一株能高效利用瓜氨酸的短乳桿菌及其應用的制作方法

本發明涉及一株能高效利用瓜氨酸的短乳桿菌及其應用，屬于生物發酵
技術領域：
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背景技術：
：氨基甲酸乙酯(ethylcarbamate，簡稱ec)是一種致癌物，廣泛存在于香腸、發酵酸面團、醬油、葡萄酒和黃酒等發酵食品和酒精飲料中。研究發現，黃酒中ec含量相對較高，主要由乙醇與尿素、瓜氨酸等氨甲酰基化合物在加熱條件下反應形成。因此，降低黃酒中ec前體尿素和瓜氨酸的含量成為控制ec的有效措施。黃酒中尿素主要來源于酵母的尿素循環，而瓜氨酸則主要來源于乳酸菌的精氨酸脫亞胺酶途徑。目前主要通過選育低產尿素的酵母或篩選高產脲酶的菌株應用于黃酒發酵，但是并不能同時降低瓜氨酸的含量。如果能夠篩選到不產瓜氨酸或者能夠吸收利用瓜氨酸的乳酸菌，則可以進一步解決降低ec前體的問題。在葡萄酒、香腸、發酵酸面團等發酵食品和酒精飲料生產過程中也發現了能夠重吸收瓜氨酸的乳酸菌，如葡萄酒中分離的布氏乳桿菌lactobacillusbuchnericuc-3，用于香腸發酵的清酒乳桿菌lactobacillussakeictc494，從發酵酸面團分離的發酵乳桿菌lactobacillusfermentumimdo130101等，但這些菌株需要在無精氨酸存在時才能吸收利用瓜氨酸，且只能吸收部分瓜氨酸，最多吸收300mg。本發明的意義在于從黃酒發酵液中篩選得到一種能夠高效吸收利用瓜氨酸的短乳桿菌，并將其應用于黃酒釀造中，從而能夠高效吸收并利用發酵液中的瓜氨酸，減少ec的形成，提高黃酒的飲用安全性。技術實現要素：本發明提供了一株能高效吸收利用瓜氨酸的短乳桿菌(lactobacillusbrevis)2-34。所述短乳桿菌2-34于2017年3月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno:m2017140。所述短乳桿菌l.brevis2-34分離自黃酒發酵液，分離方法如下：將黃酒發酵液用無菌生理鹽水(0.85％，w/v)按1:2比例稀釋，涂布mrs平板，置于厭氧罐中30℃培養3-5天，挑取單菌落接種至mrs液體培養基，培養2天，鏡檢確定菌株形態后，提取基因組進行16srdna鑒定。所述mrs培養基為10g/l蛋白胨，10g/l牛肉膏，5g/l酵母粉，20g/l葡萄糖，5g/l乙酸鈉，2g/l檸檬酸銨，2g/l磷酸氫二鉀，1ml/l吐溫-80，0.58g/l七水合硫酸鎂，0.25g/l一水合硫酸錳，固體培養基則另外添加20g/l的瓊脂。所述短乳桿菌l.brevis2-34為革蘭氏陽性菌，桿狀，部分細胞聚集形成短鏈，過氧化氫酶檢測為接觸酶陰性，運動型試驗證明無運動性，不還原硝酸鹽，不液化明膠，可利用阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖麥芽糖、蜜二糖、蔗糖、木糖等8種糖類，可產生乳酸。所述短乳桿菌l.brevis2-34的保藏方法為：挑取平板上的單菌落于mrs液體培養基，培養16h后吸取1ml菌液于甘油凍存管，并添加1ml50％甘油。所述短乳桿菌l.brevis2-34的培養條件為：從甘油管中吸取50μl菌液接種于3mlmrs液體培養基，30℃靜置活化培養12～16h到達對數中期，然后根據需要將種子液擴大培養。所述短乳桿菌l.brevis2-34在以精氨酸(5g/l)為前體物質的mrs培養基(即mrs-arg培養基)中生長時，精氨酸逐漸減少，瓜氨酸積累，說明該菌利用精氨酸并向胞外分泌瓜氨酸(最高達102mg/l)，至對數中期時，胞外瓜氨酸消失，之后也不再向胞外分泌瓜氨酸，說明菌體可重新吸收并利用瓜氨酸。該菌在以瓜氨酸(4g/l)為前體物質的mrs培養基(即mrs-cit培養基)中生長時，吸收瓜氨酸并將其利用，當進入對數期中期時，瓜氨酸利用率顯著提高，至成熟期即可將瓜氨酸全部吸收利用完。所述短乳桿菌l.brevis2-34在含5％～15％(v/v)酒精的mrs-arg和mrs-cit培養基中培養時，能夠繼續生長并利用精氨酸和瓜氨酸，酒精濃度越高生長速率越慢，精氨酸、瓜氨酸的利用率也越低，但經過發酵后，最終菌體濃度與在不含酒精的培養基中一致，精氨酸和瓜氨酸也都能被吸收利用。本發明提供了一種應用上述短乳桿菌l.brevis2-34于黃酒釀造提高黃酒飲用安全性的方法，將菌種活化擴培后，制備高密度菌液(108～1010cfu/l)，按0.1％～1％(ml/l)的比例與酒母、水、糯米、麥曲原料混勻后落罐，進行發酵。本發明的一種實施方式中，將短乳桿菌l.brevis2-34接種至活化培養基活化12-16h，接種到5l自動厭氧發酵罐進行高密度發酵，培養溫度30℃，ph5.0，培養時間36-48h，經15000g冷凍離心10min制備高密度菌液(108～1010cfu/l)。在不改變其它工藝的情況下，將高密度菌液(108～1010cfu/l)應用于黃酒釀造，在落罐時以0.1％～1％(ml/l)的比例與酒母、水、糯米、麥曲原料混勻后，進行發酵。本發明的有益效果本發明的短乳桿菌l.brevis2-34進行黃酒釀造，相比不添加短乳桿菌l.brevis2-34進行黃酒釀造優越之處在于，在保持黃酒風味的基礎上，顯著降低黃酒發酵液中瓜氨酸和氨基甲酸乙酯的含量，在后酵結束時，相比沒有加入短乳桿菌l.brevis2-34的黃酒發酵液，接種了短乳桿菌l.brevis2-34的醪液中瓜氨酸和氨基甲酸乙酯含量分別減少了58.2％和29.6％。此外，短乳桿菌l.brevis2-34分離自黃酒發酵醪液，屬于食品安全的乳酸菌。生物材料保藏短乳桿菌2-34lactobacillusbrevis2-34，于2017年3月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno:m2017140。附圖說明圖1短乳桿菌l.brevis2-34在mrs-arg培養基中培養時菌體濃度和氨基酸含量的變化。圖2短乳桿菌l.brevis2-34在mrs-cit培養基中培養時菌體濃度和氨基酸含量的變化。具體實施方式實施例1短乳桿菌l.brevis2-34篩選方法將黃酒發酵液用無菌生理鹽水(0.85％，w/v)按1:2比例稀釋，涂布mrs平板，置于厭氧罐中30℃培養3-5天，挑取單菌落接種至mrs液體培養基，培養2天，鏡檢確定菌株形態后，提取基因組進行16srdna鑒定。所述mrs培養基為10g/l蛋白胨，10g/l牛肉膏，5g/l酵母粉，20g/l葡萄糖，5g/l乙酸鈉，2g/l檸檬酸銨，2g/l磷酸氫二鉀，1ml/l吐溫-80，0.58g/l七水合硫酸鎂，0.25g/l一水合硫酸錳，固體培養基則另外添加20g/l的瓊脂。實施例2短乳桿菌l.brevis2-34的鑒定方法將黃酒發酵液與無菌生理鹽水(0.85％，w/v)以1:2比例稀釋，涂布到mrs平板上，在厭氧罐中生長3-5天，挑取單菌落到mrs液體培養基培養，鏡檢確定菌株形態后用ezup株式細菌基因組提取試劑盒(上海生工)提取該菌的基因組，以基因組為模板，以序列分別如seqidno:2和seqidno:3的細菌16srdna通用引物27f和1492r(5’-agagtttgatcctggctcag-3’，/5’-ggttaccttgttacgactt-3’)為引物進行pcr，擴增16srdna基因(約1400bp)，并送至上海天霖生物公司測序，將序列與ncbi已有序列比對，確定該菌為短乳桿菌(序列相似度為99％)，16srdna核苷酸序列見seqidno.1。該菌已于2017年3月23日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為cctccno:m2017140。實施例3短乳桿菌l.brevis2-34瓜氨酸利用能力的檢測將mrs培養基中活化的短乳桿菌l.brevis2-34按1％接種量接種到氨基酸檢測培養基(mrs培養基中添加5g/l精氨酸的mrs-arg以及添加4g/l瓜氨酸的mrs-cit培養基)，30℃靜置培養72h，發酵過程中連續取樣，高效液相色譜檢測發酵液中精氨酸和瓜氨酸的含量。結果顯示，該菌在mrs-arg培養基中生長時，精氨酸逐漸減少，瓜氨酸積累，至對數中期時(培養18h)瓜氨酸積累102mg/l，說明該菌利用精氨酸并向胞外分泌瓜氨酸，此后，精氨酸進一步被菌株利用，但胞外瓜氨酸消失，菌株也不再向胞外分泌瓜氨酸，說明該菌株可重新吸收并利用瓜氨酸(圖1)。該菌在mrs-cit培養基中生長時，隨著菌體生長即可吸收瓜氨酸并將其利用，培養12h進入對數期中期時，瓜氨酸利用速率顯著提高，培養至21h時，培養基中的瓜氨酸可全部被吸收利用完(圖2)。實施例4不添加短乳桿菌l.brevis2-34黃酒釀造黃酒釀造工藝流程：浸米-蒸飯-冷卻-拌曲-落罐-前酵-后酵-過濾澄清。浸米：取適量糯米，加水浸過米層10cm，28℃浸泡3天。蒸飯：浸泡后的糯米進行常壓蒸煮，大量蒸汽冒出后維持25min。冷卻：將蒸熟的糯米置于通風攤涼至室溫。拌曲：按照130g生麥曲、40g熟麥曲每1kg糯米的比例添加麥曲，并攤拌均勻。落罐：將拌好的糯米和麥曲、水(1.7l每1kg糯米)、酵母種子液(10％v/v)一起加入發酵罐，混合均勻。前酵：30℃發酵3-4天。后酵：15℃發酵15天左右。過濾澄清。實施例5短乳桿菌l.brevis2-34在黃酒釀造中的應用將短乳桿菌l.brevis2-34接種至活化培養基mrs(ph5.0)，30℃活化培養12-16h，接種到5l自動厭氧發酵罐進行高密度發酵，培養溫度30℃，ph5.0，培養時間36-48h，經15000g冷凍離心10min制備高密度菌液(1010cfu/l)。進行黃酒釀造時，在不改變其它工藝的情況下，在落罐時將高密度菌液以0.1％(ml/l)的比例與酒母、水、糯米、麥曲原料混勻后，進行發酵。實施例6短乳桿菌l.brevis2-34在黃酒釀造中的應用將短乳桿菌l.brevis2-34接種至活化培養基mrs(ph5.0)，30℃活化培養12-16h，接種到5l自動厭氧發酵罐進行高密度發酵，培養溫度30℃，ph5.0，培養時間36-48h，經15000g冷凍離心10min制備高密度菌液(108cfu/l)。進行黃酒釀造時，在不改變其它工藝的情況下，在落罐時將高密度菌液以0.5％(ml/l)的比例與酒母、水、糯米、麥曲原料混勻后，進行發酵。實施例7短乳桿菌l.brevis2-34在黃酒釀造中的應用將短乳桿菌l.brevis2-34接種至活化培養基mrs(ph5.0)，30℃活化培養12-16h，接種到5l自動厭氧發酵罐進行高密度發酵，培養溫度30℃，ph5.0，培養時間36-48h，經15000g冷凍離心10min制備高密度菌液(109cfu/l)。進行黃酒釀造時，在不改變其它工藝的情況下，在落罐時將高密度菌液以0.5％(ml/l)的比例與酒母、水、糯米、麥曲原料混勻后，進行發酵。實施例8短乳桿菌l.brevis2-34在黃酒釀造中的應用將短乳桿菌l.brevis2-34接種至活化培養基mrs(ph5.0)，30℃活化培養12-16h，接種到5l自動厭氧發酵罐進行高密度發酵，培養溫度30℃，ph5.0，培養時間36-48h，經15000g冷凍離心10min制備高密度菌液(109cfu/l)。進行黃酒釀造時，在不改變其它工藝的情況下，在落罐時將高密度菌液以1％(ml/l)的比例與酒母、水、糯米、麥曲原料混勻后，進行發酵。實施例9短乳桿菌l.brevis2-34在降低黃酒中氨基甲酸乙酯的應用以對照發酵罐黃酒醪液為參照樣，利用氣質聯用的方法，對實施例8的添加體積比為1％短乳桿菌l.brevis2-34高密度菌液釀造的黃酒醪液中的氨基甲酸乙酯進行測定，如表1所示，接種了短乳桿菌l.brevis2-34的醪液中瓜氨酸和氨基甲酸乙酯含量分別減少了58.2％和29.6％。表1黃酒醪液中瓜氨酸和氨基甲酸乙酯的含量對照組醪液添加短乳桿菌l.brevis2-34醪液瓜氨酸38.5±1.116.1±0.8氨基甲酸乙酯含量(ug/l)43.8±3.230.88±2.6雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和范圍內，都可做各種的改動和修飾，因此本發明的保護范圍應該以權利要求書所界定的為準。序列表<110>江南大學<120>一株能高效利用瓜氨酸的短乳桿菌及其應用<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>1469<212>dna<213>人工合成<400>1gggagggcggctgctatactgcagtcgaacgagcttccgttgaatgacgtgcttgcactg60attttaacaatgaagcgagtggcgaactggtgagtaacacgtggggaatctgcccagaag120caggggataacacttggaaacaggtgctaataccgtataacaacaaaatccgcatggatt180ttgtttgaaaggtggcttcggctatcacttctggatgatcccgcggcgtattagttagtt240ggtgaggtaaaggcccaccaagacgatgatacgtagccgacctgagagggtaatcggcca300cattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccaca360atggacgaaagtctgatggagcaatgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaaa420ctctgttgttaaagaagaacacctttgagagtaactgttcaagggttgacggtatttaac480cagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttg540tccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagcct600tcggcttaaccggagaagtgcatcggaaactgggagacttgagtgcagaagaggacagtg660gaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcg720gctgtctagtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagat780accctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaagtgttggagggtttccgcccttca840gtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactc900aaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagctacgc960gaagaaccttaccaggtcttgacatcttctgccaatcttagagataagacgttcccttcg1020gggacagaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtta1080agtcccgcaacgagcgcaacccttattatcagttgccagcattcagttgggcactctggt1140gagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccctta1200tgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaacgagtcgcgaagtcgtgaggct1260aagctaatctcttaaagccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaa1320gttggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgt1380acacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccaaagccggtgagataaccttcg1440ggagtcagccgtctaaggtgaccagatgg1469<210>2<211>20<212>dna<213>人工合成<400>2agagtttgatcctggctcag20<210>3<211>19<212>dna<213>人工合成<400>3ggttaccttgttacgactt19當前第1頁12