本發明涉及一種異斯特維醇衍生物及其制備方法與抗腫瘤作用，屬藥物化學領域。
背景技術：
天然產物是藥物的先導化合物和功能有機分子的重要來源，從天然產物中篩選出藥物先導化合物一直是新藥研發的有效途徑。盡管很多天然產物具有一定的生物活性，然而卻因為毒副作用強、活性差或者生物利用度低而限制了其臨床應用。因此，對天然產物進行有效的結構修飾引入特殊的藥效基團，得到新型衍生物，從而提高其活性和利用度、降低毒性是開發新型天然藥物的有效方案。在自然界中種類繁多的活性天然產物中，萜類化合物存在廣泛，具有結構復雜、種類繁多、生物活性多樣性等特點，是尋找天然藥物的有效途徑，如青蒿素、紫杉醇、穿心蓮內酯等臨床常用藥物都是從植物中提取分離的萜類化合物。二萜類化合物是除倍半萜外所發現的結構多樣、類型最豐富的萜類天然產物。
異斯特維醇(異甜菊醇，isosteviol)是由天然產物甜菊糖經酸性水解得到的斯特維醇重排的產物。研究表明其在抗癌、抗菌、心肌損傷修復、抗病毒和降血糖等方面表現出一定的生物活性。其中，其抗腫瘤活性的研究最為活躍。專利cn102718657(式4)報道了含有α,β-不飽和酮(α-亞甲基環戊酮)結構片段的異斯特維醇衍生物(r1為乙酰氧基或羥基，r2為乙基、丙基、異丙基、芐基、正丁基、仲丁基或異丁基)，所有的酯化基團r2為烷基、芳基，酯化取代基上沒有極性基團的引入。
論文(bioorganic&medicinalchemistryletters21(1):130-132)報道了一種含有α,β-不飽和酮類衍生物(式6)，活性測試結果表明這些改造都很大地提高了異斯特維醇母體化合物的抗腫瘤活性，然而該研究只有芐酯一種取代基。kataev等報道了(pharmaceuticalchemistryjournal44(11):597-600)在異斯特維醇骨架上引入季銨鹽結構片段(式5)。活性研究發現引入季銨鹽結構能顯著提高抗菌活性，效果優于陽性藥克霉唑和環丙沙星，然而該研究只考察了乙撐季銨鹽類酯，并且不含α-亞甲基環戊酮結構，也沒有考察抗腫瘤活性。
考慮到異斯特維醇本身的活性較低，溶解性差，所以很多研究通過結構改造改善這些因素以期提高活性。在已發現的二萜類天然產物中，α,β-不飽和酮被證明是一類關鍵的藥效基團，通過和腫瘤細胞中的巰基酶發生作用而具有較好的細胞毒性。另外，極性基團的引入會增加疏水的四環二萜類化合物的溶解性以及與靶分子的結合力從而提高生物利用度和生物活性。因此，對異斯特維醇進行結構改造，并通過體外抗腫瘤活性測試篩選出具有應用價值的先導分子具有重要意義。
技術實現要素：
本發明的目的是將α,β-不飽和酮片段引入到異斯特維醇d-環上，并通過羧基改造引入不同的酯代基團，合成出含有α,β-不飽和酮片段和鹵代烷基和季銨鹽類等極性片段的新型異斯特維醇衍生物另一目的是提供該類化合物的合成方法及其在抗腫瘤性能方面的應用。
為實現本發明的目的，本發明以異斯特維醇為原料制備目標化合物，在具體操作步驟中對反應底物、催化劑、溶劑、試劑、反應時間以及純化方法等進行了實驗和優化，找到了操作方便，收率較高，選擇性較好，反應條件溫和的合成方法，并研究了化合物的抗腫瘤性能。
本發明采用的技術方案如下：
1.本發明提供一種式1和式2所示的異斯特維醇化合物。
n＝1-6。
進一步，所述異斯特維醇化合物優選為下列之一：
2.本發明提供一種所述異斯特維醇衍生物的合成方法，所述反應過程如下：
具體方法如下：
(1)有機溶劑中，異斯特維醇1和甲醛在堿性條件下發生反應，反應結束后蒸干溶劑，體系加水后加酸酸化，得到15α-羥甲基-16β-羥基異斯特維醇2；
所述有機溶劑采用甲醇、乙醇、異丙醇或叔丁醇；堿選用乙醇鈉、甲醇鈉、叔丁醇鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、1,8-二氮雜二環十一碳-7-烯(dbu)或4-二甲氨基吡啶(dmap)；
(2)化合物2和對甲苯磺酰氯于有機溶劑中反應，dmap作催化劑反應得到化合物3；
所述的有機溶劑選二氯甲烷、四氫呋喃(thf)、乙腈、氯仿、甲苯、1,2-二氯乙烷；
所述化合物2與對甲苯磺酰氯的摩爾比為1:1.1～2.5，優選1:2；
(3)于有機溶劑中，化合物3和氧化劑在室溫下反應，反應結束后過濾除去固體雜質，濾液蒸干，柱層析得到化合物4；
所述氧化劑采用重鉻酸吡啶鎓(pdc)、氯鉻酸吡啶鎓鹽(pcc)、二氧化錳、戴斯-馬丁氧化劑(dmp)或二甲基亞砜(dmso)；有機溶劑選用二氯甲烷、乙腈、二氧六環或四氫呋喃；
(4)化合物4在吡啶中回流得15-亞甲基化合物5；
(5)有機溶劑中，堿性條件下，化合物5與二溴代烷反應，待反應完全后，蒸去乙腈，加入水，萃取，合并有機相后洗滌，分出有機相，干燥，過濾后減圧蒸餾，得產品化合物6；
所述二溴代烷為1,2-二溴乙烷，1,3-二溴丙烷，1,4-二溴丁烷或1,6-二溴己烷；
有機溶劑選用乙腈、dmso、n,n-二甲基甲酰胺(dmf)、二氧六環、四氫呋喃或二氯甲烷；堿選用氫氧化鉀、氫氧化鈉、碳酸鉀、碳酸鈉、吡啶、三乙胺、dmap或二異丙基乙胺。
化合物5與二溴代烷的摩爾比為0.8～1:1～1.5，優選1:1；
(6)溴代酯化產物6和三甲胺于有機溶劑中30～100℃條件下密閉反應(4～10小時)，得到化合物7；優選65℃，優選8小時。
所述有機溶劑選用乙腈、dmso、dmf、二氧六環、四氫呋喃、二氯甲烷、甲醇或乙醇。
化合物6與三甲胺的摩爾比為1:1.5～3，優選1:2.3，三甲胺為三甲胺水溶液。
3.本發明還提供所述的異甜菊醇化合物在抑制人食管癌細胞株ec109、人胃癌細胞株mgc803和人前列腺癌細胞株pc-3活性中的應用。
與現有技術相比本發明具有如下優點：
1.本發明提供了一種新型的含有α-甲基環戊酮和溴代烷基酯或季銨鹽等極性基團的新型衍生物；
2.本發明提供的異斯特維醇化合物具良好有抗腫瘤活性，為新藥篩選提供研究基礎和先導化合物，具有較好應用前景；
3.本發明異斯特維醇化合物制備流程簡單，原料廉價易得，反應條件溫和，后處理簡單，收率高，達79％以上，溶劑可回收利用，利于產業化生產。
具體實施方式
為了更好地實施本發明，現舉實施例對本發明作進一步說明，但是這些實施例僅是用于說明本發明，但實施例不是對本發明的限制。
實施例1化合物2和3的制備
取250ml無水乙醇置于500ml反應瓶中，加入6.0g的金屬鈉，待金屬鈉完全反應后，加入9.8g化合物1，磁力攪拌，體系升溫至50℃，再加入20ml甲醛水溶液，繼續反應3小時至tlc跟蹤反應結束。將反應體系倒入500ml蒸餾水中，體系用稀鹽酸調節ph至5，體系中有大量白色絮狀沉淀，抽濾干燥得10g化合物2的粗品，不經分離純化，直接用于下一步反應。取4.5g化合物2粗品，置于100ml反應瓶中，加30ml吡啶溶解后，在攪拌狀態下加入對甲苯磺酰氯3.6g和dmap60mg，室溫下反應3小時。待反應完全后，蒸去吡啶，加入50ml水，用質量百分比10％鹽酸調節體系ph至5-6。3×30ml乙酸乙酯萃取，合并有機相，飽和食鹽水洗滌，分出有機相無水硫酸鈉干燥，過濾后減圧蒸餾，得黃色油狀液體。硅膠柱色譜(石油醚/乙酸乙酯3:1)分離，得白色固體3。收率：84％。1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ7.70(d,j＝8.3hz,2h),7.35(d,j＝8.1hz,2h),4.21(dd,j＝9.6,4.5hz,1h),4.15(dd,j＝9.6,2.3hz,1h),2.12(dd,j＝31.8,14.0hz,2h),1.93-1.86(m,1h),1.83(dd,j＝11.9,2.3hz,1h),1.80-1.75(m,1h),1.74-1.56(m,4h),1.49-1.37(m,3h),1.35-1.18(m,9h),1.12(ddd,j＝17.4,13.4,4.5hz,2h),0.96(d,j＝6.6hz,1h),0.92(s,3h),0.86(ddd,j＝12.0,9.1,6.0hz,1h),0.74(s,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3,ppm)δ184.15,145.00,132.62,129.96,129.96,128.00,128.00,83.84,72.25,57.33,56.78,53.82,47.85,43.46,42.99,40.79,39.25,38.33,37.58,34.47,32.93,28.69,24.85,21.79,21.64,19.53,18.67,12.65.。
實施例2化合物4的制備
取3.5g化合物3，置于50ml反應瓶中，加20ml二氯甲烷溶解，冰浴下攪拌10分鐘，加入1.88gpdc氧化劑，室溫下反應3小時。tlc檢測反應完畢后以硅藻墊過濾體系，濾餅用30ml二氯甲烷洗滌，濃縮濾液得粗品。硅膠柱色譜(石油醚/乙酸乙酯3:1)分離，得白色粉末狀固體。收率：76％。
1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ7.70(d,j＝8.3hz,2h),7.35(d,j＝8.1hz,2h),4.21(dd,j＝9.6,4.5hz,1h),4.15(dd,j＝9.6,2.3hz,1h),2.45(s,3h),2.12(dd,j＝31.8,14.0hz,2h),1.89(d,j＝13.9hz,1h),1.83(dd,j＝11.9,2.3hz,1h),1.78(dd,j＝11.2,2.8hz,1h),1.73-1.56(m,5h),1.46(d,j＝14.4hz,1h),1.41-1.33(m,1h),1.30(s,3h),1.28-1.19(m,4h),1.18-1.05(m,2h),0.92(s,3h),0.90-0.84(m,1h),0.74(s,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3,ppm)δ220.62,183.70,144.96,132.22,129.85,129.85,128.06,128.06,60.43,56.99,56.87,52.82,51.18,48.05,43.62,40.50,39.55,38.39,37.60,37.11,34.97,28.92,21.69,21.41,19.59,19.51,18.73,13.20.
實施例3化合物5的制備
取440mg化合物4，置于25ml反應瓶中，加5ml吡啶溶解，再加80mgdmap，加熱回流3小時。薄層色譜檢測反應完全后蒸去吡啶，加入10ml水，用質量百分比10％鹽酸調節體系ph至5-6，3×10ml乙酸乙酯萃取，合并有機相后飽和食鹽水洗滌有機相，分出有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾后減圧蒸餾，得黃色油狀液體。硅膠柱色譜(石油醚/乙酸乙酯3:1)分離，得白色固體。收率：77％。
1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ6.06(s,1h),5.48(s,1h),2.20-2.06(m,2h),1.97(d,j＝3.3hz,1h),1.94(dd,j＝6.0,2.8hz,1h),1.78(dd,j＝17.4,3.4hz,1h),1.70(dd,j＝7.9,3.0hz,2h),1.67(d,j＝3.6hz,1h),1.49(ddd,j＝13.8,7.3,4.0hz,2h),1.43-1.37(m,2h),1.31-1.12(m,7h),1.04(dd,j＝13.5,4.0hz,1h),1.00(s,3h),0.86(td,j＝13.1,3.9hz,1h),0.67(s,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3,ppm)δ39.42,18.63,37.44,43.92,56.42,38.02,30.22,54.23,20.77,36.56,49.70,60.65,152.91,208.81,28.01,183.20,114.32.
實施例4化合物6a～6d合成的通用方法
取5mmol化合物5，置于50ml反應瓶中，加30ml乙腈溶解，在攪拌狀態下加入8mmol碳酸鉀，隨后加入5mmol的二溴代烷，室溫下反應4小時。待反應完全后，蒸去乙腈，加入30ml水，3×15ml乙酸乙酯萃取，合并有機相后飽和食鹽水洗滌，分出有機相，無水硫酸鈉干燥，過濾后減圧蒸餾，得白色固體。硅膠柱色譜(石油醚/乙酸乙酯8:1)分離，得白色固體。
化合物6a：收率：81％。1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ6.04(s,1h),5.51(s,1h),4.44-4.30(m,2h),3.52(t,j＝5.7hz,2h),2.19(dd,j＝13.2,1.2hz,1h),2.17-2.08(m,1h),2.03-1.90(m,2h),1.82-1.57(m,3h),1.54-1.37(m,5h),1.34-1.28(m,1h),1.31-1.20(m,1h),1.29-1.14(m,3h),1.17(ddd,j＝18.7,12.8,7.5hz,2h),1.09-0.98(m,1h),1.02(s,hz,3h),0.86(td,j＝13.3,4.3hz,1h),0.62(s,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3,ppm)δ210.83,177.12,154.45,116.20,64.12,57.00,56.77,53.54,46.85,44.16,43.86,40.49,38.80,38.23,38.16,37.93,29.22,29.12,21.95,21.12,20.23,19.03,12.59.hrms(esi,m/z)calcd.forc23h33brnao3,[m+na]+459.1511,found459.1511.
化合物6b：收率：80％。1hnmr(400mhz,cdcl3,ppm)δ6.04(s,1h),5.44(s,1h),4.23-4.10(m,2h),3.48(t,j＝6.5hz,2h),2.20-2.13(m,3h),2.11-1.91(m,3h),1.81-1.62(m,5h),1.55-1.48(m,1h),1.47(dd,j＝8.6,2.7hz,1h),1.45-1.39(m,3h),1.29(dd,j＝12.8,3.7hz,1h),1.21(s,3h),1.18-1.14(m,1h),1.05(dd,j＝13.5,4.0hz,1h),1.00(s,3h),0.85(td,j＝12.8,3.5hz,1h),0.60(s,3h).13cnmr(101mhz,cdcl3,ppm)δ210.77,177.18,154.53,116.05,61.98,56.96,56.75,53.51,46.86,44.08,43.86,40.49,38.77,38.20,38.12,37.93,31.60,29.70,29.15,21.96,21.11,20.23,19.12,12.56.hrms(esi,m/z)calcd.forc24h35brnao3,[m+na]+473.1667,found473.1666.
化合物6c：收率：80％。1hnmr(400mhz,dmso,ppm)δ5.90(s,1h),5.37(s,1h),4.00-3.90(m,2h),3.52(t,j＝6.6hz,2h),2.08-1.97(m,2h),1.89(dd,j＝18.3,7.5hz,2h),1.83-1.75(m,2h),1.67-1.60(m,2h),1.61-1.55(m,3h),1.53-1.48(m,2h),1.38(d,j＝3.5hz,2h),1.36(s,1h),1.34(d,j＝2.4hz,1h),1.33(d,j＝5.2hz,1h),1.24(dd,j＝11.9,1.9hz,1h),1.16(s,3h),1.02(td,j＝13.7,4.6hz,2h),0.92(s,3h),0.85(dd,j＝13.2,3.6hz,1h),0.54(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso,ppm)δ209.82,176.97,155.04,115.43,64.16,56.19,55.90,52.79,46.57,43.81,43.75,38.60,37.93,37.56,35.49,32.56,28.93,28.33,27.56,25.33,21.93,21.05,20.42,19.04,12.48.hrms(esi,m/z)calcd.forc25h37brnao3,[m+na]+487.1824,found487.1822.
化合物6d：收率：79％。1hnmr(400mhz,dmso,ppm)δ5.90(s,1h),5.40(s,1h),4.05-3.96(m,2h),3.57(t,j＝6.6hz,2h),2.03(dd,j＝22.9,8.5hz,2h),1.97-1.90(m,2h),1.86(d,j＝6.4hz,2h),1.69(ddd,j＝13.7,11.0,5.1hz,6h),1.64-1.54(m,4h),1.55-1.46(m,3h),1.40-1.30(m,3h),1.25(dd,j＝12.0,2.3hz,1h),1.17(s,3h),1.10-0.97(m,2h),0.90(d,j＝16.9hz,3h),0.86(dd,j＝12.6,4.3hz,1h),0.54(s,3h).13cnmr(101mhz,dmso,ppm)δ209.82,176.93,154.95,115.62,63.57,56.19,55.88,52.80,46.56,43.81,43.74,38.60,37.96,37.92,37.56,35.09,32.56,29.73,28.91,28.31,27.33,25.35,21.94,21.05,20.43,19.04,12.47.hrms(esi,m/z)calcd.forc27h41brnao3,[m+na]+515.2137,found515.2133.
實施例5化合物7的合成
取220mg化合物6b，置于15ml密封反應容管中，5ml乙腈溶解，加1ml三甲胺水溶液，密閉體系于65℃反應8小時。待反應完全后，減壓蒸去溶劑，得黃色固體，硅膠柱色譜(二氯甲烷/甲醇10:1)分離，得白色結晶。收率：85％。
1hnmr(400mhz,meod,ppm)δ6.02(s,1h),5.52(s,1h),4.84(s,4h),4.16(dd,j＝17.5,11.3,6.2hz,2h),3.29(d,j＝51.1hz,9h),2.31-2.15(m,3h),2.10(dd,j＝19.0,5.3hz,2h),1.99(dt,j＝13.5,3.1hz,1h),1.74(d,j＝4.3hz,1h),1.69(d,j＝6.6hz,2h),1.55(d,j＝11.2hz,2h),1.44-1.37(m,3h),1.31(dd,j＝11.4,3.5hz,2h),1.27(s,3h),1.23-1.06(m,2h),0.98(s,3h),0.65(s,3h).13cnmr(101mhz,meod,ppm)δ212.70,178.50,156.38,116.61,65.15,62.09,57.76,57.62,54.30,53.80,53.76,53.72,47.87,45.11,45.06,41.33,39.76,s39.07,38.89,38.86,29.40,23.81,23.12,22.14,20.47,20.14,13.18.hrms(esi,m/z)calcd.forc27h43no3,[m-br]+430.3237,found430.3239.。
實施例6癌細胞體外抑制活性測試
人食管癌細胞eca109、前列腺癌細胞pc-3、人胃癌細胞株mgc803分別用含質量百分比10％胎牛血清、100ku·l-1青霉素-鏈霉素、dmem(dulbecco'smodifiedeaglemedium)高糖培養基在37℃，體積分數5％co2條件下培養。細胞存活率用mtt染色法測定。mtt在活細胞線粒體脫氫酶作用下，發生還原反應，生成紫色formazane結晶，溶于二甲亞砜(dimethylsulfoxide,dmso)中顯紫藍色，在490nm處有較大光吸收a490。
取對數生長期的相應的細胞株，將細胞濃度分別調為4×104ml-1，5×104ml-1，3×104ml-1和4×104ml-1加入96孔板中，每孔200μl，然后加入一定體積的不同濃度的待測化合物(化合物6a～6d和7，dmso助溶，dmso在培養體系的終濃度小于0.02％)，陽性對照組為等體積的5-fu，陰性對照組為等體積含質量百分比0.02％dmso的胎牛血清。每個濃度各設5個平行組。在37℃，體積分數5％co2培養箱中孵育72h后，分別加入mtt5g·l-1，每孔15μl，繼續培養4h，棄去上清液，然后加入dmso溶解，每孔150μl，37℃恒溫孵育10min，然后在spectramaxi3酶標儀上測出a490。spss19.0軟件處理所測得的a490數據，得各化合物的ic50。
表1化合物對癌細胞株的ic50(μg/ml)
從表中可以看出，15-位甲基的引入能提高異斯特維醇母體化合物的抗腫瘤活性，并且異斯特維醇羧基的酯化也對其生物活性有著關鍵影響。溴代單酯化合物表現出了較好的細胞毒活性。其中化合物6d對三組癌細胞株都表現出較好的抑制活性，尤其是對pc-3和mgc803細胞株的抑制活性分別低達1.826和11.894，優于陽性藥5-fu。季銨鹽衍生物7活性較弱，只對ec109表現出一定的抑制活性。