一種磷脂酶D的基因挖掘及其應用方法與流程

本發明提供了一種基于數據庫基因挖掘方法獲得的磷脂酶d及其應用方法，屬于工業生物
技術領域：
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背景技術：
：磷脂酶d(pld)是一類催化磷酸二酯鍵水解和堿基交換反應的酶的總稱，主要底物是磷脂酰膽堿(pc)，pld可以將pc水解生成磷脂酸(pa)和膽堿，而利用其轉磷脂酰活力可制備許多功能良好的稀有磷脂和磷脂衍生物，在食品、醫藥及保健品領域應用廣泛。磷脂酶d來源廣泛，最早報道其來源于白菜葉中，隨后在其他動、植物及微生物中發現，酵母、細菌中等克隆獲得pld也有相關報道。植物中磷脂酶d主要存在于種子、根和葉中；動物來源主要分布在腦、肝臟中。與其他來源的磷脂酶d相比，微生物磷脂酶d具有較強的底物耐受性，較寬的底物專一性和較高的堿基交換反應催化活性，更適合于工業應用。至今已報導的產磷脂酶d的微生物主要有鏈霉菌、棒狀桿菌、大腸桿菌、沙門氏桿菌以及假單孢菌等。其中，磷脂酶d在鏈霉菌中分布最為廣泛，報導也最多。國外對pld的研究一直處于領先水平，國外成功篩選并利用基因重組等方法改造出高產pld的生物菌株，利于工業生產，少數酶制劑公司已開發出具有較高酶活力的pld，國內對微生物發酵產pld的研究起步較晚，酶活較低，目前主要依賴進口，但價格非常昂貴。研究具有自主知識產權的pld酶制劑具有現實意義，菌株篩選是其中的一個重要環節。磷脂酰絲氨酸(ps)是磷脂的一種，天然含量較少，但它是大腦中主要的酸性磷脂，能控制和調節細胞膜關鍵蛋白的功能狀態。ps占細胞膜雙分子層磷脂的10％-20％，對中樞神經作用顯著，能提高腦細胞的活力，改善大腦功能、修復大腦損傷，成為“腦專一性營養物質”，逐漸引起人們廣泛關注。磷脂酰絲氨酸制備方法主要包括提取法，化學合成法和生物酶轉化法。提取法主要指從植物細胞、動物的大腦和內臟中直接提取磷脂酰絲氨酸。相關研究顯示植物組織中磷脂酰絲氨酸的含量非常少，提取法主要以動物組織如大腦和內臟等為主。提取法利用有機溶劑進行萃取，操作簡單，但是純度和產率低，污染大，且由于瘋牛病的原因，提取的ps還有一定的安全性問題；化學合成法主要指通過以甘油為主要原料經過一系列化學反應合成ps，此方法得到的產品純度高，安全性好，但是合成步驟繁瑣且副產物較多。近年來，生物酶轉化法逐漸受到大家的重視。酶轉化法是指在磷脂酶d的催化作用下，底物卵磷脂和絲氨酸進行轉酰基反應，生成磷脂酰絲氨酸。該方法具有條件溫和，生產成本低，副產物少，低碳環保，產率高等優點，是制備大量磷脂酰絲氨酸的理想方法。雖然，國內外報道了酶催化合成磷脂酰絲氨酸的方法，但是大多為野生菌，發酵時間長，且對酶的性質不夠了解，從而影響了酶催化合成磷脂酰絲氨酸的效率，因此磷脂酶d基因的克隆表達及其在大腸桿菌中的高效表達，對其實際應用及作用機理研究顯得非常重要。技術實現要素：本發明的目的是提供一種基于基因挖掘獲得的磷脂酶d及其基因編碼序列與應用方法。提供包括本發明基因的質粒及包含該表達質粒的宿主細胞，以及利用該重組菌株表達生產磷脂酶d的方法。通過數據庫基因挖掘技術篩選獲得磷脂酶d基因。以具有較高轉磷脂酰活力磷脂酶d的氨基酸序列為模板，在ncbi數據庫中進行blast比對分析，根據設定的篩選標準，獲得目的磷脂酶d基因，根據基因序列設計引物通過pcr技術擴增獲得編碼基因序列，電泳鑒定后回收純化pcr產物并克隆至pmd19-t載體構建重組質粒，將重組質粒轉化至e.colijm109，挑取多個陽性轉化子至lb液體培養基中(ampr)37℃，220rpm培養10～12h，提取質粒后進行雙酶切、pcr驗證。將驗證正確的重組質粒經bamhi和hindiii雙酶切后與經同樣雙酶切的載體質粒進行連接，選擇的載體質粒包括pet系列，pma5，pwb系列，ppiczα，pic9k，pdw系列等。連接產物轉化至宿主菌大腸感受態細胞中，但不局限于大腸桿菌，還包括絲狀真菌，枯草芽孢桿菌，谷氨酸棒桿菌，鈍齒棒桿菌，畢赤酵母，釀酒酵母等，經培養后實現磷脂酶d的高效表達。(1)數據庫基因挖掘技術篩選磷脂酶d基因根據已報道磷脂酶d外源表達文獻，選擇轉磷脂酰活力較高的磷脂酶d的氨基酸序列作為模板，在ncbi數據庫中blast，根據設定的篩選標準獲得一系列磷脂酶d氨基酸序列，再通過構建進化樹分析篩選獲得目的磷脂酶d的氨基酸序列，從而得到其編碼基因序列。(2)pcr擴增磷脂酶d基因以經合成的核苷酸序列設計引物(p1、p2)，通過pcr擴增磷脂酶d的編碼基因：引物p1：5’-cgggatccatgctgcgtcgcctgcat引物p2：5’-cccaagcttttacagactacacacaccpcr擴增反應在50μl體系中進行，反應體系中加入25μlextaq(premix)，20μlddh2o，2μl模板dna，上下游引物各1.5μl。反應條件為在94℃預變性3min后開始循環：94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃終延伸10min。pcr產物進行核酸電泳鑒定并割膠回收純化，回收產物克隆至pmd19-t載體構建重組克隆質粒，將質粒轉化至e.colijm109，挑取多個陽性轉化子至lb液體培養基中(ampr)37℃，220rpm培養10～12h，提取質粒后對質粒進行雙酶切、pcr驗證，驗證正確的進行序列測定。(3)重組表達質粒的構建本研究以pet-28a(+)為例開展重組表達質粒的構建，該質粒帶有t7啟動子和6×his-tag標簽，將pet-28a(+)質粒和驗證正確的含有目的基因的重組克隆質粒同時用bamhi和hindiii進行雙酶切，37℃酶切3h后進行核酸電泳驗證并割膠回收目的基因和目的質粒，回收產物用t4dna連接酶在16℃過夜連接，連接產物轉化至e.colijm109感受態細胞中，涂布在含卡那霉素抗性(50mg/ml)的lb固體培養中培養8～10h，挑取多個陽性轉化子至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養基中培養，在37℃，220rpm條件下培養10～12h后提取質粒并命名為pet-28a(+)-pld。(4)重組表達菌株的構建與篩選本研究以大腸桿菌為例，研究將重組質粒pet-28a(+)-pld經42℃熱擊90s轉化至大腸桿菌宿主e.colibl21(de3)感受態細胞中，涂布在含有卡那霉素(50mg/ml)的lb固體培養基上培養8～10h，通過pcr驗證篩選陽性轉化子e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld，接種至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養基中培養過夜。次日按1％接種量接種于含卡那霉素(50mg/ml)的50ml新鮮lb液體培養基中，37℃培養約3h，od600為1.0時加入iptg進行誘導，使其終濃度為0.5mm，25℃誘導12h后，重組菌表現出磷脂酶d活性。(5)重組磷脂酶d的westernblot分析將上述獲得的重組菌發酵液在4℃，8,000rpm條件下離心20min，去掉上清收集菌體沉淀，菌體用5mltris-hcl(ph7.5)緩沖液清洗一遍去除雜質，8,000rpm離心10min，再次去掉上清收集菌體沉淀，用5mltris-hcl(ph7.5)緩沖液懸浮，制備成菌懸液。將菌懸液在置于冰水浴中利用細胞超聲破碎儀進行超聲破碎，條件為：200w功率下工作200個循環，每個循環工作4s停6s。破碎完全后在4℃，12,000rpm條件下離心20min，所得上清即為粗酶液。通過bca蛋白定量分析試劑盒測定蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠后，取80μl樣品加入20μl5xloadingbuffer，充分混勻后于沸水浴中放置5min使蛋白變性。根據測定蛋白的濃度進行上樣，并加入marker。上層濃縮膠用80v電壓，當樣品至分離膠時(約30min)，用100v電壓，當樣品至分離膠底部約1cm處關閉電源，電泳結束。結束后用蒸餾水沖洗干凈，在電流作用下，使蛋白質從膠轉移至固相載體pvdf(聚偏二氟乙烯膜)上。轉移完畢后進行封閉，孵育一抗和二抗，最后進行顯色拍照以確認目的蛋白的表達情況。(6)重組磷脂酶d的酶學性質研究a.重組磷脂酶d最適ph及ph穩定性研究取適量酶液，分別在40mmph4.0-6.0的乙酸鈉緩沖液，ph6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，ph8.0-10的tris-hcl緩沖液中(ph間隔0.5單位)進行反應，測定不同ph下的酶活力，以最大酶活為100％，以確定該酶的最適作用ph。另取新鮮酶液分別在40mmph4.0-6.0的乙酸鈉緩沖液，ph6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，ph8.0-10的tris-hcl緩沖液中(ph間隔0.5單位)放置60min，回調至ph8.0后，再按照標準測定酶活的方式測定殘余酶活，以確定該酶的ph穩定性，以未經處理的酶液作為100％。b.重組磷脂酶d最適溫度及溫度穩定性研究取適量酶液，分別在20℃至80℃范圍內選擇溫度點(間隔5℃)，測定其在不同溫度下的酶活力，以最大酶活為100％，以確定該酶的最適作用溫度。另取新的酶液，分別保溫于上述不同溫度中60min后立即冷卻，按照標準測定酶活的方式測定殘存酶活，以確定該酶的溫度穩定性，以未經處理的酶液作為100％。c.金屬離子對重組磷脂酶d酶活的影響取kcl、mgcl2、bacl2、cacl2、cocl2、nacl、cucl2、mncl2、licl、fecl3、fecl2、agno3、znso4、al2(so4)3等配制成50mm母液，在適當稀釋的酶液中分別加入配好的母液，終濃度為5mm。37℃保溫30min后，按照酶活測定方法測定殘余酶活，以未添加金屬離子的酶液活力作為100％。d.蛋白抑制劑對重組磷脂酶d酶活的影響取蛋白抑制劑：β-巰基乙醇、dtt、pmsf、edta、sds等配制成50mm母液，在適當稀釋的酶液中分別加入配好的母液，終濃度為5mm。37℃保溫30min后，按照酶活測定方法測定殘余酶活，以未處理的酶液活力為100％。(7)重組磷脂酶d在催化合成磷脂酰絲氨酸中的應用利用重組磷脂酶的催化合成磷脂酰絲氨酸的反應體系包括有機相和水相兩部分，有機相：8ml溶有10mg/mlpc60的乙酸乙酯；水相：4ml溶有30mg/mll-絲氨酸、15mmcacl2的粗酶液，將有機相和水相充分混合均勻后于40℃，180rpm條件下反應10h。通過hplc檢測產物中的磷脂酰絲氨酸的合成。本發明的優點和有益效果本發明提供了一種磷脂酶d基因及其高效表達，它具有seqidno:1所示的核苷酸序列和seqidno：2所示的氨基酸序列，全長1,614bp，編碼538個氨基酸，以質粒pet28a(+)為表達載體，以大腸桿菌e.colibl21(de3)為表達宿主，實現了磷脂酶d基因的高效表達，重組菌株e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld表現出磷脂酶d活性，能催化底物磷脂酰膽堿和l-絲氨酸合成磷脂酰絲氨酸，在食品、醫藥和保健行業具有較大的應用前景，且重組菌發酵周期短，適合于工業化大規模的生產。附圖說明圖1pcr擴增磷脂酶d編碼基因核酸電泳圖譜m：5,000bpdnamarker；泳道1：擴增得到的磷脂酶d基因。圖2重組磷脂酶d的westernblot分析m：標準蛋白分子量；圖示smpld為目的蛋白磷脂酶d。圖3磷脂酶d的最適ph及ph穩定性圖4磷脂酶d的最適溫度及溫度穩定性圖5磷脂酶d催化合成磷脂酰絲氨酸的hplc檢測結果a：ps標樣；b：ps樣品。具體實施方式下面結合實施例對本發明作進一步說明，但本發明并不受這些實施例的限制。實施例1本實例說明基于數據庫基因挖掘技術篩選磷脂酶d的方法。根據已報道磷脂酶d外源表達文獻，選擇經實驗驗證過的轉磷脂酰活力較高的磷脂酶d的氨基酸序列作為模板，在ncbi數據庫中進行blast，根據已設定的篩選標準進行篩選，獲得一系列磷脂酶d氨基酸序列，再通過構建進化樹分析篩選獲得目的磷脂酶d的氨基酸序列，從而得到其編碼基因序列。實施例2本實施例說明磷脂酶d編碼基因的克隆方法。以經合成的核苷酸序列設計引物(p1、p2)，通過pcr擴增磷脂酶d的編碼基因：引物p1：5’-cgggatccatgctgcgtcgcctgcat引物p2：5’-cccaagcttttacagactacacacaccpcr擴增反應在50μl體系中進行，反應體系中加入25μlextaq(premix)，20μlddh2o，2μl模板dna，上下游引物各1.5μl。反應條件為在94℃預變性3min后開始循環：94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃終延伸10min。pcr產物進行核酸電泳鑒定并割膠回收純化，回收產物克隆至pmd19-t載體構建重組克隆質粒，將質粒轉化至e.colijm109，挑取多個陽性轉化子至lb液體培養基中(ampr)37℃，220rpm培養10～12h，提取質粒后對質粒進行雙酶切、pcr驗證，驗證正確的進行序列測定。核酸電泳結果顯示磷脂酶d基因序列得到有效擴增(圖1)。實施例3本實施例以pet-28a(+)為例說明重組表達質粒的構建過程。pet-28a(+)帶有t7啟動子和6×his-tag標簽，將pet-28a(+)質粒和驗證正確的含有目的基因的重組克隆質粒同時用bamhi和hindiii進行雙酶切，37℃酶切3h后進行核酸電泳驗證并割膠回收目的基因和目的質粒，回收產物用t4dna連接酶在16℃過夜連接，連接產物轉化至e.colijm109感受態細胞中，涂布在含卡那霉素抗性(50mg/ml)的lb固體培養中培養8～10h，挑取多個陽性轉化子至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養基中培養，在37℃，220rpm條件下培養10～12h后提取質粒并命名為pet-28a(+)-pld。實施例4本實施例以大腸桿菌為例說明重組表達菌株的構建與篩選方法。將重組質粒pet-28a(+)-pld經42℃熱擊90s轉化至大腸桿菌宿主e.colibl21(de3)感受態細胞中，涂布在含有卡那霉素(50mg/ml)的lb固體培養基上培養8～10h，通過pcr驗證篩選陽性轉化子e.colibl21(de3)/pet-28a(+)-pld，接種至含卡那霉素(50mg/ml)的lb液體培養基中培養過夜。次日按1％接種量接種于含卡那霉素(50mg/ml)的50ml新鮮lb液體培養基中，37℃培養約3h，od600為1.0時加入iptg進行誘導，使其終濃度為0.5mm，25℃誘導12h后，重組菌表現出磷脂酶d活性。實施例5本實施例說明磷脂酶d的westernblot分析過程。將上述獲得的重組菌發酵液在4℃，8,000rpm條件下離心20min，去掉上清收集菌體沉淀，菌體用5mltris-hcl(ph7.5)緩沖液清洗一遍去除雜質，8,000rpm離心10min，再次去掉上清收集菌體沉淀，用5mltris-hcl(ph7.5)緩沖液懸浮，制備成菌懸液。將菌懸液在置于冰水浴中利用細胞超聲破碎儀進行超聲破碎，條件為：200w功率下工作200個循環，每個循環工作4s停6s。破碎完全后在4℃，12,000rpm條件下離心20min，所得上清即為粗酶液。通過bca蛋白定量分析試劑盒測定蛋白含量。制備分離膠和濃縮膠后，取80μl樣品加入20μl5xloadingbuffer，充分混勻后于沸水浴中放置5min使蛋白變性。根據測定蛋白的濃度進行上樣，并加入marker。上層濃縮膠用80v電壓，當樣品至分離膠時(約30min)，用100v電壓，當樣品至分離膠底部約1cm處關閉電源，電泳結束。結束后用蒸餾水沖洗干凈，在電流作用下，使蛋白質從膠轉移至固相載體pvdf(聚偏二氟乙烯膜)上。轉移完畢后進行封閉，孵育一抗和二抗，最后進行顯色拍照以確認目的蛋白的表達情況，結果顯示磷脂酶d能夠清晰表達，且分子量大小約為60kda(圖2)。實施例6本實施例說明磷脂酶d的催化特征。(1)分別在40mmph4.0-6.0的乙酸鈉緩沖液，ph6.0-8.0的磷酸鹽緩沖液，ph8.0-10的tris-hcl緩沖液中(ph間隔0.5單位)進行反應，測定不同ph下的酶活力，該酶的最適反應ph為7.5，在ph6.5～8.5范圍內能達到最高酶活的75％～100％。另取新鮮酶液分別在上述緩沖液中放置60min，回調至ph8.0后，按照標準測定酶活的方式測定殘存酶活，該重組磷脂酶d在ph6.5～8.5的條件下表較穩定，可以保持70％左右的相對酶活(圖3)。(2)取適量酶液，分別在20℃至80℃范圍內選擇溫度點(間隔5℃)，測定其在不同溫度下的酶活力，該酶的最適反應溫度為60℃。另取新鮮酶液分別保溫于上述不同溫度中60min后立即冷卻，按照標準測定酶活的方式測定殘存酶活，該酶在20～55℃條件下酶活相對穩定，可以維持65％以上的相對酶活(圖4)。(3)取kcl、mgcl2、bacl2、cacl2、cocl2、nacl、cucl2、mncl2、licl、fecl3、fecl2、agno3、znso4、al2(so4)3等配制成50mm母液，在適當稀釋的酶液中分別加入配好的母液，終濃度為5mm。37℃保溫30min后，按照酶活測定方法測定殘余酶活，結果如表1所示，與未添加任何金屬離子的空白對照組相比，na+、mn2+和mg2+并未表現出明顯促進作用；ba2+，co2+和ca2+對酶活有著明顯的促進作用，其中ca2+促進作用最明顯，相對酶活達到134.1％；另外，k+、cu2+、li+、fe3+、al3+和zn2+有著較小的促進作用；而fe2+和ag+對磷脂酶d酶活有著明顯的抑制作用。表1金屬離子對酶活的影響試劑相對酶活(％)試劑相對酶活(％)對照組100±0.6mn2+101.7±1.5k+105.2±1.5li+107.6±0.8mg2+101.1±0.3fe3+105.9±2.1ba2+118.2±1.5fe2+56.0±2.2ca2+134.1±0.2ag+27.0±1.2co2+117.8±1.8zn2+109.7±0.6na+101.5±1.2al3+109.3±2.4cu2+108.2±0.6(4)取蛋白抑制劑：β-巰基乙醇、dtt、pmsf、edta、sds等配制成50mm母液，在適當稀釋的酶液中分別加入配好的母液，終濃度為5mm。37℃保溫30min后，按照酶活測定方法測定殘余酶活，結果如表2所示，2-me、dtt、sds和pmsf對磷脂酶d有著一定的抑制作用，而edta對該酶表現出較強的抑制作用。表2蛋白抑制劑對酶活的影響試劑濃度(mm)相對酶活(％)none0100±0.32-me575±0.9dtt580±1.1sds550±2.1pmsf540±0.3edta56±0.6實施例7本實施例說明重組磷脂酶d進行磷脂酰絲氨酸合成試驗。稱取80mgpc60溶解于8ml乙酸乙酯中，稱取120mgl-絲氨酸和6.66mgcacl2溶解于4ml磷脂酶d粗酶液中，將有機相和水相充分混合均勻后于40℃，180rpm條件下反應10h。結果如圖5所示，在重組磷脂酶d催化作用下，在14.2min可以看到有磷脂酰絲氨酸生成，經計算磷脂酰絲氨酸的產量為0.2g/l，而在空白對照組中并沒有看到有磷脂酰絲氨酸的生成，說明該重組磷脂酶d具有催化底物磷脂酰膽堿和l-絲氨酸合成磷脂酰絲氨酸的能力，在食品、醫藥和保健行業具有較大的應用前景，且重組菌發酵周期短，適合于工業化大規模的生產。本發明不限于這些公開的實施例，本發明將覆蓋技術方案所描述的范圍，以及權利要求范圍的各種變形和等效變化，在不偏離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域技術人員容易實現的任何修改或改進均屬于本發明所要求保護的范圍。seqidno：1seqdnaman1:1614bp;composition347a;435c;484g;348t;0otherpercentage:21.5%a;27.0%c;30.0%g;21.6%t;0.0%othermolecularweight(kda):ssdna:499.35dsdna:995.14origin1ctgctgcgtcgcctgcatcgtctgacccgtcgcgcaacggtgtccgcagttctgctggca61ctgctgccggcaggtccggctctggcagcaggtgacgcaccgggtgccccgcacctggat121gcggttgaacgtaccctgcgtcaggtctcaccgggtctggaaggtgacgtttggcaacgt181acggagggtaacaaactggatgccagcgcagctgacccgtctgattggctgctgcagacc241ccgggttgctggggtgatgcacattgtgctgaacgtccgggcaccaaacgcctgctggct301aaaatgacggaaaatatttctcgcgcacgtcgcaccgtggatatcagtacgctggcgccg361tttccggacggtgctttccaggatgcgattgcggccggcctgaaagcgagtgttgcctcc421ggtaacaaaccgcgtgtgcgtgttctggtcggcgcagctccgctgtatcacctgaatgtg481cgtccgagcgcctacctggatgacctgcgtgcacgtctgggtaccgcagcagatgcagtt541acgctgaacgtcgcatctatgaccacgagtaaaaccgcgttttcctggaatcattcaaaa601ctgctggttgtggacggcgaaagcgccattacgggcggtatcaacgattggaaaaatgac661tatgttgataccgcacacccggtcacggatgtggacctggcactgaccggtccggcagct721tcgacggcaggtcgctatctggataccctgtggggctggacgtgcggcaacaaaggtaat781atcgcgagcgtgtggtacgcagcatcggcaggtgcaagctgtatggccgatctggaaaaa841gaagccaacccgaaaccggcaggtccgaccggtaatgtgccggttattgcggtgggcggt901ctgggcgttggtatcaaagataaagacgcaagctctgcttatcgtccggaactgccgtct961gcaccggacaccaaatgcgtcgtgggcctgcatgataacaccaatgccgatcgtgactac1021gatacggtgaacccggaagaatcagcactgcgtgccctggtgggttcggcagaaaaacat1081gttgaaattagccagcaagatctgcacgctacctgtccgccgatcgcgaaatatgacgtt1141cgcctgtacgatacgctggcgaagaaaattgcatccggtgtcaaagtgcgtatcgttgtc1201tcagatccggcaaaccgtggtaccgtgggttctggcggttatagtcagattaaatccctg1261acggaaatctctgacgtcctgcgtaatcgtctggcactggtgaccggcggtcaggatcaa1321gcaaaaaacgctctgtgcagtaatgtgcagctggcttcattccgctcggcaaaaagcccg1381acctgggctgacggtcacgcatatccgctgcatcacaaactggtttcagtcgatggctcg1441gcgttttatgttggtagtaaaaatctgtacccgtcctggctgcaggacttcggctacatt1501gtcgaagatcgtaccgcagctggtcaactggatgccaaactgctggcaccggaatgggaa1561tatgctcaggacaccgcgatcgtcgattaccaacgcggtgtgtgtagtctgtaaseqidno：2universalcodetotalaminoacidnumber:5381mlrrlhrltrratvsavllallpagpalaagdapgaphldavertlrqvspglegdvwqr61tegnkldasaadpsdwllqtpgcwgdahcaerpgtkrllakmtenisrarrtvdistlap121fpdgafqdaiaaglkasvasgnkprvrvlvgaaplyhlnvrpsaylddlrarlgtaadav181tlnvasmttsktafswnhskllvvdgesaitggindwkndyvdtahpvtdvdlaltgpaa241stagryldtlwgwtcgnkgniasvwyaasagascmadlekeanpkpagptgnvpviavgg301lgvgikdkdassayrpelpsapdtkcvvglhdntnadrdydtvnpeesalralvgsaekh361veisqqdlhatcppiakydvrlydtlakkiasgvkvrivvsdpanrgtvgsggysqiksl421teisdvlrnrlalvtggqdqaknalcsnvqlasfrsaksptwadghayplhhklvsvdgs481afyvgsknlypswlqdfgyivedrtaagqldakllapeweyaqdtaivdyqrgvcsl當前第1頁12