鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT?LAMP檢測引物組、試劑盒及其應用的制作方法

本發明屬于牛病毒檢測技術領域，尤其涉及一種鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP檢測引物組、試劑盒及其應用。

背景技術：

口蹄疫(Foot-and-mouth disease virus，FMDV)和水泡性口炎(Vesicular stomatitis virus，VSV)是兩種牛常見高度急性病毒傳染病，一般呈暴發性流行，一旦暴發必給養牛業造成巨大的經濟損失，被世界動物衛生組織(OIE)列為A類傳染病。FMDV和VSV引起的臨床病狀非常相似，均表現為流涎，發燒，跛行，口腔、乳頭和蹄部冠狀帶等處發生水泡及潰瘍。兩種病常存在混合感染，難以區分。因此急需建立口蹄疫和水泡性口炎的快速鑒別檢測技術，為我國FMDV和的VSV防控提供技術支持。

目前，FMDV分為7個血清型：A、O、C、SAT 1、SAT 2、SAT 3、Asia 1型，每個型又可以進一步分為不同的亞型。我國流行的為A、O和Asia 1型。VSV分為新澤西型(NJ型)型和印第安型(IND型)，在引起家畜發病的血清型中，NJ型占多數。

目前，OIE推薦的檢測FMDV和VSV的分子生物學方法主要是RT-PCR和熒光RT-PCR方法。但RT-PCR和熒光RT-PCR都有一些自身的局限性，如RT-PCR敏感性較低，熒光RT-PCR成本較高，需要昂貴的儀器設備等。環介導的體外等溫擴增檢測技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)在PCR方法上發展起來的新興核酸檢測技術，突破了恒溫擴增的技術難點，6條引物同效率時增，敏感性高，特異性好，已在多種疾病的檢測上得到應用。目前，國內的多重LAMP方法都有一定的局限性，不能確定具體到底是哪一種陽性反應所引起的結果，不是真正意義上的鑒別診斷。

技術實現要素：

本發明提供了一種鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP檢測引物組、試劑盒及其應用，本發明首次在LAMP方法中引入了熒光基團，建立了FMDV和VSV二重熒光RT-LAMP方法，通過顏色觀察可同時鑒別診斷FMDV和VSV。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

一種鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP檢測引物組，包括2組特異性引物，其中1組為FMDV-F3、FMDV-B3、FMDV-FIP(F1c-F2)和FMDV-BIP(B1c-B2)，另1組為VSV-F3、VSV-B3、VSV-FIP(F1c-F2)和VSV-BIP(B1c-B2)，其分別具有如SEQ ID No.1至SEQ ID No.8所示的序列。

作為優選，所述的引物FMDV-FIP(F1c-F2)的5’端標記FITC熒光基團，該基團在520nm波長下呈黃綠色；所述的引物VSV-FIP(F1c-F2)的5’端標記CY5.5熒光基團，該基團在670nm波長下呈大紅色。

一種鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP檢測試劑盒，其反應體系為25μL：1μL RNA模板，10×buffer 2.5μL(成分為200Mm Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，80mM MgSO₄，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Tween 20，8M betaine，and 14m dNTPs，15U of Bst DNA聚合酶，20U AMV逆轉錄酶，內引物各40pmol，外引物各5pmol。

作為優選，所述的內引物為FMDV-FIP，FMDV-BIP，VSV-FIP和VSV-BIP，其分別具有如SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示的序列；所述的外引物為FMDV-F3，FMDV-B3，VSV-B3和VSV-F3，其分別具有如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示的序列。

本發明還提供了所述的用于鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP檢測引物組、所述的鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP檢測試劑盒在鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒中的應用。

本發明具有如下有益效果：

(1)本發明根據口蹄疫病毒(FMDV)3D基因和水泡性口炎病毒(VSV)N基因的保守序列，設計了2組特異性引物，在每條內引物的5’端標記熒光基團，通過擴增產物顏色判斷檢測結果。該方法靈敏性高，最低能夠檢測到100個混合模板拷貝/反應；特異性好，能在同一個反應管里檢測到兩種病毒，對其它牛病原體無擴增；干擾性小，擴增效率不受模板濃度影響。

(2)本發明建立的口蹄疫和水泡性口炎二重熒光RT-LAMP方法具有簡便、快速、特異、敏感等優點，可用于FMDV和VSV的臨床檢測和流行病學調查。

(3)本發明所建立的FDMV和VSV二重熒光RT-LAMP方法是一種簡便，快速，低成本的診斷方法，適用于大規模的流行病學調查。

附圖說明

圖1為本發明所建立鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP引物；

圖2為本發明所建立鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP特異性實驗結果；

其中：1-FMDV A型；2-FMDV O型；3-FMDV Asia 1型；4-VSV NJ型；5-VSV IND型；6-FMDV A型和VSV NJ型；7-14分別為：BTV4型，PPRV，BVDV，BRV，IBRV，MB，空白對照，陰性對照；圖A為520通道下電泳圖(條帶黃綠色)；圖B為670通道下電泳圖(條帶大紅色)；圖C為520和670雙通道下電泳圖(條帶紅綠混合色)。

圖3為本發明所建立鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP敏感性實驗結果電泳圖；

其中：1-7為10⁶～10⁰拷貝/μl(FMDV和VSV RNA混合模板標準品)；圖A為520通道下電泳圖(條帶黃綠色)；圖B為670通道圖(條帶大紅色)；圖C為520和670雙通道下電泳圖(條帶紅綠混合色)。

圖4為本發明所建立鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP敏感性實驗結果實時濁度圖；

其中：1-7為10⁶～10⁰拷貝/μl(FMDV和VSV RNA混合模板標準品)；8為陰性對照。

圖5為多重RT-LAMP檢測方法干擾性試驗結果；

其中：1-10⁶FMDV+10²VSV；2-10⁷FMDV+10⁴VSV；3-10²FMDV+10⁶VSV；4-10⁴FMDV+10⁷VSV；圖A為520通道下電泳圖(條帶黃綠色)；圖B為670通道下電泳圖(條帶大紅色)；圖C為520和670雙通道下電泳圖(條帶紅綠混合色)。

具體實施方式

下面結合具體實施例，對本發明作進一步詳細的闡述，但本發明的實施方式并不局限于實施例表示的范圍。這些實施例僅用于說明本發明，而非用于限制本發明的范圍。此外，在閱讀本發明的內容后，本領域的技術人員可以對本發明作各種修改，這些等價變化同樣落于本發明所附權利要求書所限定的范圍。

下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。

實施例1：

1.1材料與方法

1.1.1毒株及試劑

口蹄疫滅活疫苗A型、O型、Asia 1型購自蘭州獸醫研究所，口蹄疫滅活病毒O型、A型、Asia 1型，水泡性口炎滅活病毒新澤西型(NJ型)和印第安型(IND型)，藍舌病滅活病毒(4型，8型，9型，15型，17型，18型)，小反芻獸疫(PPRV)滅活病毒由云南出入境惠贈。3株牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)參考毒株，2株牛輪狀病毒(BRV)參考毒株，1株牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)參考毒株購自中國獸藥監察所，3株產腸毒大腸桿菌(ETEC)，3株牛支原體(MB)廣西分離株由本實驗室分離保存，本研究所使用的病毒毒株和菌株來源如表1所示。參照全式金RNA/DNA共提試劑盒說明書，抽提毒株的RNA/DNA，RNA和DNA模板置-20℃保存，備用。

表1毒株和菌株來源

注：GVRI：廣西獸醫研究所，YNCIQ：云南出入境檢疫檢測局；CVCC：中國獸藥監察所。

1.2引物設計

根據Genbank中FMDV(O型、A型、Asia 1型)的3D基因和VSV(NJ型和IND型)的N基因的保守序列，利用DNAstar MegAlign和Primer explore V4軟件，設計2組LAMP引物(參見圖1)。

每組各針對6個位點，包括4條引物：外引物F3和B3，內引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2)，在每條內引物的5’端標記熒光基團：FMDV FIP引物標記FITC熒光，在520nm波長下呈黃綠色，VSV FIP引物標記CY5.5熒光，在670nm波長下呈大紅色。引物由大連寶生物公司合成。

表2二重熒光RT-LAMP引物序列

1.3反應體系的優化

25μL反應體系：1μL RNA模板，10×buffer 2.5μL(成分為200Mm Tris–HCl(pH 8.8)，100mM KCl，80mM MgSO₄，100mM(NH4)₂SO₄，1％Tween 20，8M betaine，and 14m dNTPs(SIGMA，Tokyo，Japanese)，15U of Bst DNA聚合酶(new England)，20U AMV逆轉錄酶(Takara，大連)，內引物各40pmol(FMDV-FIP，FMDV-BIP，VSV-FIP和VSV-BIP)，外引物各5pmol(FMDV-F3，FMDV-B3，VSV-B3和VSV-F3)。各組份混合均勻，置恒溫儀或水浴鍋42℃20min，62℃(或55-68℃范圍內均可反應)反應90min，最后80℃作用5min終止反應。

1.4標準品制備

分別用PCR(premixTaq，Takara，大連)擴增FMDV外引物(FMDV-B3，FMDV-F3)片斷186bp和VSV外引物(VSV-F3，VSV-B3)片斷200bp，用瓊脂糖凝膠回收純化連入pGM-T載體(天根，北京)，篩選陽性重組菌，用試劑盒(MidiPlasmidkid，天根，北京)提取陽性重組菌的質粒。參照T7體外轉錄試劑盒(Fermentas)說明書將DNAs酶切線性化，用DNA酶消除其中DNA的污染，體外轉錄為RNA，用D260測定RNA濃度，根據阿弗加德羅常數將濃度轉換為拷貝數制備標準品，-70℃保存備用。

1.5特異性實驗

按照所建立的口蹄疫和水泡性口炎二重熒光RT-LAMP方法，檢測FMDV(A、O和Asina 1型)，VSV(NJ型，IND型)，藍舌病4型，小反芻獸疫病毒，牛病毒性腹瀉病毒，牛輪狀病毒，牛冠狀病毒的RNA以及牛支原體的DNA，驗證二重熒光RT-LAMP方法的特異性。

1.6敏感性實驗

將1.4制備的FMDV和VSV RNA模板等濃度混合并以10倍梯度系列稀釋，保證每種模板濃度為1×10⁸～1拷貝/μL，將所制備的標準樣品，用二重熒光RT-LAMP檢測，重復3次。

1.7干擾性實驗

將FMDV和VSV標準樣品按不同濃度進行組合，制備不同濃度模擬混合感染樣品：樣品1(10⁶FMDV+10²VSV)，樣品2(10⁷FMDV+10⁴VSV)，樣品3(10²FMDV+10⁶VSV)，樣品4(10⁴FMDV+10⁷VSV)。用二重熒光RT-LAMP檢測，確定高濃度模板是否會抑制低濃度模板的擴增效率。

1.8臨床樣品檢測

10份可疑牛樣品(水泡皮和水泡液拭子)采集自廣西某地區，均來自口腔出現水泡樣潰爛的牛。用二重熒光RT-LAMP對10份可疑牛樣品進行檢測，并將結果與OIE推薦的方法進行比較，驗證本方法的可靠性。

2.結果

2.1特異性結果

如圖2特異性實驗結果所示，本發明的方法只擴增FMDV和VSV核酸，以及FMDV和VSV混合模板。FMDV陽性呈黃綠色，僅在520通道下能看到；VSV陽性呈紅色，僅在670通道下能看到；FMDV和VSV混合模板呈紅綠混合色，且在520和670通道下都能觀察到。而對其它牛病毒和陰性對照均無擴增，該方法特異性好。

2.2敏感性結果

如圖3-4所示，用建立的二重熒光RT-LAMP檢測FMDV和VSV RNA混合模板標準品，結果表明二重熒光RT-LAMP靈敏度可達100個混合模板拷貝/反應，結果見圖3，圖4(圖3是在不同通道下電泳圖，圖4由時實濁度儀loopam LA-320C生成，650nm下濁度圖)，可見該方法靈敏性高。

2.3干擾性結果

如圖5所示，對不同濃度模擬混合感染樣品的檢測發現，當一個模板濃度高而另一個模板濃度較低時，二重熒光RT-LAMP仍然可同時檢測到兩個模板，不影響彼此擴增效率，干擾性小。

2.4臨床樣品檢測結果

對10份可疑牛樣品進行檢測，二重熒光RT-LAMP和OIE推薦引物同時檢測到3份FMDV陽性樣品，7份FMDV陰性樣品，0份水泡性口炎陽性樣品。該二重熒光RT-LAMP方法與OIE推薦方法檢測符合率100％，臨床效果好。

綜上所述，本發明設計了2組引物，優化篩選特異性引物組合，最終成功建立了在同一反應管里鑒別診斷口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重RT-LAMP檢測方法。二重RT-LAMP方法特異性好，能高效擴增目的基因，而對其它病原核酸無擴增，敏感性好，最低能檢測到100個混合模板拷貝/反應。綜上所述，所建立的FDMV和VSV二重熒光RT-LAMP方法是一種簡便，快速，低成本的診斷方法，適用于大規模的流行病學調查。

SEQUENCE LISTING

<110> 廣西壯族自治區獸醫研究所

<120> 鑒別口蹄疫病毒和水泡性口炎病毒的二重熒光RT-LAMP檢測引物組、試劑盒

及其應用

<130> ZYWS

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tgtgatggct tcgaagacc 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

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<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tgccacggag atcaacttct ccctcgaggc tatcctctcc tt 42

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gactcgccgt ccactctgga tctgtagctt ggaatctcaa agag 44

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

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<210> 7

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggatgtagat gggaagccat tttgatggga aatcagaccc t 41

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

acggattaca gaaagaaact actggaaatc tggttgacgc cac 43