。因為mpl的突變位點很多，突變類型不定。因此本發明所述引物既能將所述全部外顯子序列都擴增出來，也保證無論外顯子的何處位置發生突變，都不會出現漏檢的情況。因為第1、2、5、6、7、8、11、12號外顯子序列都較短，因此本發明在檢測第1和2號外顯子,第5和6號外顯子，第7和8號外顯子，第11和12號外顯子時，分別采用一對對擴增引物。

檢測檢測mpl基因全外顯子的試劑盒，包括：組織dna抽提試劑盒(例如使用天根生物的提取試劑盒)；無水乙醇；檢測體系pcr反應液、測序體系反應液、陽性對照品、陰性對照品和空白對照品，其中，

檢測體系pcr反應液包括：2×pcrbuffer；2mmdntps；kodfxdnapolymerase(1u/μl)；檢測目的基因用的8對上、下游引物mpl-1-2f(10μm)與mpl-1-2r(10μm)；mpl-3f(10μm)與mpl-3r(10μm)；mpl-4f(10μm)與mpl-4r(10μm)；mpl-5-6f(10μm)與mpl-5-6r(10μm)；mpl-7-8f(10μm)與mpl-7-8r(10μm)；mpl-9f(10μm)與mpl-9r(10μm)；mpl-10f(10μm)與mpl-10r(10μm)，mpl-11-12f(10μm)與mpl-11-12r(10μm).

測序體系包括：測序純化液、edta(125mmol)、無水乙醇、75％乙醇、hidi(高度去離子甲酰胺)、測序引物：m13-f(3.2μm)與m13-r(3.2μm)，以及bigdyeterminatorv3.1(購買自美國appliedbiosystems公司)，其中測序純化液包括蝦堿性磷酸酶(sap)0.6u和核酸外切酶i(exoni)1.2u。

檢測體系pcr反應液配制如下：

其中，mpl-1-2f與mpl-1-2r；mpl-3f與mpl-3r；mpl-4f與mpl-4r；mpl-5-6f與mpl-5-6r；mpl-7-8f與mpl-7-8r；mpl-9f與mpl-9r；mpl-10f與mpl-10r；mpl-11-12f與mpl-11-12r的堿基序列為：

陽性對照品：含有mpl序列的溶液。

陰性對照品：無mpl序列的溶液。

空白對照品：2μl生理鹽水或不加任何物質。

實施例2

血液dna抽提試劑盒(天根生物)的操作流程：

(1)抽提血液中的基因組dna:

1)抽取500ul血液加入1000ul紅細胞裂解液，顛倒混勻，室溫放置5分鐘，期間再顛倒混勻幾次。3000rpm離心5min，吸去上清，留下白細胞沉淀，加200ul緩沖液ga，振蕩至徹底混勻。

2)加入20μl蛋白酶k溶液，混勻。

3)加入200μl緩沖液gb，充分顛倒混勻，70℃放置10分鐘，溶液應變清亮，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

4)加入200μl無水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時可能會出現絮狀沉淀，簡短離心以去除管蓋內壁的水珠。

5)將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個吸附柱cb3中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放回收集管中。

6)向吸附柱cb3中加入500μl緩沖液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。

7)向吸附柱cb3中加入700μl漂洗液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12,000rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。

8)向吸附柱cb3中加入500μl漂洗液pw，12,000rpm(13,400×g)離心30秒，倒掉廢液。

9)將吸附柱cb3放回收集管中，12,000rpm(13,400×g)離心2分鐘，倒掉廢液。將吸附柱cb3置于室溫放置數分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。

10)將吸附柱cb3轉入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液te，室溫放置2-5分鐘，12,000rpm(13,400×g)離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

(2)試劑配置：按檢測人份數配置檢測體系pcr反應液各xμl，每人份18μl分裝：

x＝18μl反應液×(n份標本+1份陽性對照+1份陰性對照+1份空白對照)

n為檢測標本數。

(3)加樣：加入3個檢測體系pcr反應液中各2μldna；陽性對照和陰性對照直接加2μl陽性對照品和陰性對照品；空白對照加2μl生理鹽水或不加任何物質。

(4)擴增：檢測在常規pcr儀上進行，可用儀器包括abiveriti(美國appliedbiosystems公司)等。反應條件如下：

(5)sanger測序：

取9μlpcr產物與2μl純化體系。按照以下程序進行純化：

將1μl純化產物分別與測序引物：m13-f(3.2μm)與m13-r(3.2μm)，按照如下體系進行混合：

測序反應程序：

沉淀環節：

向完成測序反應的產物中加入2μl125mmol的edta，靜置5min；加入15ml無水乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心30min；倒置離心15sec，加入50ml70％乙醇，漩渦混勻；3700rpm離心15min；倒置離心15sec，置于95℃金屬浴上；加入10μlhidi后進行變性試驗。變性程序：

變性程序結束后，上測序儀(abi3730)測序。

(7)結果判斷：將測序結果與野生型參考序列(genebankno.:ng_007525.1)進行比對，根據實際突變情況對結果進行報告。

實施例3

取臨床camt患者樣本8份，檢測該8份樣本是否存在mpl突變。按實施例2所述方法提取基因組、配制試劑并檢測。每份樣品加入檢測體系pcr反應液中2μl。同時做陽性，陰性，空白對照各一份。用普通pcr儀檢測，時間為160分鐘。

樣品1的第1-2號全外顯子序列的部分正向測序結果如圖1所示，為野生型，未檢測出mpl突變。

樣品2的第3號全外顯子序列的部分正向測序結果如圖1所示，為野生型，未檢測出mpl突變。

樣品3的第4號全外顯子序列的部分正向測序結果如圖1所示，為野生型，未檢測出mpl突變。

樣品4的第5-6號全外顯子序列的部分正向測序結果如圖1所示，為野生型，未檢測出mpl突變。

樣品5的第7-8號全外顯子序列的部分正向測序結果如圖1所示，為野生型，未檢測出mpl突變。

樣品6的第9號全外顯子序列的部分正向測序結果如圖1所示，為野生型，未檢測出mpl突變。

樣品7的第10號全外顯子序列的部分正向測序結果如圖1所示，為野生型，未檢測出mpl突變。

樣品8的第11-12號全外顯子序列的部分正向測序結果如圖1所示，為野生型，未檢測出mpl突變。

從檢測結果可以看出，本發明所述引物已經把外顯子序列包括在內了，能夠擴展出mpl基因全外顯子，并且測序結果完全準確。本發明所述引物可以準確的擴展出mpl基因全外顯子序列，無論是野生型還是突變型。

sequencelisting

<110>武漢艾迪康醫學檢驗所有限公司

<120>檢測mpl基因全外顯子的試劑盒和方法

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