一種番鴨細小病毒感染性克隆的構建及拯救方法與流程

本發明屬于生物技術領域，涉及一種mdpv感染性質粒克隆的構建以及轉染番鴨胚拯救病毒的方法。

背景技術：

番鴨細小病毒(muscovyduckparvovirus，mdpv)主要感染3周齡內雛番鴨，感染番鴨表現以腹瀉、軟腳和喘氣為主要特征的臨床癥狀，俗稱番鴨“三周病”。發病率可達27％～62％，死亡率在22％～43％之間，病愈鴨大部分成為僵鴨。該病是番鴨養殖業上的重要疫病之一，國內雛番鴨細小病毒病的報道最早始于1985年，法國1990年報道該疫病的存在。

番鴨細小病毒屬于細小病毒科依賴細小病毒屬，其基因組為一條線性的單股dna,以相等的極性存在病毒粒子中。兩側翼為457個堿基組成的末端倒置重復序列(itr)，itr與病毒基因組的復制、剪切、拯救等特性密切相關。基因組左側閱讀框編碼病毒的非結構蛋白rep，依據不同的剪接方式可生成為rep1等4種不同的rep蛋白，rep蛋白通過與itr結合參與基因組dna的復制以及調控下游p41啟動子。基因組右側閱讀框編碼衣殼蛋白cap，依據起始密碼子不同和翻譯后的蛋白裂解可分別生成vp1、vp2、vp3三個蛋白，三個蛋白氨基端不同、羧基端一致，以大約1:1:8的比例共同組成病毒的衣殼。

自上世紀80年代后期開始，由番鴨細小病毒引起的番鴨“三周病”開始在我國很多番鴨養殖區流行。到目前為止，有關mdpv的完整基因組序列仍很有限，目前報道序列多集中于內部編碼蛋白。本實驗室于2000年從浙江省的發病番鴨體內分離到一株mdpv,定名為yy株。在人工感染試驗中，將含有yy株的新鮮尿囊液頸部皮下接種2日齡番鴨，番鴨死亡率可達62.5％。

反向遺傳技術是開展病毒研究的一種有用平臺，在闡明病毒致病機制和疫苗研制中能夠發揮重要作用。同樣，構建mdpv感染性分子克隆，以此為基礎可以對mdpv的特定基因展開更為有效的研究，對mdpv弱毒疫苗株的研制也提供了一個有用平臺。

病毒拯救是反向遺傳操作上的重要一環，大多是將構建的質粒或rna轉錄產物轉染細胞的途徑來實現拯救目的。對于細小病毒而言，細胞處于分裂期時才最適于病毒復制，因此轉染時細胞所處狀態對轉染拯救結果影響很大，同時每次轉染時制備原代細胞也頗費時間。因此，若能建立一種簡便、高效的拯救方法，將極大的方便并推動mdpv相關基礎研究的深入開展。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種番鴨細小病毒(muscovyduckparvovirus,mdpv)感染性質粒的構建方法，以及簡便高效的拯救方法。

本發明所述的mdpv感染性克隆質粒的拯救方法，是將mdpv完整基因組克隆入載體質粒pbskn，獲得重組質粒，將重組質粒與轉染試劑混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種非免疫番鴨胚，重組質粒在番鴨胚中得到拯救；所述pbskn載體，是將商品化質粒pbluescriptii(sk)多克隆位點上原有的ecorv酶切位點用ncoi位點替換而得到。

具體地：將重組質粒與轉染試劑lipofectamine2000按照一定比例1:2.5(μg/μl)混合后，通過絨毛尿囊膜途徑接種11日齡非免疫番鴨胚。番鴨胚在接種后7～11天死亡，胚體具有典型的mdpv感染特征，表現為胚體出血、絨毛尿囊膜水腫的典型特征。拯救出的病毒具有與親本病毒yy株相近的致病性。

進一步地，為了排除轉染拯救過程中親本mdpv毒株污染的可能，可通過overlappcr方法，在重組質粒的克隆基因組內部引入1個同義堿基突變作為遺傳標記，得到的帶有遺傳標記的重組質粒再施以轉染及拯救過程。更具體地，可以是在重組質粒的vp1基因中引入1個突變堿基作為遺傳標記。

本發明中，所述的重組質粒是插入mdpvyy株完整基因組pyy質粒，或者是插入mdpvyy株完整基因組并引入遺傳標記的pyyδ質粒。但是，本發明的拯救方法適用于但不僅限于插入mdpvyy株完整基因組的pyy質粒或pyyδ質粒。對其它mdpv分離株，以本發明內容公開的相同構建方法克隆其全基因組，獲得重組質粒，重組質粒的拯救方法同pyy質粒或pyyδ質粒。

本發明所述的質粒pyy，它的構建方法在于：超速離心濃縮mdpvyy株病毒，提取病毒基因組單鏈dna，體外退火后生成雙股dna。用ncoi酶切基因組dna生成兩個亞基因組片段，分別克隆入自行改造的pbskn載體的相應酶切位點，在sure株大腸桿菌感受態細胞中增殖。再通過酶切-連接的常規分子操作，拼接獲得含有完整基因組的質粒pyy。

進一步地，通過overlappcr方法，在pyy質粒的vp1基因中引入1個同義突變堿基作為遺傳標記，獲得質粒pyyδ。

本發明中所述相近的致病性是指在雛番鴨感染試驗中，拯救病毒具有與親本病毒相近的死亡率。

本發明公開了yy株的完整基因組序列。yy株基因組由5075個核苷酸組成(seqibno.7)。yy株itr由428個核苷酸組成，5′itr和3′itr具有一致的序列。該回文結構的莖部由342個核苷酸組成，通過堿基互補形成171個堿基對，45個核苷酸組成bubble區。itr內側為d或d′區，由41個核苷酸組成。

作為一個具體的操作，本發明公開了一種mdpv全基因組克隆的構建方法，該方法對其它mdpv毒株同樣適用，它包括如下步驟：

(1)mdpv核酸的提取

mdpvyy株在番鴨胚中增殖，收集的尿囊液分別經差速和超速離心濃縮到原有體積的1/60。采用sds-蛋白酶k消化法提取病毒核酸。經95℃變性10min，緩慢冷卻至65℃退火，使單股dna形成雙股dna，經0.8％瓊脂糖凝膠電泳，可觀察到約5.1kb基因組dna。

(2)全基因組克隆的構建

將體外退火的mdpvyy株基因組雙股dna用限制性內切酶ncoi酶切，產生兩個亞基因組片段。將0.7kb基因組左片段插入質粒載體pbskn的hincii-ncoi之間，產生質粒pbskn-l。4.4kb基因組右片段插入質粒載體pbskn的ncoi-smai之間，產生質粒pbskn-r。pbsknb-l質粒和pbskn-r質粒分別用xhoi和ncoi進行雙酶切，分別回收0.7kb和7.3kb片段，體外進行連接，連接產物轉化sure感受態細胞(agilent,santaclara,usa)，最終產生包含yy株全基因組的克隆質粒pyy。

本發明還公開了pyy質粒中遺傳標記引入的方法，以便于將拯救病毒與親本病毒yy株區分開(見附圖7)。

在pyy質粒的vp1基因中引入1個突變堿基作為遺傳標記，不改變氨基酸組成，獲得質粒pyyδ。利用yy株基因組內部在擬突變位點兩側分別存在單一bglii和kpni位點，設計了一組overlappcr引物，引物代號和序列分別為：

mp1:5′gtccggagcctgagag3′(seqibno.1)

mp2：5′gcaggtagatattctgttctgcca3′(seqibno.2)

mp3:5′tggcagaacagaatatctacctgc3′(seqibno.3)

mp4:5′atacctaatcagcctatc3′(seqibno.4)

酶切位點用單下劃線標示，單個突變堿基用雙下劃線標示，堿基由t突變為c，突變后產生1個新的ecorv位點，但不改變氨基酸組成。

mp1引物和mp4引物內部分別含有bglii和kpni位點。通過overlappcr,結合酶切連接操作，能夠將1個突變堿基引入pyy質粒，獲得質粒pyyδ。

本發明還公開了pyyδ質粒通過絨毛尿囊膜轉染番鴨胚拯救病毒的具體方法：

采用lipofectamine2000作為轉染試劑。質粒和轉染試劑的比例按照1：2.5(μg：μl)進行。吸取16μgpyyδ質粒溶液至1個滅菌的1.5ml離心管中，用opti-dmem培養液(invitrogen，美國)稀釋至1ml；另一個離心管內加入40μllipofectamine2000轉染試劑，加入960μlopti-dmem培養液混勻。將稀釋后的質粒和轉染試劑靜置5min后，輕柔混勻，室溫靜置20min后即可進行轉染。每只番鴨胚接種0.25ml質粒-轉染試劑混合物于絨毛尿囊膜上,其中包含了2.0μg質粒。番鴨胚在接種后第6天開始出現死亡，至轉染后第9天，死亡率達到83％。拯救病毒在番鴨胚上能夠成功傳代。

本發明對拯救病毒的致病性進行了測定。結果表明：以拯救病毒的新鮮尿囊液頸部皮下接種2日齡雛番鴨，死亡率達到56％，不死雛番鴨生長明顯慢于對照組，表明拯救病毒具有與親本病毒yy株相當的致病力。本發明建立的拯救方法操作簡便高效，避免了轉染原代細胞帶來的繁瑣和低效問題，在mdpv反向遺傳學研究和疫苗創制上具有潛在應用價值。

附圖說明

圖1.mdpvyy株基因組dna的瓊脂糖凝膠電泳分析。m.1kbdna分子量markers；1.基因組dna退火后形成的5.1kb雙股dna分子。

圖2.mdpvyy株感染性克隆pyy的構建策略

圖3.pyy質粒示意圖

圖4.pyy質粒的酶切鑒定.m:1kbdnamarkers；1:ncoi酶切產生單一的8.0-kbdna條帶.2:xhoi和bamhi雙酶切產生3.0kb載體分子和5.0kbmdpv基因組分子。

圖5.pyyδ轉染11日齡番鴨胚，胚胎在第6天開始出現死亡，至轉染后第10天死亡率達到83％，而轉染pbskn質粒的對照鵝胚全部存活。

圖6.pyyδ轉染番鴨胚后胚胎死亡的病理變化，表現為胚體、頭部、肢端出血(a),而轉染pbskn對照質粒的番鴨胚發育正常(b)。

圖7.pyy-2δ質粒轉染拯救病毒與親本病毒的區分。拯救病毒的1.4kb擴增片段能夠為ecorv酶切成0.4kb和1.0kb兩條帶，而親本病毒的1.4kb擴增產物不能為ecorv所切開。

圖8.拯救病毒與親本病毒序列的比較。拯救病毒與親本病毒株yy具有一致的序列，除了在拯救病毒中引入的作為遺傳標記的唯一堿基突變(t→c).

具體實施方式

為更好地理解本發明，以下結合具體生物材料及參數對本發明進一步說明，不是對本發明的進一步限定。

實施例

1.mdpv全基因組克隆pyy的構建

1.1.病毒擴增

將保存的mdpvyy株(archivesofvirology,2016,161:2589-2594)種毒用滅菌生理鹽水做1:10稀釋，加入青、鏈霉素至終濃度各2000μg或2000iu/ml，置37℃培養箱中孵育30min后接種12日齡非免疫番鴨胚，每只0.2ml。石蠟封口后放入37℃孵化箱中，每隔8h照蛋1次，剔除48h前死亡的鵝胚。收集48小時后死亡番鴨胚，置于4℃冰箱放置4～6h后無菌收取尿囊液，儲存在-40℃冰箱，備用。

1.2.病毒純化

將收集到的300ml病毒尿囊液按11,000g離心20min，取上清后加入1/3體積的氯仿，劇烈震蕩，以同樣的離心力轉速再次離心20min，收集上層水相再經150,000g離心力超速離心3h(sw32ti轉子,beckman)。棄去上清，病毒沉淀用5mlte緩沖液(50mmtris，20mmedta，ph8.0)溶解，-70℃保存待用。

1.3病毒dna提取

取500μl濃縮病毒液，分別加入10％sds和蛋白酶k至終濃度為1％和400μg/ml。45℃水浴2小時。用苯酚-氯仿-異戊醇(25:24:1)和氯仿-異戊醇(24:1)各抽提1次。上清液加入2.5倍體積的無水乙醇和十分之一體積的醋酸鈉(ph5.2)，-70℃沉淀過夜。次日15,000rpm/min，離心20min，去上清，核酸沉淀用70％酒精洗滌，再次15,000rpm/min，離心8min，去上清，沉淀涼干后，用30μlste緩沖液(10mmtris，1mmedta，100mmnacl，ph8.0)溶解。將提取的核酸置于95℃水浴10min，使單股dna發生熱變性，然后緩慢冷卻到65℃，此時單股dna可退火形成雙鏈。取10μl經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分析dna，見附圖1。

1.4基因組克隆

為了便于克隆，我們對pbluescriptii(sk)質粒(agilent公司，美國)的酶切位點進行了改造，將質粒上原有的ecorv酶切位點用ncoi位點替換，改造后的質粒命名為pbskn。該質粒的藍白斑篩選特性保持不變。

mdpv在724位堿基處存在單一的ncoi位點。mdpv的dsdna用ncoi酶切，酶切產物電泳分離后，切膠回收目的膠塊，用膠回收試劑盒純化目的片段。將0.7kb基因組左片段插入質粒載體pbskn的hincii-ncoi之間，產生質粒pbskn-l。4.4kb右片段插入質粒載體pbskn的ncoi-smai之間，產生質粒pbskn-r,構建策略見附圖2。pbsknb-l質粒和pbskn-r質粒分別用xhoi和ncoi進行雙酶切，分別回收0.7kb和7.3kb片段，體外進行連接，連接產物轉化sure感受態細胞(agilent,santaclara,usa)，最終產生包含yy株全基因組的克隆質粒pyy，見附圖3。

pyy質粒的酶切鑒定。ncoi酶切產生單一的8.0-kbdna條帶，用xhoi和bamhi雙酶切產生3.0kb載體分子和5.0kbmdpv基因組分子，見附圖4。

1.5基因組序列分析

將構建的pbskn-l和pbskn-r陽性克隆送商業化公司(蘇州金唯智)進行測序。由于itr形成的高級結構會干擾測序反應，利用itrloop區天然存在的sphi位點，對pbskn-l和pbskn-r質粒，分別用sphi+bamhi或者sphi+xhoi進行雙酶切，生成的亞片段將包含半個itr。將含有一半itr序列的亞片段克隆進puc19或者pbsk質粒的相應位點，對重組克隆進行測序后將獲得一致的itr序列。

利用dnastar軟件包中的seqmanii程序對所測序列進行拼接，獲得完整的基因組序列，并提交genbank。(登錄號kx000918)。

序列分析結果表明，yy株基因組由5075個核苷酸組成。yy株itr由428個核苷酸組成，5′itr和3′itr具有一致的序列。該回文結構的莖部由342個核苷酸組成，通過堿基互補形成171個堿基對，45個核苷酸組成bubble區。itr內側為d或d′區，由41個核苷酸組成。

1.6pyy質粒的轉染拯救

1.6.1pyy質粒純化

挑取pyy克隆單個菌落，接種于含有氨芐青霉素(100μg/ml)的lb培養基中，37℃震蕩培養16～24h。采用高純度質粒純化試劑盒提取質粒，具體操作按照其說明書進行，質粒用超純水溶解。采用nanodrop2000核酸測定儀，檢測質粒濃度和純度，確保od260/280在1.8-2.0之間。

1.6.2質粒-轉染試劑混合物的配制

轉染混合物的配制參照lipofectamine2000轉染試劑(invitrogen,carlsbad,usa)說明書進行。質粒和轉染試劑的比例按照1:2.5(μg:μl)進行。取16μg純化的質粒溶液至1個滅菌的指形管中，用opti-dmem培養液(invitrogen)稀釋至1ml；另一個離心管內加入40μllipofectamine2000轉染試劑，加入960μlopti-dmem培養液混勻。將稀釋后的質粒和轉染試劑靜置5min后，輕柔混勻，室溫靜置20min后即可進行轉染

1.6.3轉染番鴨胚

上述配制好的轉染試劑，分別經絨毛尿囊膜途徑接種11日齡番鴨，每只番鴨胚接種0.25ml,其中包含2.0μg質粒。同時將質粒載體pbskn轉染番鴨胚作為對照。石蠟封口后放入孵化箱內繼續孵育，每隔8h照胚1次，棄去48小時內死亡番鴨胚。收集轉染48小時后死亡番鴨胚的尿囊液，-70凍存。

結果表明，pyy質粒轉染11日齡番鴨胚，轉染后第7天胚體開始死亡，至13天死亡率達到100％。收集尿囊液-70℃凍存。檢查胚體病變，可見胚體、頭部、肢端出血，絨毛尿囊膜水腫等特征性病變。

1.6.4拯救病毒的傳代

將第1代的拯救病毒用滅菌生理鹽水做1:50稀釋，接種12日齡番鴨胚，收集死亡番鴨胚尿囊液，觀察胚體病變。如此傳至第4代，-70℃保存備用。

1.7拯救病毒中遺傳標記的引入

為了排除拯救病毒可能來自于轉染或傳代過程中親本病毒或mdpv野毒株污染的可能，采用overlappcr方法在pyy質粒內部vp1基因上游引入一個堿基突變(t→c)，突變后產生1個新的ecorv位點，但不改變氨基酸的組成。

1.7.1overlappcr引物設計

為了實現鑒別的目的，設計了一組重疊pcr引物，引物由大連寶生物有限公司合成，引物代號和序列分別為：

mp1:5′gtccggagcctgagag3′(seqibno.1)

mp2：5′gcaggtagatattctgttctgcca3′(seqibno.2)

mp3:5′tggcagaacagaatatctacctgc3′(seqibno.3)

mp4:5′atacctaatcagcctatc3′(seqibno.4)

mp1和mp4內部分別含有bglii和kpni位點，用斜體標示，突變堿基用雙下劃線標示。1.7.2overlappcr擴增

以pyy質粒為模板，以mp1引物和mp2引物擴增2109bp的a片段。反應體系為：primestarmaxpremix25μl，上下游引物各1μl，模板1μl，超純水補至50μl體系。反應程序設定為：95℃,1min預變性；然后執行94℃，15s；55℃，退火25s，72℃,延伸23s，共25個循環；72℃，延伸10min結束。

以mp3引物和mp4引物擴增375bp的b片段。反應體系為：primestarmaxpremix25μl，上下游引物各1μl，模板1μl，超純水補至50μl體系。反應程序設定為：95℃,1min預變性；然后執行94℃，15s；55℃退火25s，72℃延伸23s，共25個循環；72℃，10min結束。

a、b擴增片段經1％瓊脂糖凝膠電泳分離后，分別采用凝膠回收試劑盒(天根生物科技有限公司)切膠回收目的片段。

回收的a、b產物各取1μl混合后作為第二步pcr擴增反應的模板。以mp1和mp4為上下游引物。反應體系為：primestarmaxpremix25μl，模板1μl，超純水補至48μl體系。反應程序設定為：95℃,1min變性；然后執行94℃，15s；54℃，25s，72℃,35s延伸，共5個循環。

上述反應結束后，再加入上下游引物各1μl執行以下反應程序：95℃,1min變性；然后執行94℃，15s；54℃，25s，72℃,35s延伸，共20個循環；72℃，10min補平結束反應。預期擴增片段為2.5kb。反應結束后，將50μlpcr反應產物經0.8％瓊脂糖凝膠電泳分離后，切膠回收目的片段。目的片段用kpni和bglii雙酶切，酒精沉淀酶切片段后，用20μl超純水溶解。

1.7.3突變位點導入pyy質粒

將pyy用kpni和bglii雙酶切，電泳分離線性化片段，然后切膠回收5.5kb片段。將前述回收的2.5kbpcr擴增片段與5.5kb片段連接，連接產物轉入sure感受態細胞，涂布lb平板。采用ecorv酶切消化質粒的方法來鑒定陽性的突變插入克隆，并進一步用自帶引物送商業化公司進行測序，確保在突變位點正確引入的同時，其它位點未發生改變。陽性克隆命名為pyyδ。

1.7.4遺傳標記病毒的拯救

將pyyδ質粒轉染番鴨胚。pyyδ轉染11日齡番鴨胚，胚胎在第6天開始出現死亡，至轉染后第10天死亡率達到83％，而轉染pbskn質粒的對照鵝胚全部存活。實驗方法同2.5，見附圖5。pyyδ轉染番鴨胚后胚胎死亡的病理變化，表現為胚體、頭部、肢端出血(a),而轉染pbskn對照質粒的番鴨胚發育正常(b)，見附圖6。

拯救病毒在番鴨胚上傳代4次。從尿囊液中提取病毒核酸，用m7和m8引物擴增含有突變位點的1.4kbdna片段，并用ecorv酶切鑒定。

m7：5′-ggaacaaacccagactcaaa-3′(seqibno.5)

m8：5′-ccaatcagcctatcttctacat-3′(seqibno.6)

結果表明，pyy-2δ質粒轉染拯救病毒的1.4kb擴增片段用ecorv酶切，產生0.4kb和1.0kb的兩個片段，而親本病毒的1.4kb擴增片段無法用ecorv酶切，見附圖7。

1.8遺傳標記拯救病毒的雛番鴨感染試驗

將32只2日齡易感雛番鴨隨機分成2組。一組為感染組，頸部皮下注射0.4ml的新鮮的拯救病毒尿囊液原液；另一組16只雛番鴨感染僅注射生理鹽水作為對照。雛番鴨分別在單獨的房間隔離飼養18天，記錄死亡個數和死亡時間，所有死亡雛番鴨均剖解觀察病理變化并做病毒分離和pcr測序鑒定。

結果表明，2日齡雛番鴨接種后第6天開始出現死亡，至第13天死亡率達到56％，不死雛番鴨生長明顯慢于對照組，表明拯救病毒具有與親本病毒yy株相當的致病力。剖解病死番鴨，可見肝臟、腦淤血、出血，腎臟腫大，有尿酸鹽沉積，腸道充出血，腸上皮粘膜脫落，某些病例可見胸腔有膠凍樣滲出液。

從腸道、肝臟采集的病料經無菌處理后接種番鴨胚，能夠使番鴨胚致死。取尿囊液檢測，能夠擴增出包含標記位點在內的mdpv特異片段。pcr產物直接測序，除了引入的突變堿基，其余序列與yy株完全一致，表明死亡雛番鴨確實死于拯救病毒感染所致，可以排除野毒感染的可能，見附圖8。

sequencelisting

<110>揚州大學

<120>一種番鴨細小病毒感染性克隆的構建及拯救方法

<130>

<160>7

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtccggagagatctcctgagag22

<210>2

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

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gcaggtagatatctctgttctgcca25

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<211>25

<212>dna

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tggcagaacagagatatctacctgc25

<210>4

<211>24

<212>dna

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<400>4

atacctggtaccaatcagcctatc24

<210>5

<211>20

<212>dna

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<400>5

ggaacaaacccagactcaaa20

<210>6

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ccaatcagcctatcttctacat22

<210>7

<211>5075

<212>dna

<213>番鴨細小病毒yy株

<400>7

tcattggagggttcgttcgttcgaaccagccaatcaggggaggggggaagtgacgtaagt60

tccggtcacgtgcttccggtcatgtgacttccggtcacgtgacttccggtgacgtgtttc120

ctgtcacgtgacttccggtgacgcacttcctttgatgacgtatttccggttgtcaaggct180

gatcgggcgcatgcgcccgatctgccatgaaaattaaaccggaaatacgtcatcaaagga240

agtgcgtcaccggaagtcacgtgacaggaaacacgtcaccggaagtcacgtgaccggaag300

tcacatgaccggaagcacgtgaccggaacttacgtcacttcccccctcccctgattggct360

ggttcgaacgaacgaaccctccaatgagactcaaggacagcaggactttttgcgcgccag420

gaagtggtgcaatctaggagagtgtataaggagagctttttccggttgcattcattcgtt480

gctctgctctcacagagaacggacctcaggtcaggaaaatggcattttctaggcctcttc540

agatttcttctgacaaattctatgaagttatcatcaggctaccctcggatattgatcaag600

atgtgcctggtttgtctcttaactttgtagaatggctttctacgggggtctgggagccca660

ccggaatatggaatatggagcatgtgaatctccccatggttactctggcagacaaaatca720

agaacattttcatccagagatggaaccaattcaatcaggacgaaacggatttcttctttc780

aattggaagaaggcagtgagtacatccatctgcattgctgtattgctcaggggaatgtcc840

gatcttttgttctggggagatacatgtctcaaattaaagactcaattctgagagatgtgt900

atgaagggaaacaggtaaaaatcccggattggttttctataactaaaaccaaacggggag960

ggcaaaataagaccgtgactgctgcttatattctgcattacctgattcctaaaaaacaac1020

cggaattacaatgggcttttaccaatatgccccttttcactgctgctgctttatgcctcc1080

aaaagaggcaagagttactggatgcttttcaggaaagtgagatgaatgctgtagtgcagg1140

aggatcaagcttcaactgtagctccccttatttccaacagagcagcaaagaactatagca1200

atctggttgattggctcattgagatgggtatcacctctgaaaaacagtggctaactgaaa1260

ataaagagagctaccggagctttcaggctacatcttcaaacaacagacaagtaaaagcag1320

cacttgaaaatgcccgagcagaaatgctactaacaaaaactgccacagactatttgattg1380

gaaaagacccagttctggacattactaaaaatcggatctatcaaattctgaagttgaata1440

actataaccctcaatatgtagggagcatcctatgcggatgggtgaaaagagaattcaaca1500

aaagaaatgccatatggctctacggacctgcgaccaccggaaagaccaacatagccgagg1560

ctattgcccatgctgtacccttctatggctgtgttaactggactaatgagaacttcccat1620

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