本發明涉及一種吡唑二苯基脲類衍生物及其制備方法和用途。
背景技術：
吡唑是一類含有兩個處于相鄰位置氮原子的五元雜環，因結構的可塑性較高且具有高效廣譜的生物活性：抗菌、抗腫瘤、抗驚厥、抗炎等。自從對阿霉素改造后的蒽吡唑類絡索蒽醌對乳腺癌和轉移性乳腺癌有良好的治療效果(seminoncol.(1992).19(6):687-94)。研究人員設計了大量的吡唑衍生物，且從中篩選出許多高抑腫瘤活性化合物。吡唑肽類化合物對肺癌細胞a549的抑制活性較好(bioorg.med.chem.lett.,2012,22,6882-6887)。4-吡唑-1,8-萘酰亞胺衍生物對人乳腺癌細胞、人宮頸癌細胞、和肺癌細胞都表現出了良好的抑制活性。
脲衍生物如芳香脲，雜環脲，和硫脲通常是一種最有效的抗癌劑，對多種白血病和實體瘤都具有活性(cancerres.2002,62(21),6080-6088)。含有1h--吡咯并[3,2-c]吡啶的二芳基脲類衍生物對(a375p)人黑素瘤細胞系和(nci-9)人黑素瘤細胞系細胞系的體外抗增殖活性，表現出了比索拉菲尼更好的抗a375p活性(europeanjournalofmedicinalchemistry45(2010)2928-2937)。雜環脲衍生物通過對受體酪氨酸激酶(rtk)，raf激酶，蛋白質酪氨酸激酶(ptk)和nadh氧化酶(在腫瘤產生的許多方面中起關鍵作用)有抑制作用(anti-canceragentsinmedicinalchemistry,2009,9,471-480)。含吡唑基的酰基硫脲類化合物對白血病細胞、結腸癌細胞、肝癌細胞三種癌細胞都有較好的抑制活性(bioorg.med.chem.,2013,21，3859-3865.)。
技術實現要素：
本發明旨在提供一種吡唑二苯基脲類衍生物及其制備方法和用途。本發明依據藥物的拼合原理和基于結構的藥物分子設計理念，基于吡唑和脲的活性，對同時具有吡唑和脲的先導化合物進行結構修飾和先導優化，設計出一種新型的吡唑二苯基脲類衍生物。生物活性測試結果表明此系列化合物對黑色素瘤有較好的抑制活性。
本發明吡唑二苯基脲類衍生物，其結構式為：
式中：
r＝h、4-ch3、3-ch3、4-cl、3-cl、4-f、3-f、4-br、3-br、4-cf3、3-cf3、4-ocf3或3-ocf3。
本發明吡唑二苯基脲類衍生物的制備方法，包括如下步驟：
步驟1：向0℃的n,n-二甲基甲酰胺(冰水浴中冷卻)中滴加三氯氧磷，約20分鐘滴完，滴完后將圓底燒瓶轉移至油浴鍋中，向體系中加入3-甲基-1-苯基-1h-吡唑，升溫至100℃回流反應1小時，反應結束后冷卻，將反應液在攪拌下慢慢倒入120ml冰水混合物中(調ph值至中性)，靜置2小時，抽慮，干燥，得化合物a—5-cl-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-甲醛，為灰白色固體；
步驟1中，3-甲基-1-苯基-1h-吡唑、n,n-二甲基甲酰胺與三氯氧磷的摩爾比為1:5:9。
步驟2：向無水乙醇中加入步驟1所得化合物a和苯胺衍生物，tlc檢測，直至沉淀產生完全后停止反應，抽濾，干燥，得化合物b—吡唑-4-希夫堿衍生物；
步驟2中，化合物a與苯胺衍生物的摩爾比為1:1.2。
步驟2中，無水乙醇的用量為每毫摩爾化合物a加10ml。
所述苯胺衍生物為苯胺、4-甲基苯胺、3-甲基苯胺、4-氯苯胺、3-氯苯胺、4-氟苯胺、3-氟苯胺、4-溴苯胺、3-溴苯胺、4-三氟甲基苯胺、3-三氟甲基苯胺、4-三氟甲氧基苯胺、或3-三氟甲氧基苯胺。
步驟3：向步驟2的反應體系中緩慢滴加硼氫化鈉，常溫下攪拌2小時至反應液徹底澄清，向反應體系中加水，用二氯甲烷萃取2-3次，合并有機相后減壓濃縮，薄層色譜法(洗脫液為乙酸乙酯/石油醚＝1/10，v/v)進行分離純化得到化合物c—1-苯基-4-甲基苯胺結構的吡唑衍生物；
步驟3中，化合物a與硼氫化鈉的摩爾比為1:4。
步驟4：將步驟3所得化合物c溶于氯仿中，再向其中滴加異氰酸苯酯，常溫反應1小時后tlc分離得到目標產物。
步驟4中，化合物c與異氰酸苯酯的摩爾比為1:1.2。
步驟4中，氯仿的用量為每毫摩爾化合物c加1ml。
本發明吡唑二苯基脲類衍生物的用途，是在制備brafv600e抑制劑中的應用。
本發明的有益效果體現在：
本發明的的吡唑二苯基脲類衍生物對小鼠黑色素瘤細胞株(b16-f10)有明顯的抗增殖作用，因此本發明的吡唑二苯基脲類衍生物可以在制備抗腫瘤藥物中應用。
具體實施方式
通過以下實施例進一步詳細說明本發明，但應注意本發明的范圍并不受這些實施例的任何限制。
實施例1：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-1,3-二苯基脲(化合物1)
制備過程如下：
步驟1：在常溫攪拌臺上的50ml三口瓶中放入一顆磁力攪拌子并加入2.3ml(0.05mol)dmf，冰水浴冷卻至0℃左右滴加8.2ml(0.09mol)pocl3，約20分鐘滴完，滴完后將三口瓶轉移至油浴鍋中，向體系中加入3-甲基-1-苯基-1h-吡唑1.75g(0.01mol)，升溫至100℃回流反應1小時，反應結束后冷卻，將反應液在攪拌下慢慢倒入盛有120ml冰水混合物的大燒杯中(調ph值至中性)，靜置2小時，抽慮，干燥，得到化合物a—5-cl-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-甲醛，為灰白色固體。
步驟2：向100ml單口圓底燒瓶中加入10ml無水乙醇和磁力攪拌子，然后加入化合物a(1mmol)和苯胺(1.2mmol)，tlc檢測，直至沉淀產生完全后停止反應，抽濾，干燥，得化合物b—吡唑-4-希夫堿衍生物；
步驟3：向圓底燒瓶中緩慢向反應體系中滴加硼氫化鈉(38mg，4mmol)，為保證實驗完全可加入稍微過量硼氫化鈉，在常溫下攪拌反應2小時，至反應液徹底澄清；向反應體系中加水，轉移出至150ml的分液漏斗中，每次加50ml二氯甲烷萃取2-3次，將萃取液收集到錐形瓶中，然后用100ml圓底燒瓶將萃取液用旋轉蒸發儀減壓蒸去二氯甲烷后得到仲胺產物并濃縮轉移到5ml的圓底燒瓶中，最后將仲胺產物溶于少量二氯甲烷中，采用制備型薄層色譜法(洗脫液為乙酸乙酯/石油醚＝1/10，v/v)進行分離純化得到化合物c—1-苯基-4-甲基苯胺結構的吡唑衍生物；
步驟4：將步驟3所得化合物c(1mmol)溶于1ml氯仿中，再向其中滴加異氰酸苯酯(1.2mmol)，常溫反應1小時后tlc分離得到目標產物，為淡黃色粉末，收率80％，熔點135-136℃。1hnmr(600mhz,dmso)δ7.71(s,1h),7.48(t,j＝7.7hz,2h),7.40(dt,j＝13.4,7.9hz,7h),7.29(t,j＝7.2hz,1h),7.19(dt,j＝7.8,3.7hz,4h),6.92(t,j＝7.0hz,1h),4.81(s,2h),2.10(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ156.62,152.33,142.58,141.39,140.74,132.89,132.00,131.57,131.47,131.34,130.67,127.42,125.71,122.11,116.58,43.85,15.16.
實施例2：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-(對甲苯基)脲(化合物2)
制備方法同實施例1，不同的是以4-甲基苯胺代替苯胺，得到黃色固體粉末目標化合物，收率63％，熔點127-128℃。
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.47-7.40(m,4h),7.37(d,j＝4.6hz,1h),7.28(t,j＝7.4hz,2h),7.25-7.20(m,4h),7.05(d,j＝7.7hz,2h),6.99(t,j＝7.3hz,1h),4.91(d,j＝12.0hz,2h),2.38(s,3h),2.27(d,j＝11.1hz,3h).13cnmr(151mhz,dmso)δ157.42,152.01,150.06,143.00,142.95,140.84,133.72,132.23,131.29,129.23,127.71,125.40(s),125.05(s),124.02–123.99,123.53,122.32-122.28,121.29-121.24,116.79,44.63,15.37.
實施例3：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-(間甲苯基)脲(化合物3)
制備方法同實施例1，不同的是以3-甲基苯胺代替苯胺，得到黃色固體粉末目標化合物，收率60％，熔點109-110℃。
1hnmr(600mhz,dmso)δ7.64(s,1h),7.49(t,j＝7.7hz,2h),7.44-7.34(m,5h),7.25(t,j＝7.7hz,1h),7.19(t,j＝7.8hz,2h),7.09(t,j＝13.2hz,1h),7.01(s,1h),6.98-6.89(m,2h),4.78(s,2h),2.27(s,3h),2.10(s,3h).13cnmr(151mhz,dmso)δ157.41,152.07,143.57,142.94,141.92,140.88,132.32,132.08,131.26,131.07,129.17,128.61,127.65,125.23,123.15,117.12,58.00,44.39,24.00,15.37.
實施例4：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-(對氯苯基)脲(化合物4)
制備方法同實施例1，不同的是以4-氯苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率65％，熔點158-159℃。
1hnmr(600mhz,dmso)δ8.10(s,1h),7.52-7.45(m,3h),7.41(t,j＝8.1hz,3h),7.37(d,j＝7.6hz,2h),7.32-7.12(m,5h),6.95(t,j＝7.3hz,1h),4.85(s,2h),2.20-2.07(m,3h).13cnmr(151mhz,dmso)δ151.81,149.69,140.97,140.70,132.28,131.17,128.28-128.15,127.73,124.10,119.29,118.19,117.58-117.33,113.02,112.67,58.50,39.60,15.55.
實施例5：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-(間氯苯基)脲(化合物5)
制備方法同實施例1，不同的是以3-氯苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率63％，熔點96-98℃。
1hnmr(600mhz,dmso)δ8.04(s,1h),7.49(t,j＝7.3hz,2h),7.46-7.32(m,7h),7.29(d,j＝1.4hz,1h),7.21(t,j＝7.4hz,2h),7.15-7.11(m,1h),6.94(t,j＝7.2hz,1h),4.82(s,2h),2.14(s,3h).13cnmr(151mhz,dmso)δ157.29,152.04,145.36,142.94,140.83,136.36,133.94,132.28,131.61,131.29,130.44,130.17,129.21,127.69,125.40,123.45,116.81,44.45,15.42.
實施例6：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-(對氟苯基)脲(化合物6)
制備方法同實施例1，不同的是以4-氟苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率65％，熔點136-137℃。
1hnmr(600mhz,dmso)δ7.74(s,1h),7.49(t,j＝7.7hz,2h),7.45-7.36(m,5h),7.28-7.15(m,6h),6.97-6.89(m,1h),4.78(s,2h),2.12(s,3h).13cnmr(151mhz,dmso)δ157.26,152.05,145.62,142.91,140.84,133.89,132.27,131.27,129.14,127.81-127.56,125.40,123.43,118.79,117.18,116.88,44.50,15.43.
實施例7：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-(間氟苯基)脲(化合物7)
制備方法同實施例1，不同的是以3-氟苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率70％，熔點140-141℃。
1hnmr(600mhz,dmso)δ7.99(s,1h),7.54-7.45(m,2h),7.45-7.35(m,6h),7.21(t,j＝7.9hz,2h),7.12(t,j＝7.8hz,2h),7.02(d,j＝7.6hz,1h),6.93(dd,j＝16.9,9.6hz,1h),4.83(s,2h),2.15(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ156.28,152.26,144.31,141.11,140.81,134.00,131.55,130.70,129.92,127.72,127.43,126.02,122.33,119.30,119.16,118.48,116.19,43.99,15.26.
實施例8：1-(4-溴苯基)-1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-基)甲基)-3-苯基脲(化合物8)
制備方法同實施例1，不同的是以4-溴苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率61％，熔點164-165℃。
1hnmr(600mhz,dmso)δ7.94(s,1h),7.55(d,j＝8.6hz,2h),7.49(t,j＝7.7hz,2h),7.45-7.35(m,5h),7.20(t,j＝7.9hz,2h),7.15(d,j＝8.6hz,2h),6.93(t,j＝7.3hz,1h),4.80(s,2h)，2.13(s，3h).13cnmr(151mhzdmso)δ157.32，152.02，143.20，142.94，140.83，135.47133.82,132.28,131.27,129.11,127.70,125.37,123.47,123.14,116.89,44.43,15.44.
實施例9：1-(3-溴苯基)-1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-基)甲基)-3-苯基脲(化合物9)
制備方法同實施例1，不同的是以3-溴苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率40％，熔點112-113℃。
1hnmr(600mhz,dmso)δ8.17(s,1h),7.62(d,j＝7.8hz,1h),7.57(dd,j＝15.0,7.2hz,1h),7.48(dd,j＝15.8,7.9hz,4h),7.41(t,j＝7.5hz,3h),7.35(d,j＝7.5hz,2h),7.22(q,j＝8.3hz,2h),6.95(t,j＝7.3hz,1h),4.87(s,2h),2.15(d,j＝14.1hz,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ156.24,152.27,144.07,141.07,140.78,135.17,134.47,134.00,131.56,130.72,130.04,127.53,126.05,126.01,122.37,116.09,43.99,32.33,15.27.
實施例10：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-((對三氟甲基)苯基)脲(化合物10)
制備方法同實施例1，不同的是以4-三氟甲基苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率42％，熔點104-105℃。
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.71(d,j＝7.9hz,1h),7.46-7.34(m,1h),7.28(dd,j＝17.3,8.7hz,4h),7.04(t,j＝6.9hz,6h),6.05(s,2h),5.01-4.90(m,2h),2.36-2.25(m,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ156.34,152.15,140.74,132.17,131.91,131.68,130.95,130.03,128.73,127.46,126.41,122.66,121.42,121.35,116.10,44.24,32.33,15.26.
實施例11：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-((間三氟甲基)苯基)脲(化合物11)
制備方法同實施例1，不同的是以3-三氟甲基苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率50％，常溫下液態。
1hnmr(600mhz,dmso)δ7.68(s,1h),7.49(t,j＝7.7hz,2h),7.43-7.39(m,2h),7.38(d,j＝8.3hz,4h),7.29(t,j＝7.4hz,1h),7.19(dd,j＝7.3,5.1hz,4h),6.92(t,j＝7.3hz,1h),4.81(s,2h),2.10(s,3h).13cnmr(151mhz,dmso)δ157.37,152.02,144.70,142.91,140.79,135.87,133.60,132.90,132.26,131.31,129.18,128.28,127.62,126.72,125.47,123.53,116.67,44.39,32.12,15.35.
實施例12：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-((對三氟甲氧基)苯基)脲(化合物12)
制備方法同實施例1，不同的是以4-三氟甲氧基苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率54％，熔點97-98℃。
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.71(d,j＝7.7hz,2h),7.45-7.39(m,5h),7.37(t,j＝7.3hz,3h),7.34-7.32(m,1h),7.29(t,j＝7.8hz,3h),4.96(s,2h),2.29(s,3h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ156.39,152.26,151.61,141.09,140.68,133.68,131.61,131.53,130.78,130.06,127.38,126.08,125.19,122.38,116.15,44.07,32.32,15.21.
實施例13：1-((5-氯-3-甲基-1-苯基-1h-吡唑-4-)甲基)-3-苯基-1-((間三氟甲氧基)苯基)脲(化合物13)
制備方法同實施例1，不同的是以3-三氟甲氧基苯胺代替苯胺，得到白色固體粉末目標化合物，收率54％，熔點69-70℃。
1hnmr(600mhz,cdcl3)δ7.53(d,j＝8.4hz,2h),7.43(d,j＝5.8hz,4h),7.37(d,j＝7.0hz,2h),7.30(dd,j＝19.0,10.1hz,4h),7.16(dd,j＝14.1,7.7hz,1h),7.02(dd,j＝13.4,6.2hz,1h),4.92(m,2h),2.32(m,2h).13cnmr(151mhz,cdcl3)δ156.22,152.90,152.21,144.22,140.96,140.55,134.09,131.61,130.86,130.57,129.06,127.60,126.18,124.77,123.79,122.46,116.11,44.24,32.32,27.37.
實施例14：吡唑二苯基脲類衍生物(化合物1-13)體外抗黑色素瘤活性評價
1、采用mtt[3-(4,5)-雙甲基-2-噻唑-(2,5)-苯基溴化四氮唑藍]法來測定化合物1-13對小鼠黑色素瘤細胞株(b16-f10)的抗增殖活性。
2、取事先培養好的對數期細胞，胰蛋白酶消化后收集細胞，用移液管吹打均勻，取兩滴細胞懸液錐蟲藍(trypanblue)染色，于顯微鏡下計數活細胞數目(死細胞數目不得超過5％)，用配得的10％胎牛血清rpmi1640培養液調整細胞數目至5×104個細胞/ml；
3、于96孔細胞培養板中每孔加入100μl細胞懸液(邊緣孔使用無菌水填充)，每組設置對照。將培養板置于37℃、5％co2培養箱中培養至細胞單層鋪滿孔底；
4、取出培養板后于每孔中加1μl含不同濃度梯度的待測藥品溶液，每個濃度設3個平行孔。加完藥后培養板于微孔板振蕩器上振蕩混勻，置于37℃、5％co2培養箱中繼續孵育48小時；
5、取出培養板，每孔加入10μl5mg/ml的mtt液(即5％mtt)，振蕩混勻，繼續培養4小時；
6、終止培養，準備溶解結晶：加入每孔100μlsds裂解液后培養6-8小時；
7、顯微鏡下觀察結晶全部溶解后在570nm波長下測試吸光度；
8、結果統計
細胞50％生長抑制所需的藥物濃度gi50由spss13.0統計軟件計算可得，計算公式如下：gi50:即[(t-t0)/(c-t0)]＝50％
其中，t：加藥組的細胞od值，t0：表示加藥時對照組細胞的od值，c：對照組細胞od值。測得的ic50見表1所示
表1化合物1-13對b16-f10細胞的抗增殖活性。
從表1中可以看出，本發明的的吡唑二苯基脲類衍生物對小鼠黑色素瘤細胞株(b16-f10)有明顯的抗增殖作用，其中大部分化合物展示出了強于陽性對照5-fu的抗增殖活性，化合物5具有最強的抗增殖活性(ic50＝5.4μm)。因此本發明的吡唑二苯基脲類衍生物可以在制備抗腫瘤藥物中應用。