本發(fā)明涉及菌種的培養(yǎng)基，具體涉及一種側(cè)耳屬一級(jí)菌種復(fù)合培養(yǎng)基及其制備方法。
背景技術(shù)：
側(cè)耳屬真菌具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，包括多糖、蛋白質(zhì)、氨基酸、脂肪酸等，這些生物活性成分具有提高機(jī)體免疫力、延緩衰老、抗疲勞、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)血脂、化學(xué)預(yù)防等重要作用。側(cè)耳屬真菌具有藥理活性，對(duì)人體具有養(yǎng)身保健作用，是一類(lèi)良好的具有極大藥用潛質(zhì)和食用價(jià)值的食用菌。側(cè)耳屬主要有平菇、榆黃菇、姬菇、鮑魚(yú)菇等，其中榆黃菇和平菇為重要藥用真菌，目前人工大面積栽培較少，資源有限，需深入研究和開(kāi)發(fā)。目前各大高校實(shí)驗(yàn)室用的側(cè)耳屬的一級(jí)培養(yǎng)基均為pda培養(yǎng)基(即土豆培養(yǎng)基)，其中常常通過(guò)添加葡萄糖作為補(bǔ)充碳源，這種培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的菌絲長(zhǎng)勢(shì)不好，且葡萄糖的價(jià)格較貴，不利于生產(chǎn)中使用。
凡能為食用菌提供碳素營(yíng)養(yǎng)的物質(zhì)，稱(chēng)為碳源，碳源是構(gòu)成細(xì)胞物質(zhì)的主要元素，也是能量的來(lái)源，碳素約占菌體成分的50％～65％，因菌體的多數(shù)物質(zhì)皆以碳素為骨架。微生物選擇碳源與自身代謝系統(tǒng)有關(guān)，微生物往往能利用多種碳源。側(cè)耳屬食用菌屬于異養(yǎng)型的真菌，只能以有機(jī)碳為碳源，側(cè)耳屬食用菌吸收的碳素約20％用于合成細(xì)胞，80％用于維持生命活動(dòng)所需的能量。鼠尾藻產(chǎn)于海礁、浪崗、嵊山、中街山、普陀山、象山港、韭山、大陳、洞頭、南虎、大漁等地，廣分布于我國(guó)沿海，鼠尾藻富含鼠尾藻多糖。鼠尾藻多糖是從鼠尾藻中提取得到的一種白色海綿狀水溶性多糖，現(xiàn)有技術(shù)研究表明，鼠尾藻多糖是一類(lèi)多組分的混合物，由不同的單糖基通過(guò)糖苷鍵相連形成，其主要組成單糖為吡楠糖，目前，關(guān)于將鼠尾藻多糖用于菌種培養(yǎng)基的組成成分未見(jiàn)報(bào)道。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種側(cè)耳屬一級(jí)菌種復(fù)合培養(yǎng)基及其制備方法，該培養(yǎng)基利用鼠尾藻多糖作為補(bǔ)充碳源，有效解決了我國(guó)沿海鼠尾藻資源嚴(yán)重浪費(fèi)的問(wèn)題，同時(shí)促進(jìn)了側(cè)耳屬一級(jí)菌種的生長(zhǎng)，使用該培養(yǎng)基培育的菌絲體濃密粗壯、氣生菌絲多、生長(zhǎng)周期短，有效保證了菌種的活力，為產(chǎn)業(yè)化人工栽培育種節(jié)約了大量的人力物力。
一種側(cè)耳屬一級(jí)菌種復(fù)合培養(yǎng)基包括馬鈴薯、補(bǔ)充碳源、補(bǔ)充氮源、維生素及無(wú)機(jī)鹽，所述補(bǔ)充碳源為鼠尾草多糖，所述補(bǔ)充氮源為酵母粉、牛肉膏或蛋白胨中的一種，所述維生素為vb6，所述無(wú)機(jī)鹽包括磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，一種側(cè)耳屬一級(jí)菌種復(fù)合培養(yǎng)基包括馬鈴薯、補(bǔ)充碳源、補(bǔ)充氮源、維生素及無(wú)機(jī)鹽，所述補(bǔ)充碳源為鼠尾藻多糖，所述補(bǔ)充氮源為蛋白胨，所述維生素為vb6，所述無(wú)機(jī)鹽包括磷酸二氫鉀、硫酸鎂和氯化鈣。
作為優(yōu)選，所述鼠尾藻多糖為鼠尾藻多糖粗提物，其鼠尾藻多糖含量在20-40％。
作為優(yōu)選，所述鼠尾藻多糖粗提物的制備可以采用微波法提取、超聲波法提取或超聲波酶法提取制備得到，優(yōu)選為微波法提取制備得到。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，一種側(cè)耳屬一級(jí)菌種復(fù)合培養(yǎng)基，包括以下組分(1l):
馬鈴薯140-160g，
蛋白胨1.4-1.6g，
vb60.015mg，
磷酸二氫鉀2.0g，
硫酸鎂1.0g，
氯化鈣0.05g，
20-40％鼠尾草多糖粗提物40-60g，
瓊脂20g。
作為優(yōu)選的技術(shù)方案，一種側(cè)耳屬一級(jí)菌種復(fù)合培養(yǎng)基，包括以下組分(1l):
馬鈴薯150g，
蛋白胨1.5g，
vb60.015mg，
磷酸二氫鉀2.0g，
硫酸鎂1.0g，
氯化鈣0.05g，
20-40％鼠尾草多糖粗提物40-60g，
瓊脂20g。
一種側(cè)耳屬一級(jí)菌種復(fù)合培養(yǎng)基的制備方法，包括以下步驟：
1)新鮮馬鈴薯洗凈去皮，切成小塊，裝入燒杯(量杯)中，放入自來(lái)水，加熱煮沸維持20～30min，至馬鈴薯酥而不爛為度，加熱過(guò)程中稍加攪拌，然后用四層紗布過(guò)濾，取其濾液，得馬鈴薯汁液；
2)在馬鈴薯汁液中加入瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌至瓊脂完全溶化，最后加入鼠尾藻海藻多糖，蛋白胨，vb6，磷酸二氫鉀，硫酸鎂，氯化鈣，用自來(lái)水定容，用1mol.l-1的naoh調(diào)節(jié)ph值，至7.0。
3)放在高壓滅菌鍋中121℃，滅菌30min，自然降溫到60℃左右出鍋。
側(cè)耳屬食用菌能分泌降解高分子物質(zhì)的胞外酶，如水解酶，氧化酶等，將多糖等復(fù)雜的物質(zhì)分解成可溶于水、能被細(xì)胞吸收利用的小分子物質(zhì)。平菇、榆黃菇和桃紅平菇、姬菇、鮑魚(yú)菇等側(cè)耳屬食用菌是一些分泌胞外酶能力很強(qiáng)的菌種，這些胞外酶(水解酶或氧化酶)把復(fù)雜的物質(zhì)變成簡(jiǎn)單、可利用的物質(zhì)，通過(guò)細(xì)胞壁的滲透作用把可溶性物質(zhì)吸收到體內(nèi)，再通過(guò)胞內(nèi)酶在有氧的條件下以呼吸作用取得能量。
本發(fā)明復(fù)合培養(yǎng)基對(duì)原有培養(yǎng)基進(jìn)行了改良，利用鼠尾藻多糖粗提物代替了昂貴的葡萄糖，這種復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)出來(lái)的側(cè)耳屬食用菌的菌絲生長(zhǎng)速度快，菌絲強(qiáng)壯；鼠尾藻多糖提取物中除了含有鼠尾藻多糖外，還含有多種溶于水的各種微量元素，在刺激菌絲迅速生長(zhǎng)的同時(shí)又可被菌絲體充分吸收貯存，提高菌絲抗性，解決中國(guó)沿海鼠尾藻資源嚴(yán)重浪費(fèi)的問(wèn)題；本發(fā)明利用鼠尾藻多糖提取物作為一種遲效碳源，使側(cè)耳屬食用菌的一級(jí)菌種生長(zhǎng)旺盛，菌絲體濃密粗壯、生長(zhǎng)均勻、菌絲萌發(fā)點(diǎn)多，生長(zhǎng)周期短，有效保證了菌種的活力，有利于在二次高鹽的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，為產(chǎn)業(yè)化人工栽培育種節(jié)約了大量的人力物力；本發(fā)明的技術(shù)方案有利于鼠尾藻資源的再利用、成本低、有利于規(guī)模化產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明鼠尾藻多糖粗提物的制備方法可以參考現(xiàn)有技術(shù)的制備方法，如微波法提取、超聲波法提取或超聲波酶法提取，本實(shí)施例1-4中鼠尾草多糖粗提物的制備方法參考黎慶濤等微波法提取鼠尾藻多糖的工藝研究中的最優(yōu)技術(shù)方案制備得到，具體工藝為：微波時(shí)間8min，微波功率540w，料液比1:30，超聲時(shí)間3min，得到的粗多糖含量為26.7％。
1l平板培養(yǎng)基a的制備：將馬鈴薯去皮，挖去牙眼，清洗干凈后稱(chēng)取150g后，切片后加水煮沸，至馬鈴薯片煮至熟而不爛為止，用四層紗布過(guò)濾，得到濾液。稱(chēng)取蛋白胨1.5g，vb60.015mg，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，氯化鈣0.05g，鼠尾草多糖60g，瓊脂20g，并用水定容至1000ml，加熱攪拌至瓊脂全部溶化為止，于121℃下滅菌30min，分裝于大培養(yǎng)皿中，每個(gè)大培養(yǎng)皿18ml。
1l平板培養(yǎng)基b的制備：將馬鈴薯去皮，挖去牙眼，清洗干凈后稱(chēng)取140g后，切片后加水煮沸，至馬鈴薯片煮至熟而不爛為止，用四層紗布過(guò)濾，得到濾液。稱(chēng)取蛋白胨1.5g，vb60.015mg，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，氯化鈣0.05g，鼠尾草多糖50g，瓊脂18g，并用水定容至1000ml，加熱攪拌至瓊脂全部溶化為止，于121℃下滅菌30min，分裝于大培養(yǎng)皿中，每個(gè)大培養(yǎng)皿18ml。
1l平板培養(yǎng)基c的制備：將馬鈴薯去皮，挖去牙眼，清洗干凈后稱(chēng)取160g后，切片后加水煮沸，至馬鈴薯片煮至熟而不爛為止，用四層紗布過(guò)濾，得到濾液。稱(chēng)取蛋白胨1.5g，vb60.015mg，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，氯化鈣0.05g，鼠尾草多糖40g，瓊脂22g，并用水定容至1000ml，加熱攪拌至瓊脂全部溶化為止，于121℃下滅菌30min，分裝于大培養(yǎng)皿中，每個(gè)大培養(yǎng)皿18ml。
1l平板培養(yǎng)基d的制備：將馬鈴薯去皮，挖去牙眼，清洗干凈后稱(chēng)取150g后，切片后加水煮沸，至馬鈴薯片煮至熟而不爛為止，用四層紗布過(guò)濾，得到濾液。稱(chēng)取蛋白胨1.5g，vb60.015mg，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，氯化鈣0.05g，葡萄糖20g，瓊脂20g，并用水定容至1000ml，加熱攪拌至瓊脂全部溶化為止，于121℃下滅菌30min，分裝于大培養(yǎng)皿中，每個(gè)大培養(yǎng)皿18ml。
1l平板培養(yǎng)基e的制備：將馬鈴薯去皮，挖去牙眼，清洗干凈后稱(chēng)取140g后，切片后加水煮沸，至馬鈴薯片煮至熟而不爛為止，用四層紗布過(guò)濾，得到濾液。稱(chēng)取蛋白胨1.5g，vb60.015mg，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，氯化鈣0.05g，葡萄糖20g，瓊脂18g，并用水定容至1000ml，加熱攪拌至瓊脂全部溶化為止，于121℃下滅菌30min，分裝于大培養(yǎng)皿中，每個(gè)大培養(yǎng)皿18ml。
1l平板培養(yǎng)基f的制備：將馬鈴薯去皮，挖去牙眼，清洗干凈后稱(chēng)取160g后，切片后加水煮沸，至馬鈴薯片煮至熟而不爛為止，用四層紗布過(guò)濾，得到濾液。稱(chēng)取蛋白胨1.5g，vb60.015mg，磷酸二氫鉀2.0g，硫酸鎂1.0g，氯化鈣0.05g，葡萄糖20g，瓊脂22g，并用水定容至1000ml，加熱攪拌至瓊脂全部溶化為止，于121℃下滅菌30min，分裝于大培養(yǎng)皿中，每個(gè)大培養(yǎng)皿18ml。
1l斜面活化母種培養(yǎng)基的制備：將馬鈴薯去皮，挖去牙眼，清洗干凈后稱(chēng)取150g后，切片后加水煮沸，至馬鈴薯片煮至熟而不爛為止。用四層紗布過(guò)濾，得到濾液。稱(chēng)取葡萄糖20g，瓊脂20g，并用水定容至1000ml，加熱攪拌至瓊脂全部溶化為止，分裝試管中，于121℃下滅菌30min。
1l平板活化培養(yǎng)基的制備：將馬鈴薯去皮，挖去牙眼，清洗干凈后稱(chēng)取150g后，切片后加水煮沸，至馬鈴薯片煮至熟而不爛為止。用四層紗布過(guò)濾，得到濾液。稱(chēng)取葡萄糖20g，瓊脂20g，并用水定容至1000ml，加熱攪拌至瓊脂全部溶化為止，于121℃下滅菌30min，分裝在小培養(yǎng)皿中，每個(gè)小培養(yǎng)皿10ml。
本發(fā)明中的側(cè)耳屬(pleurotus)的菌種，平菇(pleurotusostreatus)、榆黃菇(pleurotuscitrinopileatus)、佛羅里達(dá)平菇(pleurotusflorida)、鮑魚(yú)菇(pleurotusabalonus)的母種可以通過(guò)商業(yè)途徑購(gòu)買(mǎi)得到，本發(fā)明實(shí)施例中的側(cè)耳屬菌種從山東濟(jì)寧第一食用菌研究所購(gòu)買(mǎi)得到，采用傳統(tǒng)的土豆培養(yǎng)基冰箱中冷藏進(jìn)行菌種保藏，以備實(shí)驗(yàn)所用。
高壓滅菌鍋：hirayama，hve-50，50l。
大培養(yǎng)皿型號(hào)：100mm直徑。
小培養(yǎng)皿型號(hào)：50mm直徑。
觀測(cè)方法：每天定時(shí)測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)密度、菌絲色澤、菌絲萌發(fā)時(shí)間及滿皿時(shí)間；菌落生長(zhǎng)量指標(biāo)：++++菌落整齊，菌絲多，濃白；+++整齊，較多，濃白；++較整齊，較多，白色；+不整齊，菌絲生長(zhǎng)勢(shì)弱。菌絲生長(zhǎng)速度＝培養(yǎng)皿的直徑(mm)/滿皿時(shí)間(d)。
實(shí)施例1
將保藏在冰箱中的平菇(pleurotusostreatus)菌種無(wú)菌條件下接種在斜面活化母種培養(yǎng)基上，接種5管，恒濕培養(yǎng)箱25℃，相對(duì)濕度為50％，遮光培養(yǎng)5d。5d后選取生長(zhǎng)狀況最好的活化菌株，無(wú)菌條件下接種到pda平板正中央，以保證菌落邊緣連續(xù)，菌絲生長(zhǎng)均勻，保證下一步打孔接種所使用的菌絲生長(zhǎng)情況相同或相近。每個(gè)菌株接種5個(gè)小平板(小培養(yǎng)皿)。恒濕培養(yǎng)箱25℃，相對(duì)濕度為50％，遮光培養(yǎng)8d。
選取培養(yǎng)8天后生長(zhǎng)狀況最好的平板，無(wú)菌條件下，在與平板中央距離相同的生長(zhǎng)有菌絲的培養(yǎng)基上，用打孔器打成均一的小塊，直接為5mm，分別接種到平板培養(yǎng)基a、b、c、d、e、f中央(大培養(yǎng)皿)，每種培養(yǎng)基設(shè)置5個(gè)重復(fù)。每天定時(shí)測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)密度、菌絲色澤、菌絲萌發(fā)時(shí)間及滿皿時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。
表1
實(shí)施例2
將保藏在冰箱中的榆黃菇(pleurotuscitrinopileatus)菌種無(wú)菌調(diào)節(jié)下接種在斜面活化母種培養(yǎng)基上，接種5管，恒濕培養(yǎng)箱25℃，相對(duì)濕度為50％，遮光培養(yǎng)5d。5d后選取生長(zhǎng)狀況最好的活化菌株，無(wú)菌條件下接種到pda平板正中央，以保證菌落邊緣連續(xù)，菌絲生長(zhǎng)均勻，保證下一步打孔接種所使用的菌絲生長(zhǎng)情況相同或相近。每個(gè)菌株接種5個(gè)小平板(小培養(yǎng)皿)。恒濕培養(yǎng)箱25℃，相對(duì)濕度為50％，遮光培養(yǎng)8d。
選取培養(yǎng)8天后生長(zhǎng)狀況最好的平板，無(wú)菌條件下，在與平板中央距離相同的生長(zhǎng)有菌絲的培養(yǎng)基上，用打孔器打成均一的小塊，直接為5mm，分別接種到平板培養(yǎng)基a、b、c、d、e、f中央(大培養(yǎng)皿)，每種培養(yǎng)基設(shè)置5個(gè)重復(fù)。每天定時(shí)測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)密度、菌絲色澤、菌絲萌發(fā)時(shí)間及滿皿時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。
表2
實(shí)施例3
將保藏在冰箱中的佛羅里達(dá)平菇(pleurotusflorida)菌種無(wú)菌調(diào)節(jié)下接種在斜面活化母種培養(yǎng)基上，接種5管，恒濕培養(yǎng)箱25℃，相對(duì)濕度為50％，遮光培養(yǎng)5d。5d后選取生長(zhǎng)狀況最好的活化菌株，無(wú)菌條件下接種到pda平板正中央，以保證菌落邊緣連續(xù)，菌絲生長(zhǎng)均勻，保證下一步打孔接種所使用的菌絲生長(zhǎng)情況相同或相近。每個(gè)菌株接種5個(gè)小平板(小培養(yǎng)皿)。恒濕培養(yǎng)箱25℃，相對(duì)濕度為50％，遮光培養(yǎng)8d。
選取培養(yǎng)8天后生長(zhǎng)狀況最好的平板，無(wú)菌條件下，在與平板中央距離相同的生長(zhǎng)有菌絲的培養(yǎng)基上，用打孔器打成均一的小塊，直接為5mm，分別接種到平板培養(yǎng)基a、b、c、d、e、f中央(大培養(yǎng)皿)，每種培養(yǎng)基設(shè)置5個(gè)重復(fù)。每天定時(shí)測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)密度、菌絲色澤、菌絲萌發(fā)時(shí)間及滿皿時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。
表3
實(shí)施例4
將保藏在冰箱中的鮑魚(yú)菇(pleurotusabalonus)菌種無(wú)菌調(diào)節(jié)下接種在斜面活化母種培養(yǎng)基上，接種5管，恒濕培養(yǎng)箱25℃，相對(duì)濕度為50％，遮光培養(yǎng)5d。5d后選取生長(zhǎng)狀況最好的活化菌株，無(wú)菌條件下接種到pda平板正中央，以保證菌落邊緣連續(xù)，菌絲生長(zhǎng)均勻，保證下一步打孔接種所使用的菌絲生長(zhǎng)情況相同或相近。每個(gè)菌株接種5個(gè)小平板(小培養(yǎng)皿)。恒濕培養(yǎng)箱25℃，相對(duì)濕度為50％，遮光培養(yǎng)8d。
選取培養(yǎng)8天后生長(zhǎng)狀況最好的平板，無(wú)菌條件下，在與平板中央距離相同的生長(zhǎng)有菌絲的培養(yǎng)基上，用打孔器打成均一的小塊，直接為5mm，分別接種到平板培養(yǎng)基a、b、c、d、e、f中央(大培養(yǎng)皿)，每種培養(yǎng)基設(shè)置5個(gè)重復(fù)。每天定時(shí)測(cè)量菌絲生長(zhǎng)速度、生長(zhǎng)密度、菌絲色澤、菌絲萌發(fā)時(shí)間及滿皿時(shí)間，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。
表4
本處實(shí)施例對(duì)本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)范圍中點(diǎn)值未窮盡之處以及在實(shí)施例技術(shù)方案中對(duì)單個(gè)或者多個(gè)技術(shù)特征的同等替換所形成的新的技術(shù)方案，同樣都在本發(fā)明要求保護(hù)的范圍內(nèi)；同時(shí)本發(fā)明方案所有列舉或者未列舉的實(shí)施例中，在同一實(shí)施例中的各個(gè)參數(shù)僅僅表示其技術(shù)方案的一個(gè)實(shí)例(即一種可行性方案)，而各個(gè)參數(shù)之間并不存在嚴(yán)格的配合與限定關(guān)系，其中各參數(shù)在不違背公理以及本發(fā)明述求時(shí)可以相互替換，特別聲明的除外。
本發(fā)明方案所公開(kāi)的技術(shù)手段不僅限于上述技術(shù)手段所公開(kāi)的技術(shù)手段，還包括由以上技術(shù)特征任意組合所組成的技術(shù)方案。以上所述是本發(fā)明的具體實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。