沉默內皮細胞生長因子受體2表達的siRNA及其用途的制作方法

本發明屬于分子生物學與生物醫藥技術領域，具體涉及一種sirna雙鏈的分子結構及其在醫藥制備上的用途。

背景技術：

在基因dna雙鏈中，轉錄時作為mrna（信使rna，攜帶遺傳信息，在蛋白質合成時充當模板的rna）合成模板的那條單鏈叫做模板鏈或反義鏈，而轉錄時不能作為mrna合成模板的那條單鏈叫有義鏈或正義鏈。

核苷酸是由堿基、核糖（或脫氧核糖）和磷酸構成的。核糖（或脫氧核糖）是五碳糖，根據國際命名法，將連接堿基的碳命名為1號碳，以下順次命名直至5號碳。其中，3號碳上連接的為羥基，5號碳上連接的為磷酸基團。相鄰核苷酸通過磷酸二酯鍵連接，就是前一個核苷酸的3號碳上的羥基與下一個核苷酸5號碳上的磷酸脫水形成酯鍵。這樣順次連接形成一條dna或rna鏈。這條鏈的兩個端點的兩個核苷酸，其中一個的5號碳上的磷酸未成鍵，這一端稱5'端；另一個的3號碳上的羥基未成鍵，這一端稱3‘端。正義鏈中的5′端稱之為上游；反義鏈中的3′’端稱之為上游，5′端稱之為下游。

nature,1998,391(6669):806-11介紹了一種rnai效應（rnainterference，rna干擾)，它是哺乳動物細胞漿內存在的一種自然現象。rnai效應的分子為含21-23個核苷的雙鏈小干擾rna（sirna）分子，在多蛋白核苷酶復合體(rna-inducedsilencingcomplex,risc)介導下,靶向與其反義鏈序列互補的mrna，形成新的較長的雙鏈rna，然后被一種蛋白降解為新的sirna片段，靶向的mrna即被降解或沉默（silence）。一方面，rnai效應技術可用作基因表達沉默的強有力工具，通過基因沉默技術研究疾病發生機理、鑒定疾病治療靶點。另一方面，natrevgenet，2007，8(3):173-84介紹了sirna分子本身也可直接作為藥物分子用于人體治療疾病。治療用sirna分子的長度必須為21-23個核苷，（過大數量的核苷酸有可能引起炎癥反應和全身范圍內的蛋白質表達關閉等副作用），其結構穩定，無須像反義核苷酸那樣進行廣泛的化學修飾以提高其半衰期，并能在低于反義核苷酸幾個數量級的濃度下，把靶基因降至極低的水平甚至完全“敲除”，從而產生缺失突變表型。

rnai效應的關鍵取決于靶基因序列的選擇，任一錯誤均會導致rnai效應的喪失，這種高度特異性使其對點突變、序列插入和缺失的選擇性基因沉默有很重要的藥理作用，對治療某些因基因突變或過度表達引起的疾病具有良好的應用前景。

人體血管內皮細胞生長因子受體2（vegfr-2），又名激酶插入區受體(kinasedo2mainreceptor,kdr),是一個分子量為230kd的跨膜糖蛋白，由一個胞外結構域，一個跨膜結構域和一個胞內酪氨酸激酶結構域組成。其與vegf的信號通路在血管的形成過程中起重要作用，參與由vegf介導的血管通透性改變。腫瘤中的實體瘤，其發生發展與腫瘤血管生成有著密切的聯系。

申請號為2012102135023的發明公開了一種抑制bcl2基因表達的sirna雙鏈及其應用，sirna雙鏈具有如下的核苷酸序列：

正義鏈：5′-gccuugacauugauggaautt-3′；

反義鏈：3′-ttcggaacuuuguaacuaccuua-5′。

該發明依據一種在線設計軟件分析，采用在絕大多數惡性腫瘤細胞中高表達的抵抗凋亡的bcl2為靶點，設計靶向bcl2的sirna序列，在一些肺癌和宮頸癌細胞內有效抑制bcl2基因的表達；該發明是針對淋巴細胞的處理，對其它一些腫瘤細胞的影響有限，不具有針對腫瘤治療的普適性意義。

申請號為2015101721384的發明公開了vegfr2基因val297ile位點的應用方法，具體是用于制備檢測帕金森患者對于采用左旋多巴治療時的藥物敏感性的試劑盒。該試劑盒中含有檢測vegfr2基因val297ile位點的探針和引物，所述探針和引物能與vegfr2基因val297ile位點前后的基因序列特異性結合并擴增出包含vegfr2基因val297ile位點的基因序列。該發明只能檢測vegfr2基因的有關數據，如何抑制其生長以及能帶來的有益作用沒有任何介紹。

技術實現要素：

發明目的：

提供一種能夠在mrna水平上高效而穩定地抑制人源基因vegfr2（人體血管內皮細胞生長因子受體2）表達、并進而可抑制腫瘤細胞生長的高效sirna雙鏈。

技術方案：

為達上述目的，本發明采用sirna設計法則并結合計算機輔助設計軟件獲得抑制人體血管中內皮細胞生長因子受體2（vegfr2）基因表達的幾種具有不同核苷酸序列的sirna雙鏈，并通過實驗篩選一條高效沉默vegfr2表達的sirna雙鏈，所述sirna靶基因、正義鏈和反義鏈中含有的核苷酸序列分別如下：

靶基因：ggtaaagattgatgaagaa；

正義鏈：5'-gguaaagauugaugaagaadn-3'；

反義鏈：3'-ndccauuucuaacuacuucuu-5'；

正義鏈的5'端之后的19個核苷酸序列與反義鏈的5'端之前的19個核苷酸序列互補。

其中，n為a、g、c、u、t、da、dc、dg、dt中的一種,d為a、g、u、t、da、dg、dt中的一種。這19個核苷酸序列的排列順序，使得其沉默人源基因vegfr2的表達效果比已知的其它核苷酸序列的sirna靶基因效果更低，抑制作用明顯，尤其采用的核苷酸d指代的a或g或t/u，而非與人源基因vegfr2較親善或抑制不明顯的胞嘧啶c，對翻譯多肽鏈以及合成蛋白質的過程抑制調節更有效。

在此基礎上，經過多種試驗和分析，優選dn為兩個游離且連續的脫氧核苷酸dtdt(dt:胸腺嘧啶脫氧核苷酸)，這樣的sirna沉默人源基因vegfr2的表達效果，在已知的實驗中抑制作用最顯著。此時，

正義鏈：5'-gguaaagauugaugaagaadtdt-3'；

反義鏈：3'-dtdtccauuucuaacuacuucuu-5'。

由于腫瘤特有的微環境刺激，使人體腫瘤中vegfr2的表達水平較正常組織中明顯增加。因此，通過阻斷vegf/vegfr2信號通路來抑制腫瘤內部新生血管的生成，是一種有效的抗腫瘤方案。sirna是rnai的效應分子，能高效特異性地抑制靶基因的表達，通過本發明上述設計的抗vegfr2基因的sirna分子來沉默vegfr2的表達，能夠阻斷vegf／vegfr2信號通路，尤其在治療實體瘤中具有重要的應用價值。

本發明的另一目的：是將上述抑制vegfr2基因表達的sirna雙鏈，用于設計和制備因人體人體病變組織中血管內皮細胞生長因子受體2過度表達、導致血管內皮細胞過度生長而引起的相關疾病的藥物（尤其是抑制腫瘤內血管生成的抗腫瘤藥物）。

所述的相關腫瘤疾病為肺癌、肝癌、食管癌、宮頸癌、結直腸癌、胰腺癌、腎癌膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、頭頸癌、腦瘤、膠質細胞瘤中的任一種或多種。當然，該藥物也可以用于預防或治療其它血管增生性疾病如血管瘤、老年眼睛黃斑病變等疾病。

本發明的試驗方法簡介如下：

（一）sirna的設計和合成：利用設計軟件設計并分別合成了兩個對照序列。

其中有一個序列（編號：sirna1）如下：

靶序列：ggtaaagattgatgaagaatt(nm_002253.2:3626-3646)

正義鏈：5'-gguaaagauugaugaagaadtdt-3'

反義鏈：3'-dtdtccauuucuaacuacuucuu-5'

另一個對比序列（編號：sirna2）如下：

靶序列：gctgacatgtacggtctat(nm_002253.2:1628-1646)

正義鏈：5'-gcugacauguacggucuaudtdt-3’

反義鏈：3'-dtdtcgacuguacaugccagaua-5'

（二）采用rt-qpcr檢測sirna1和sirna2在huvecs（人臍靜脈內皮細胞）中對vegfr2基因的沉默效率：

1.將gapdh（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）基因作為參照基因，其合成的序列（編號為controlsirna）如下：

靶序列：aacggatttggtcgtattgg

正義鏈：5’-gatctcgctcctggaagatg-3’

反義鏈：3’-aacggatttggtcgtattgg-5’

2.將sirna1、sirna2、gapdh細胞用高糖dmem培養基稀釋傳代，培養基含5-15％牛血清，分別制備lipo2000/sirna1組、lipo2000/sirna2組、lipo2000/controlsirna組。另外，再采用無血清培養基給藥，改組為空白對照組（untreated）。將它們分別經過轉染實驗，得到如圖1所示的四組樣本的mrna表達水平分析圖。

3.熒光定量rt-pcr檢測vegfr2和gapdh基因標本，采用蛋白質印跡法，得到如圖2所示的轉染sirna后細胞中蛋白的表達效果。

（三）接著，采用western-blot法檢測vegfr2蛋白的表達，將它們分別經過細胞總rna的提取、逆轉錄合成cdna，進行pcr檢測沉默效率。采用one-wayanova方法比較轉染各組細胞vegfr2的mrna和蛋白表達水平是否有顯著差異，得到如圖3所示的蛋白的表達水平分析圖。

（四）實驗結果分析：

實驗所得的數據繪制成3幅附圖，附圖顯示：四種不同的標本的mrna和蛋白表達水平是否有顯著差異，lipo2000/sirna1組、lipo2000/sirna2組相比lipo2000/controlsirna組（用gapdh制備的組）和空白對照組（untreated），表達水平明顯降低；而且，lipo2000/sirna1組比lipo2000/sirna2組降低更多，即lipo2000/sirna1沉默表達的效果最為顯著。

有益效果：

本發明的sirna雙鏈能夠高效抑制人源基因vegfr2的表達，從而抑制人體病變組織中血管的生成或生長，阻止多種腫瘤等病變組織的生長，能夠預防和治療多種癌癥。本發明設計合成的抗人vegfr2表達的sirna分子，研究了未經化學修飾的svegfr2基因的沉默效果，為后續體內應用不同的sirna分子，所需要的穩定性和靶向性修飾提供了理論依據。另外，其它疾病如由于眼睛脈絡膜內血管增生而至的老年黃斑病變，利用沉默vegf2基因的sirna分子，具有良好的治療效果。

附圖說明

圖1是采用rt-qpcr檢測中轉染sirna后,人臍靜脈內皮細胞株（huvecs）中vegfr2的mrna表達水平分析圖。

圖2是采用蛋白質印跡法（westernblotting）分析轉染sirna后細胞中vegfr2蛋白的表達效果圖。

其中含有：lipo2000/sirna1組；lipo2000/sirna2組；lipo2000/controlsirna組；空白對照組。

圖3是圖2所述的蛋白表達水平分析圖。

具體實施方式

實施例1：

如圖1、3所示，四組或者三組對照樣本顯示的沉默人血管內皮細胞生長因子受體2的表達水平差異表明，本發明所述的sirna序列的沉默效果最佳。尤其是：

靶基因為ggtaaagattgatgaagaa；正義鏈為5'-gguaaagauugaugaagaadtdt-3'；

反義鏈為3'-dtdtccauuucuaacuacuucuu-5'；此時，沉默人血管內皮細胞生長因子受體2表達的sirna序列表達更大的抑制效果，可以用于設計和制備抑制人體腫瘤中血管內皮細胞生長的抗腫瘤藥物。

如圖2所示的蛋白質印跡，進一步驗證了本發明的樣本在人血管內皮細胞生長因子受體2（vegfr2）中的印跡很淡，抑制腫瘤內部新生血管生成的效果很明顯優于針對gapdh的效果。

sequencelisting

<110>武漢澤智生物醫藥有限公司

<120>沉默內皮細胞生長因子受體2表達的sirna及其用途

<130>14

<150>2016106513486

<151>2016-08-11

<160>14

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ggtaaagattgatgaagaa19

<210>2

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(21)..(21)

<223>nisa,c,g,toru

<400>2

gguaaagauugaugaagaadn21

<210>3

<211>21

<212>rna

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>nisa,c,g,oru

<400>3

ndccauuucuaacuacuucuu21

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

gguaaagauugaugaagaadtdt23

<210>5

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

dtdtccauuucuaacuacuucuu23

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ggtaaagattgatgaagaatt21

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>7

gguaaagauugaugaagaadtdt23

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>8

dtdtccauuucuaacuacuucuu23

<210>9

<211>19

<212>dna

<213>人工序列

<400>9

gctgacatgtacggtctat19

<210>10

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>10

gcugacauguacggucuaudtdt23

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>人工序列

<400>11

dtdtcgacuguacaugccagaua23

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>12

aacggatttggtcgtattgg20

<210>13

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>13

gatctcgctcctggaagatg20

<210>14

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<400>14

aacggatttggtcgtattgg20