一種人臍帶間充質干細胞源外泌體及其獲取方法和應用與流程

本發明屬于生物醫藥領域，具體涉及一種人臍帶間充質干細胞源外泌體及其獲取方法和應用。

背景技術：

msc(mesenchymalstemcell)即間充質干細胞是干細胞的一種，因能分化為間質組織而得名，具有亞全能分化潛能，在特定的體內外環境下，能夠誘導分化成為多種組織細胞。間充質干細胞具有干細胞的共性，即自我更新、多向分化和歸巢的能力。

由于不能適應體內的環境，體外培養的人間充質干細胞(msc)無論通過何種途徑進入體內，如靜脈輸注、局部骨骼肌注射、腦組織注射或骨缺損組織移植等，多數細胞在短期內死亡。那么，死亡的細胞又是如何發揮作用的呢？近年來的研究表明，在低氧及低營養條件下，msc可以釋放大量的膜微粒(membranemicroparticles，mp)。這些mp包括因細胞凋亡而形成的凋亡小體(apoptoticbodies)，通過發芽形式釋放的膜微囊(membranemicrovesicles，mv)，以及通過內質體主動釋放的外泌體(exosomes)。

三種膜微粒中，凋亡小體最大，一般直徑在1μm左右，其中富含基因組dna。膜微囊大小不均一，直徑在100nm至1μm之間，其表面負載著來源細胞特征性的分子。外泌體大小均一，其直徑一般為50-200nm，其表面有內質體特征性的分子，如cd9，cd63和cd81。

技術實現要素：

為此，本發明所要解決的技術問題在于克服現有技術在外泌體技術空白瓶頸，從而提出一種人臍帶間充質干細胞源外泌體及其獲取方法和應用。

為解決上述技術問題，本發明公開了一種人臍帶間充質干細胞源外泌體，所述外泌體的外膜為磷脂雙層結構，所述外泌體內部含有micro-rna、所述外泌體源細胞的mrna、dna和核酸中的至少一種。

本發明還公開了所述外泌體的制備方法，步驟如下：

a)對人間充質干細胞進行培養，培養階段在細胞培養基中添加干擾素、epo和pdgf-bb；

b)對培養后的干細胞進行預處理；

c)在預處理后的培養基的上清液中提取所述人臍帶間充質干細胞源外泌體。

優選的，所述外泌體為msc分化而來。

優選的，所述人臍帶間充質干細胞源為人臍帶間充質干細胞。

優選的，所述預處理的具體步驟為：

1)將人傳代人臍帶間充質干細胞源進行無血清懸浮培養，并調整細胞濃度為1.0×10⁶/ml；

2)按照10⁶/150mm大培養皿接種，培養至細胞融合度至70-80％，培養時間為2-3天；

3)吸除培養皿中的液體，并用alpha-mem液體培養基對培養皿進行洗滌；

4)在150mm培養皿中再次加入20ml的alpha-mem；

5)依次加入重組人干擾素、pdgf-bb和epo；

6)在37℃，5％的co2條件下培養96小時，收集得到人臍帶間充質干細胞源培養液。

優選的，所述步驟a)的步驟5)具體為：首先加入重組人干擾素、pdgf-bb，在37℃，5％的co2條件下培養24小時；然后，再加入epo，在37℃，5％的co2條件下培養72小時。

優選的，所述人臍帶間充質干細胞源培養液中干擾素的濃度為10u/ml～600u/ml、pdgf-bb的濃度為2ng/ml～60ng/ml，epo的濃度為0.1iu/ml～5iu/ml。

優選的，所述步驟b)的具體為：

1)取所述人臍帶間充質干細胞源培養液的上清液，進行離心處理，去除細胞碎片；

2)然后將上清液濾膜過濾處理，去除凋亡小體，得到預處理后的上清液。

優選的，所述步驟c)具體為：

1)取容積為5體積份的離心管，加入1體積份的外泌體分離試劑；

2)加入4體積份的經過預處理后的上清液，充分混勻；

3)靜置處理后，再進行兩次離心處理，得到所述外泌體。

優選的，所述外泌體在美容制劑的制備領域中的應用。

優選的，任一項所述獲取方法在制備外泌體美容制劑中的應用。

本發明的上述技術方案相比現有技術具有以下優點：本發明所得外泌體可以進入內皮細胞，進而促進內皮細胞的增殖和管網結構形成，可以作為護膚美容制品的活性成分，具有極大的市場前景和應用價值。

附圖說明

為了使本發明的內容更容易被清楚的理解，下面根據本發明的具體實施例并結合附圖，對本發明作進一步詳細的說明，其中

圖1是實施例中所述外泌體的電鏡分析示意圖；

圖2是實施例中對所得外泌體進行流式細胞儀分析的結果圖；

圖3是實施例中對外泌體進行普通光鏡觀察的結果示意圖；

圖4是實施例中對外泌體進行熒光顯微鏡觀察的結果示意圖；

圖5是實施例中所得外泌體的內皮細胞增殖試驗的流式細胞儀分析結果；

圖6是實施例中胎牛血清的流式細胞儀分析結果；

圖7-1是實施例中dmem培養基組的管網結構數量圖；

圖7-2是實施例中1μg/ml外泌體組的管網結構數量圖；

圖7-3是實施例中10μg/ml外泌體組的管網結構數量圖；

圖7-4是實施例中50μg/ml外泌體組的管網結構數量圖；

圖7-5是實施例中100μg/ml外泌體組的管網結構數量圖；

圖7-6是實施例中b-成纖維細胞生長因子組的管網結構數量圖；

圖8是實施例中各接種組的數量對比柱狀圖。

具體實施方式

實施例1本實施例公開了一種人臍帶間充質干細胞源外泌體，所述外泌體的外膜為磷脂雙層結構，所述外泌體內部含有micro-rna、所述外泌體源細胞的mrna、dna和核酸。

實施例2本實施例公開了實施例1所述外泌體的整個制備流程：

一、人臍帶間充質干細胞源的培養及預處理

1.材料及試劑

1)人臍帶、胎盤、骨髓、脂肪或其它來源的msc，傳代次數在6代以內均可。

2)人臍帶間充質干細胞源無血清培養基

3)alpha-mem

4)重組人干擾素

5)重組人epo

6)重組人pdgf-bb

7)培養皿(直徑150mm)

8)其它耗材

二、細胞培養

1)將人傳代msc消化后計數，使用msc無血清完全培養基懸浮，調整細胞濃度為1.0×10⁶/ml。

2)按照10⁶/150mm大培養皿接種，培養至細胞融合度至70-80％。一般需要2-3天。

3)吸除培養皿中的液體，并用alpha-mem液體培養基對培養皿進行洗滌。

4)加入alpha-mem20ml/150mm培養皿。

5)首先，加入重組人干擾素、pdgf-bb，在37℃，5％的co2條件下培養24小時；然后，再加入epo，在37℃，5％的co2條件下培養72小時；重組人干擾素(終濃度為10u/ml～600u/ml)、pdgf-bb(2ng/ml～60ng/ml)及epo(0.1iu/ml～5iu/ml)。

6)37℃，5％co2條件下培養96小時。

7)收集上清進行以下處理。如不能及時處理，將上清置于-80℃保存。

三、人msc培養上清的預處理

1.材料與試劑

1)離心管等耗材。

2)孔徑為1μm，0.45μm及0.22μm的濾器。

2.操作步驟

1)收集細胞培養上清，室溫或4℃條件下離心2000g，10分鐘，去除細胞碎片。

2)將培養上清或體液分別經過直徑為1μm，0.45μm及0.22μm濾膜過濾，以去除其中可能存在的凋亡小體。

四、外泌體的收獲

1)取50ml離心管，加入外泌體分離試劑10ml。或取250ml離心管，加入外泌體試劑50ml。

2)加入經過處理的細胞培養上清40ml，充分混勻。或加入培養上清200ml。

3)置于4℃過夜，或至少6小時。

4)離心，2000g，30分鐘。

5)移除液體，再次離心，2000g，5分鐘。

6)用pipette小心吸除殘留液體。

7)加入pbs或生理鹽水500μl至1ml。或加入pbs或生理鹽水2.5ml至5ml。

8)測定蛋白質濃度，或進行流式細胞學等儀器分析。

9)分裝，在-20℃溫度下保存。

實驗例

實驗例1所得外泌體的電鏡觀察

采用常規方法，對所得外泌體進行電鏡分析，結果如下圖01所示。

圖01所得外泌體的電鏡觀察結果

電鏡觀察結果表明，所得外泌體的直徑約為100nm。

實驗例2所得外泌體的流式細胞儀分析

采用常規方法，對所得外泌體進行流式細胞儀分析，結果如下圖02所示。

圖02所得外泌體的流式細胞儀分析結果

流式細胞儀分析結果表明，所得外泌體大量表達cd29和cd73，但不表達cd31和cd45。這證明了所得外泌體來源于人臍帶干細胞。

實驗例3所得外泌體的內皮細胞吞噬試驗

利用細胞膜標記燃料di-i標記起始原料，即人臍帶干細胞，重復實驗一、實驗二、實驗三，獲取di-i標記的外泌體。然后采用常規方法，將所得外泌體與內皮細胞共培養。最后，進行普通光鏡觀察(結果見圖3)和熒光顯微鏡觀察(結果見圖4)和流式細胞儀分析(結果見圖5)，從圖3、圖4、圖5可以發現，所得外泌體可迅速被內皮細胞吞噬，在8小時后幾乎所有內皮細胞均變為di-i陽性。這說明了，所得外泌體具有促進內皮細胞增殖的基本性質。

實驗例4所得外泌體的內皮細胞增殖試驗

采用常規方法，取得內皮細胞樣本，經細胞染色試劑cfse標記后，在六種不同條件下培養72小時以后，收集細胞進行流式細胞儀分析。具體的培養條件分別是：1μg/ml外泌體、10μg/ml外泌體、50μg/ml外泌體、100μg/ml外泌體、5％胎牛血清、10％胎牛血清。進行流式細胞儀分析，結果如圖6(所得外泌體的內皮細胞增殖試驗的流式細胞儀分析結果)、圖7(胎牛血清的流式細胞儀分析結果)所示。

從圖6可以發現，雖然三個樣品的內皮細胞增殖速率不同，但所得外泌體對內皮細胞的促生長作用是一致的，其濃度為10μg/ml時即可發揮明顯的效果，濃度達到100μg/ml時內皮細胞的增殖速度接近于10％胎牛血清的培養條件。這說明了，所得外泌體可明顯促進內皮細胞增殖。

實驗例5所得外泌體的內皮細胞管網結構形成試驗

采用常規方法，將臍帶內皮細胞接種于matrigel中，體系中加入不同成分(包括：dmem培養基、1μg/ml外泌體、10μg/ml外泌體、50μg/ml外泌體、100μg/ml外泌體、b-成纖維細胞生長因子)，24小時后計管網結構數量。結果依次為圖7-1、為圖7-2、為圖7-3、為圖7-4、為圖7-5、為圖7-6所示。統計了各個濃度的數量，做出了圖8，各接種組的數量對比柱狀圖，可以發現，所得外泌體具有促進內皮細胞管狀結構形成的作用，并呈濃度依賴性。

綜合試驗結果表明，所得外泌體可以進入內皮細胞，進而促進內皮細胞的增殖和管網結構形成。這證明了，所得外泌體可以作為一種活性成分，應用于護膚美容制品。

發明人通過多次試驗發現，采用甘露醇作為冷凍保護劑，可以很好地保持人間充質干細胞源外泌體的形態和生物活性，而且具有良好的長期穩定性。

顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對于所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這里無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處于本發明創造的保護范圍之中。