本發明涉及一種羊的長絨毛及其制備方法，屬于生物工程技術領域。
背景技術：
羊的絨毛是一種稀有的珍貴動物纖維，羊的長絨毛主要用于紡織行業，絨毛長度增長可以提高羊的產絨毛量并且在紡織過程中更便于加工。目前國內市場主要通過實際生產中提高絨山羊的營養和改善養殖條件或者尋找絨毛長度顯著增長的個體進行人工選育來培養絨山羊絨毛長度顯著增長的品種，但現有的人工選育方法增長效果不大明顯。因此，若想有效改善此問題，提高絨毛的利用率和紡織性能，生物工程手段是一種可嘗試的途徑，但利用基因改造手段使羊的絨毛長度顯著增長的方法目前并沒有被報道。
此外，目前并未明確對羊的絨毛長度起到重要作用的基因具體包括哪些基因，且現有的基因敲除的手段主要是rna干擾、同源重組、talen、crispr/cas9系統，存在因添加針對真核細胞的藥物篩選標記而導致的增加出生后動物耐藥性的風險，而且添加藥物篩選會增加細胞毒性影響胚胎后續的發育，造成克隆效率低，陽性克隆成活率低等缺點。
技術實現要素：
本發明的第一個目的是提供一種堿基缺失的基因fgf5，其基因序列如seqidno.1所示。
本發明的第二個目的是提供攜帶所述fgf5基因的載體或定點刪除fgf5基因片段的基因編輯細胞系。
在本發明的一種實施方式中，所述定點刪除fgf5基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。
本發明的第三個目的是提供一種羊的長絨毛，所述絨山羊的fgf5基因失活而使其絨毛顯著增長。
本發明的第四個目的是提供一種制備所述長絨毛的方法，是構建無標記基因的載體，經過體細胞核移植，制備失活seqidno.1所示fgf5基因的克隆羊，以獲得的克隆羊生產長絨羊毛。
在本發明的一種實施方式中，所述方法包括如下步驟：
(1)構建針對真核細胞的無熒光標記或藥物篩選標記的fgf5基因定點敲除載體；
(2)將該載體轉染f5代以內的絨山羊成纖維細胞，利用提高轉染效率、挑選單個細胞擴大培養，酶切鑒定，測序分析方法篩選出陽性克隆；
(3)利用體細胞核移植的方法將陽性細胞移植到去核卵細胞中，融合、激活、發育后移植到同期母羊體內相應部位；
(4).基因編輯絨山羊出生后在羊毛生長休止季節采集絨毛進行絨毛長度檢測；
(5)提取長度增長的絨毛基因，獲得目的基因。
本發明的第五個目的是提供一種生產所述長絨毛的羊的制備方法，所述方法是通過基因編輯技術制備攜帶堿基缺失fgf5基因的基因編輯羊。
本發明的有益效果為：
1、本發明提供了一種長度增長的羊絨毛，其絨毛長度達101.3mm，比現有技術增加了6.5mm；羊毛長度可達192.62mm，比現有技術增加了18.31mm，且傳代穩定，妊娠率達80％以上，比現有技術的8.7～25％提高了至少3倍。
2、本發明克服了現有技術的偏見，摒棄了在載體上攜帶藥物篩選標記或熒光標記的方法，設計了無藥物篩選和熒光標記基因的定點敲除fgf5基因的載體，獲得了羊絨羊毛都顯著增長的定點敲除fgf5基因的絨山羊，與現有的技術相比，本發明的優點是實現了安全、定點、100％敲除fgf5基因，相比于傳統育種方法篩選長絨山羊的長期性和不確定性，本方法更加省時、精準。與傳統基因編輯育種方法相比，本發明更加安全，高效，成活率更高。
附圖說明
圖1為本發明的重組質粒構建圖。
具體實施方式
實施例1合成無標記基因的載體
本研究對絨山羊fgf5的cdna序列共設計3個tale靶位點，并且這3個靶位點全部位于fgf5基因的第一外顯子上。即通過dna識別模塊將talen元件靶向特異性的dna位點并結合，在foki核酸酶的作用下完成表1中設計的位點的剪切，并借助于細胞內固有的同源定向修復(hdr)或非同源末端連接途徑(nhej)修復過程完成fgf5序列基因缺失。
表1talen質粒的靶位點
實施例2細胞轉染
培養絨山羊纖維細胞生長至對數期80-90％匯合時，收集細胞，以1-3×104個/孔的密度接種于primax轉染儀配套的24孔格式嵌入孔中。在室溫下靜置30min保證細胞均勻覆蓋孔底部，等量加入900ul新鮮細胞培養液到每個培養孔。確保在底部薄膜和培養液之間沒有任何氣泡存在，37℃，5％co2，飽和濕度的培養箱培養1d，細胞達到80-90％匯合時進行細胞轉染。電轉液：25mm的kcl+0.3mm的kh2po4+0.85mm的k2hpo4+36mm的myo-inositol，opti-memreducedserum1×。
質粒的準備：將構建完成后測序正確的質粒進行轉化，用無內毒素的質粒提取試劑盒提取質粒。
使用primax轉染儀進行電轉染，轉染好的細胞在室溫下靜置5-10分鐘，將dna溶液吸出，加入200ul的新鮮細胞培養液。更換新鮮細胞全培養液。37℃，5％co2，飽和濕度條件下培養，以轉染綠色熒光蛋白質粒的細胞作為對照組，以確定轉染是否成功，轉染后24-48小時觀察轉染效率，選擇對照組轉染效率達80％以上的組別進行下一步的單細胞擴大培養。
用自制的玻璃細管將細胞移入96孔板內，每孔確定為1個細胞。再將96孔板放入37℃、5％co2、飽和濕度條件下培養，每3天換一次細胞條件培養液(培養液中不含任何抗生素)，6-7天細胞生長至80-90％匯合后進行傳代培養。將擴大培養的細胞一部分凍存備用，另一部分用來提取基因組dna進行鑒定。
實施例3基因編輯篩選
將單個細胞擴大培養后一部分凍存，另一部分提取基因組dna后擴增pcr產物，測序pcr產物。測序所用的正向引物為tn000204-p1f，反向引物為tn000204-p2r。
pcr反應體系：
pcr反應程序：98℃3min；98℃15s；60℃20s(35個循環)；72℃1min；72℃10min；4℃∝。
將pcr產物純化、測序。根據測序結果，選擇堿基缺失的不是3的倍數(因為三個堿基編碼一個氨基酸，為了保證發生移碼突變，所以選擇不是3的倍數的缺失)的單克隆細胞系，將前期凍存符合條件的細胞解凍后擴大培養。
表2引物
利用體細胞克隆技術將篩選出的陽性單細胞系進行核移植，電融合后激活、發育培養后移植到受體母羊相應部位。基因編輯羊出生后取出生羔羊的臍帶組織分別提取基因組dna，按照talen質粒活性鑒定步驟中基因組擴增的方法制備測序所需的pcr產物。測序所用的正向引物為tn000204-p1，反向引物為tn000204-p2。經測序鑒定，4只新生羔羊的fgf5基因序列如seqidno.1所示，在靶標區域有兩個堿基的缺失，造成了fgf5基因的移碼突變。這個結果與talen基因編輯細胞系的鑒定結果一致。
在羊毛生長的休止季節分別取兩只基因編輯絨山羊肩胛部、體側部和股部羊毛，恒溫恒濕實驗室，濕度67％，溫度22℃，分別從肩胛部、體側部、股部的羊毛中隨機抽取120根羊毛和羊絨進行手扯長度測量，經由遼寧省畜牧科學研究院測定羊絨細度，所得的數據由spss與鄂爾多斯某羊場普通白絨山羊羊毛所得數據進行對比分析。
表3普通白絨山羊羊毛絨長度與基因編輯絨山羊羊毛絨長度的比較
利用spss進行t檢驗及標準偏差誤差線可得，p均小于0.01，即兩個樣本差異性極顯著。且利用talen技術獲得基因編輯絨山羊羊毛平均長度比普通白絨山羊羊毛長18.31mm。
表4普通白絨山羊羊毛絨長度與基因編輯絨山羊羊毛絨長度的統計學分析
利用spss進行t檢驗及標準偏差誤差線可得，p均小于0.01，即兩個樣本差異性極顯著。且利用talen技術獲得基因編輯絨山羊絨毛平均長度比普通白絨山羊絨毛長6.5mm
實施例4
分別采用rna干擾技術和同源重組方法制備fgf5基因缺失的絨山羊。其結果與上述實例1-3利用talen載體使fgf5基因失活，且無藥物和熒光篩選的方法進行比較。
具體步驟為：
1、構建rna干擾載體，載體上包含綠色熒光標記和neo藥物篩選標記，轉染和構建fgf5基因突變的細胞系步驟同實施例2，其區別在于在篩選陽性細胞時加入藥物g418實驗結果見表5
2、構建同源重組載體，載體上包含綠色熒光標記和neo、hsv-tk藥物篩選標記，轉染和構建fgf5基因突變的細胞系的步驟同實例2，區別在于在篩選陽性細胞時加入g418和ganc藥物。出生后的基因編輯羊絨毛長度檢測方法如實例4。實驗結果比較見表5表6表7.
從表5可以看出三種方法中，采用rna干擾加藥物篩選生產長絨毛羊的方法雖然妊娠率達到16.78％，但胎兒無法順利發育導致流產，無法獲得成活的fgf5基因缺失羊。而利用同源重組載體+藥物篩選+熒光篩選標記生產長絨毛羊的方法妊娠率達到8.7％，成活率達僅到25％，這與細胞篩選過程中加入藥物有很大關系，而實施例1-3的方法制備的胎兒成活率最高，達到80％。
表5目的基因敲除效率比較
表6普通白絨山羊羊毛長度與fgf5基因缺失的絨山羊羊毛長度的比較
利用spss進行t檢驗及標準偏差誤差線可得，p均小于0.01，即兩個樣本差異性極顯著。且利用talen技術獲得轉基因絨山羊羊毛長度比普通白絨山羊羊毛長18.31mm，同源重組方法獲得轉基因絨山羊羊毛長度比普通白絨山羊羊毛長14.1206mm。
表7普通白絨山羊羊絨長度與fgf5基因缺失的絨山羊羊絨長度的比較
利用spss進行t檢驗及標準偏差誤差線可得，p均小于0.01，即兩個樣本差異性極顯著。且利用talen技術獲得轉基因絨山羊羊絨長度比普通白絨山羊羊絨長6.5mm，同源重組的方法獲得長絨毛山羊羊毛長度比普通白絨山羊羊絨長2.475mm。出生的fgf5基因失活的山羊均達到羊絨毛增長的目的。
雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。
sequencelisting
<110>內蒙古農業大學
<120>一種羊的長絨毛及其制備方法
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