桑脈帶病毒的RT?LAMP檢測方法及其引物組、試劑盒以及應用與流程

本發明屬于桑脈帶病毒檢測領域，尤其涉及一種桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法及其引物組、試劑盒以及應用。

背景技術：

在國家實施“東桑西移”產業結構調整戰略和東部地區產業轉移等因素推動下，廣西桑蠶產業自“十五”以來迅猛發展，從2005年以來，廣西蠶繭產量已連續12年居全國第一。桑蠶業的迅猛發展為廣西農民增收、農業增效、縣域經濟大發展和新農村建設作出了重要貢獻，也已成為廣西的新興優勢產業，更是部分地區的主要支柱產業。然而，桑樹病毒病在廣西桑蠶區發生嚴重，發生率為40％左右，個別桑園發病率甚至達到80％，已成為廣西桑樹的主要病害之一，嚴重影響了廣西桑蠶業的發展。

桑脈帶病毒(mulberryveinbandingvirus,mvbv)是廣西桑樹病毒病主要病原，該病毒是番茄斑萎病毒屬(tospovirus)新成員，與西瓜銀色斑駁病毒血清型病毒具有較近的親緣關系。然而，由于桑脈帶病毒是近年新發現的侵染桑樹的病毒，尚未建立系統的檢測方法，有必要開發一種快速、準確的mvbv檢測方法，以滿足桑蠶產業需求。

目前檢測植物病毒的方法主要是反轉錄聚合酶鏈式反應(rt-pcr)和酶聯免疫吸附法(elisa)，這兩種方法均存在不足：rt-pcr需要購買專業的pcr儀，且反應時間較長；elisa需要制備高質量的病毒血清，檢測時間亦長，且靈敏度相對分子生物學方法低。此外，番茄斑萎病毒屬(tospovirus)成員中，如果其n蛋白的同源性高，氨基酸水平一致性達到50％，采用elisa檢測還會出現交叉反應，產生假陽性的結果。

環介導等溫擴增技術(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)技術是日本學者notomi在2000年建立的一種核酸擴增方法，該方法具有檢測速度快、靈敏度高、無需專業儀器等優點。rt-lamp檢測是在lamp檢測的基礎上加入反轉錄酶，把反轉錄與靶基因擴增結合，在60-65℃溫度進行反應，反應結束后通過加入熒光染料即可觀察到結果。目前rt-lamp已經廣泛運用到人類、動/植物病毒的檢測和快速診斷。

技術實現要素：

本發明要解決的技術問題是提供一種快速、靈敏、簡便的桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法及其引物組、試劑盒以及應用。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

桑脈帶病毒的rt-lamp檢測引物組，包括外側引物對mvbv-f3和mvbv-b3、內側引物對mvbv-fip和mvbv-bip，它們分別具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的堿基序列。

上述桑脈帶病毒的rt-lamp檢測引物組在檢測桑脈帶病毒方面的應用。

桑脈帶病毒的rt-lamp檢測試劑盒，包括rt-lamp檢測引物組、rt-lamp反應液、酶溶液和核酸熒光染料；rt-lamp檢測引物組包括外側引物對mvbv-f3和mvbv-b3、內側引物對mvbv-fip和mvbv-bip，它們分別具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的堿基序列。

rt-lamp反應液含有20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100(ph8.8)，1mbetaine，10mmdntps。

酶溶液含有bstdna聚合酶和amv逆轉錄酶。

核酸熒光染料為sybrgreenⅰ(10000×)。

上述桑脈帶病毒的rt-lamp檢測試劑盒，還包括陽性對照和陰性對照；陽性對照為感染mvbv的桑葉組織，陰性對照為健康桑葉組織。

上述桑脈帶病毒的rt-lamp檢測試劑盒在檢測桑脈帶病毒方面的應用。

桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法，以待測樣品的總rna為模板，利用rt-lamp檢測引物組進行rt-lamp擴增反應，以檢測待測樣品是否感染桑脈帶病毒；rt-lamp檢測引物組包括外側引物對mvbv-f3和mvbv-b3、內側引物對mvbv-fip和mvbv-bip，它們分別具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.4的堿基序列。

rt-lamp擴增反應的反應體系和反應條件分別為：

反應體系：共25μl，包含以下組分：rt-lamp反應液12.5μl，酶溶液1μl，濃度20μm的mvbv-fip、mvbv-bip各2μl，濃度20μm的mvbv-f3、mvbv-b3各0.5μl，模板2μl，加rnasefreeh2o至25μl，反應結束加入1μl核酸熒光染料(稀釋10倍)；

反應條件：在63℃恒溫下，擴增60min，80℃，反應5min使酶失活

本發明采用環介導等溫擴增(lamp)技術，并根據桑脈帶病毒的基因序列設計了相應的rt-lamp檢測引物組，包括外側引物對mvbv-f3和mvbv-b3、內側引物對mvbv-fip和mvbv-bip。由此發明了桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法及試劑盒。本發明是檢測桑脈帶病毒的首個rt-lamp檢測方法，應用本發明的檢測方法及試劑盒，僅需通過對疑似感染的待測樣品進行rna提取并進行環介導等溫擴增，一步完成逆轉錄和擴增步驟，反應結束后加入核酸熒光染料，直觀地根據反應液顏色變化判斷，若反應液顯綠色，則判斷為陽性；若反應液為橙色，則判斷為陰性；因而可能快速、準確、高效地檢測出是否感染桑脈帶病毒。總之，本發明用于檢測桑脈帶病毒具有特異性強、操作簡單和靈敏度高的特點，不需要專門儀器，能通過肉眼觀察顏色變化即可判定結果，無需電泳和紫外觀察等步驟，適用于桑苗繁育和田間桑樹上mvbv的檢測，不僅可應用于桑脈帶病毒病的早期診斷、流行學等研究，而且適合于在基層單位開展mvbv檢測。

附圖說明

圖1是rt-lamp產物可視化圖分析圖，圖中：1攜帶mvbv桑葉樣品(rt-pcr檢測確定含有mvbv的樣品，陽性對照)，2健康桑葉樣品(rt-pcr檢測確定不含有mvbv的樣品，陰性對照)。

圖2是rt-lamp特異性分析圖，圖中：1表現為典型脈帶癥狀的桑葉樣品，2番茄環紋斑點病毒(tomatozonatespotvirus,tzsv)樣品，3朱頂紅褪綠環斑病毒(hippeastrumchloroticringspotvirus，hcrv)樣品。

圖3是rt-lamp靈敏度可視化結果分析圖，圖中：1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、陰性對照(健康桑葉樣品)。

圖4是rt-lamp靈敏度電泳結果分析圖，圖中：m：generuler1kbplusladder；1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、陰性對照(健康桑葉樣品)。

圖5是rt-pcr靈敏度電泳結果分析圖，圖中：m：generuler1kbplusladder；1、10ng，2、1ng，3、100pg，4、10pg，5、1pg，6、100fg，7、10fg，8、陰性對照(健康桑葉樣品)。

圖6是rt-lamp檢測田間桑病樣檢測結果分析圖，圖中：1陰性對照；2陽性對照；3-8田間樣品。

具體實施方式

實施例1mvbvrt-lamp檢測試劑盒的制備

1.1試劑

引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；植物總rna提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；bstdna聚合酶及其反應緩沖液購自newenglandbiolabs(neb)公司，amv逆轉錄酶購自promega公司，核酸熒光染料為sybrgreenⅰ(10000×)購自上海索萊寶生物科技有限公司，betaine購自生工生物工程(上海)股份有限公司，dntps購自寶生物工程(大連)有限公司(takara)。引物組保存于-20℃冰箱，其他試劑按照對應產品說明書描述的條件進行保存條件。

1.2試劑盒的組裝

試劑盒包含rt-lamp引物組、rt-lamp反應液、酶溶液和核酸熒光染料。

rt-lamp引物組：包括外側引物對mvbv-f3(seq.id.no.1)和mvbv-b3(seq.id.no.2)、內側引物對mvbv-fip(seq.id.no.3)和mvbv-bip(seq.id.no.4)。

rt-lamp反應液含有20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100(ph8.8)，1mbetaine，10mmdntps。

酶溶液：8單位(u)的bstdna聚合酶和2單位的amv逆轉錄酶

核酸熒光染料：sybrgreenⅰ(10000×)。

陽性對照：含有mvbv的顯癥桑葉。

陰性對照：不含有mvbv的健康桑葉(經rt-pcr方法檢測確認)。

實施例2rt-lamp檢測方法檢測mvbv及其特異性

檢測樣品3份，其中顯癥桑葉1份、被番茄環紋斑點病毒(tzsv)侵染的煙草樣品1份和被朱頂紅褪綠環斑病毒感染的水鬼蕉1份。

采用實施例1的試劑盒進行檢測，檢測方法包括以下步驟：

(1)提取待測樣品總rna：利用天根生化科技(北京)有限公司總rna提取試劑盒提取待測樣品總rna。

(2)建立rt-lamp反應體系：在薄壁pcr管中建立25μl的反應體系：rt-lamp反應液12.5μl，酶溶液1μl，外側引物mvbv-f3、mvbv-b3各0.5μl(20μm)，內側引物mvbv-fip、mvbv-bip各2.0μl(20μm)，步驟1獲得的總rna模板2μl，加rnasefreeh2o至25.0μl；含有mvbv的桑葉的總rna為對照，健康桑葉的總rna為陰性對照。

(3)rt-lamp反應的條件：在63℃恒溫條件下，擴增60min，在80℃條件下反應5min使酶失活；

(4)分析判斷反應結果：反應結束，在步驟“(3)”獲得的反應液中加入1μl核酸熒光染料sybrgreenⅰ(10000×)(稀釋10倍)，若為反應液顏色為綠色則判定為陽性反應，為橙色則判定為陰性反應。

如圖1所示，rt-lamp反應的結果顯示，陽性對照的反應液變為綠色，而陰性對照的反應液保持橙色不變，表明檢測能正常檢測出目標病毒mvbv。圖2顯示，待測顯癥桑葉樣品的反應液變為綠色，而煙草番茄環紋斑點病毒(tzsv)樣品和朱頂紅褪綠環斑病毒的反應液保持橙色不變，說明rt-lamp僅檢測出目標mvbv，不能檢測出同一血清型的番茄環紋斑點病毒(tzsv)和同屬的朱頂紅褪綠環斑病毒，表明引物具有較強的特異性。

實施例3mvbvrt-lamp檢測方法的敏感性試驗

按照實施例2提取的含有mvbv的桑病葉組織的總rna，利用微量分光光度計測其濃度，取總rna濃度為10ng/μl的核酸模板進行檢測。按照10倍比例進行稀釋后用作模板，共設10ng/μl、1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl和10fg/μl共7個梯度。分別進行rt-lamp檢測和常規rt-pcr檢測，rt-lamp檢測步驟同實施例2中的(2)-(4)。

rt-pcr檢測：采用對應的總rna作為模板，rt-pcr反應擴增體系按諾唯贊生物科技有限公司的一步法rt-pcr試劑盒說明進行，反應體系組成為：2×onestepmix25μl，onestepenzymemix2.5μl，上游引物mvbv-n-f(10μm)1μl、下游引物mvbv-n-r(10μm)1μl，模板1μl，加水至50μl。反應條件為：50℃反轉錄30min；94℃預變性3min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸55s，35個循環；72℃終延伸7min。反應條件為：50℃反轉錄30min；94℃預變性3min；94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸55s，35個循環；72℃終延伸7min；4℃保存。取1.0μlpcr產物進行1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

rt-pcr的引物序列如下：

mvbv-n-f：5'-atgtctaccgtccgtcagctg-3'(seq.id.no.5)，

mvbv-n-r：5'-acttctatagaattagaagtgcttgg-3'(seq.id.no.6)。

結果顯示，使用rt-lamp方法檢測，當模板含量為100fg時，反應液呈綠色(陽性反應)，電泳時條帶清晰可見(圖3、圖4)；使用rt-pcr方法檢測，采用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測rt-pcr擴增產物，當模板含量為1pg時，擴增條帶較弱；當模板含量為100fg時，已無明顯的可見特性條帶(圖5)。本發明的rt-lamp檢測方法比常規rt-pcr檢測方法的靈敏度高10倍。

實施例4mvbvrt-lamp的檢測試劑盒的應用

采集桑樹樣品，包含顯癥樣品、可能攜帶mvbv隱癥樣品和健康無mvbv樣品為試驗材料，桑脈帶病毒rt-lamp檢測試劑盒及檢測方法同實施例1和案例2。將所提取的桑葉組織總rna作為模板，進行rt-lamp檢測。rt-lamp檢測結果如圖6所示，6份待測桑葉樣品中，3、5、7、8號樣品顯示為綠色，表明這4個樣品中含有病毒，4、6號樣品顯示為橙色，表明這2個樣品中沒有病毒樣品。其中3號樣品為無癥狀的隱癥樣品，說明rt-lamp方法檢測到隱癥樣品中的目標病毒。

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<110>廣西大學

<120>桑脈帶病毒的rt-lamp檢測方法及其引物組、試劑盒以及應用

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