本發明屬于環境微生物領域，涉及到菌株的復壯，特別涉及到一種處理雙酚類含氮污水的異養硝化好氧反硝化菌的復壯方法。
背景技術：
傳統的氨氮污水處理需要經過自養的硝化作用和異養的反硝化作用兩個階段才能完成。由于自養硝化細菌的增殖速度慢導致硝化效率較低，從而大大增加了處理過程的耗時，整個污水處理過程脫氮效果的穩定性也容易受到影響。而且硝化和反硝化階段需要分開進行增加了能耗，同時占地面積較大、投資和運行成本較大。
異養硝化好氧反硝化細菌的發現和應用在很大程度上解決了上述問題，使得好氧條件下硝化和反硝化在同一個反應器中進行成為可能。污水中有機污染物存在較多時，異養型細菌由于利用有機物增殖速率較快，從而容易成為優勢菌種，特別是很多異養硝化好氧反硝化細菌能夠利用難降解有機物為碳源，這對于污水中有機物特別是難降解有機物去除和脫氮有著重要意義。
通常異養硝化好氧反硝化菌經過一定時間的高效運行，由于反復迭代而出現特定活性退化，或由于菌種保藏不當而出現功能降低現象，需要對其進行復壯，以維持其脫氮性能的穩定性。現有的菌種復壯技術一般利用菌種培養基進行反復培養的方法，但是通常復壯效果欠佳并且耗時較長。因此提出異養硝化好氧反硝化菌的高效復壯方法具有重要意義。本發明提供了一種復壯效果好、快速并且簡單易行的異養硝化好氧反硝化菌的復壯方法。
技術實現要素：
針對現有復壯技術中存在的不足，本發明的目的在于提供一種降解雙酚類含氮污水的異養硝化好氧反硝化菌的復壯方法，以為雙酚類含氮污水的處理提供持續的微生物源。
本發明的技術方案：
一種降解雙酚類含氮污水的異養硝化好氧反硝化菌的復壯方法，步驟如下：
(1)對需要復壯的菌種進行馴化培養：
(1.1)配制液體培養基i，各種物質的濃度配比為：(nh4)2so40.1-0.5g/l、檸檬酸鈉1-3g/l、乙酸鈉1-3g/l、k2hpo4·2h2o5-6g/l、kh2po42-3g/l、mgso4·7h2o0.2-0.8g/l、cacl20.02-0.1g/l，ph調節至6.8-7.2；
(1.2)配制雙酚類含氮配水，各種物質的濃度配比為：(nh4)2so40.01-0.02g/l、雙酚類物質0.2-0.5g/l、k2hpo4·2h2o5-6g/l、kh2po42-3g/l、mgso4·7h2o0.2-0.8g/l、cacl20.02-0.1g/l，ph調節至6.8-7.2；
將配制的液體培養基i和雙酚類含氮配水進行滅菌處理；
(1.3)在無菌條件下配制三類液體培養基：
第一類為100％體積的液體培養基i；
第二類包括多個液體培養基，每個由不同體積比例的液體培養基i和雙酚類含氮配水配成，并且液體培養基i所占的體積比例按遞減的順序配制，液體培養基i的體積比例范圍為90％～10％；雙酚類含氮配水所占的體積比例按遞增的順序配制，雙酚類含氮配水的體積比例范圍為10％～90％；
第三類為100％體積的雙酚類含氮配水；
將配好的三類液體培養基進行滅菌處理；
(1.4)將需要復壯的菌種進行逐步馴化培養，首先使用第一類液體培養基，馴化培養1-2d；再按所配液體培養基中雙酚類含氮配水所占的體積比例遞增的順序更換第二類液體培養基，每更換一次馴化培養1-2d；最后更換第三類液體培養基，馴化培養1-2d；
馴化培養的具體步驟為：在無菌條件下，首先用磷酸鹽緩沖液將需要復壯的異養硝化好氧反硝化菌種清洗并離心2-3次，去掉上清液，接著加入磷酸鹽緩沖液進行震蕩重懸，得到均勻菌液，移取菌液接種至步驟(1.3)配制的液體培養基中，使得初始菌種的濃度為od600＝0.1-0.15，最后將液體培養基置于無菌、30-35℃、100-150rpm的條件下進行馴化培養；其中，磷酸鹽緩沖液中各物質的濃度配比為：k2hpo4·2h2o5-6g/l、kh2po42-3g/l，將磷酸鹽緩沖液ph調節至6.8-7.2；離心條件為：8000-10000×g、5min、4℃；od600為在600nm波長下測得的細菌濃度；
(2)對馴化培養后的細菌進行分離純化：
配制固體培養基，各種物質的濃度配比為：(nh4)2so40.1-0.5g/l、檸檬酸鈉1-3g/l、乙酸鈉1-3g/l、k2hpo4·2h2o5-6g/l、kh2po42-3g/l、mgso4·7h2o0.2-0.8g/l、cacl20.02-0.1g/l、瓊脂20g/l，ph調節至6.8-7.2；
用平板劃線法將馴化培養后的細菌接種至滅菌固體培養基，將平板倒置于30-35℃恒溫培養箱中培養2-3d以得到單一菌落；
(3)對有效菌種進行初篩：
a.挑取平板中的單一菌落分別接種至第一類液體培養基中，將接種后的第一類液體培養基置于30-35℃、100-150rpm條件下恒溫震蕩培養1-2d，取樣測定氨氮及總氮去除率；
b.對測定的氨氮及總氮去除水平達到菌種正常去除水平80％以上的菌株，以od600為0.1-0.15的接種量分別接種至第三類液體培養基中，將接種后的第三類液體培養基置于30-35℃、100-150rpm條件下恒溫震蕩培養2-3d，取樣測定雙酚類污染物、氨氮及總氮去除率；
重復步驟b，直到測定的雙酚類污染物、氨氮及總氮去除達到退化前正常去除水平并保持穩定。
(4)對有效菌種進行氮平衡分析。將步驟(3)中得到的菌株以od600為0.1-0.15的接種量接種至雙酚類含氮配水中，并接入由氧氣和氦氣組成的混合氣(體積比3/7)進行曝氣，待曝氣10-20min之后將反應體系進行密封處理，于30-35℃培養箱中靜止培養2-3d。產生的氣體用氣相色譜法(gc)測定，得到n2和n2o的濃度；測定液體部分總氮、氨氮、硝態氮及亞硝態氮的濃度，用冷凍干燥法處理菌體部分，測定菌體細胞內有機氮的濃度，通過對氮素的定量計算確定菌株對氨氮的代謝特性，得到高效降解雙酚類含氮污水的異養硝化好氧反硝化菌株。
本發明的效果和益處：本發明提供了一種高效、簡單易行的異養硝化好氧反硝化菌的復壯方法。采用含普通碳源的培養基進行培養，逐漸加入雙酚類含氮配水并提高其配比，使得微生物經過一個循序漸進的馴化過程并逐漸恢復其對雙酚類污染物的適應能力，最后得到以雙酚類污染物為碳源的異養硝化好氧反硝化菌株。該方法相對于直接用含普通碳源的培養基或雙酚類含氮配水反復培養進行復壯的方法，復壯的成功率更高，而且在操作上簡單易行，耗時較少。并且利用雙酚類污染物的降解情況、氨氮去除率及其轉化為氣態氮的轉化率等作為評價復壯菌株性能的指標，比較全面。
具體實施方式
正常的hs-2菌種是具有高效降解雙酚f含氮配水功能的異養硝化好氧反硝化細菌，本實施方式對功能已發生退化的hs-2菌株進行復壯，步驟如下：
(1)對需要復壯的hs-2菌種進行馴化培養：
(1.1)配制液體培養基i，各種物質的濃度配比為：(nh4)2so40.3g/l、檸檬酸鈉2g/l、乙酸鈉2g/l、k2hpo4·2h2o5.5g/l、kh2po42.6g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、cacl20.02g/l，ph調節至7.0；
(1.2)配制雙酚f含氮配水，各種物質的濃度配比為：(nh4)2so40.012g/l、雙酚f0.3g/l、k2hpo4·2h2o5.5g/l、kh2po42.6g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、cacl20.02g/l，ph調節至7.0；
將配制的液體培養基i和雙酚f含氮配水進行滅菌處理；
(1.3)在無菌條件下配制三類液體培養基：
第一類為100％體積的液體培養基i；
第二類包括多個液體培養基，每個由不同體積比例的液體培養基i和雙酚f含氮配水配成，并且液體培養基i所占的體積比例按遞減的順序配制，液體培養基i的體積比例范圍為80％、60％、40％、20％；雙酚f含氮配水所占的體積比例按遞增的順序配制，雙酚f含氮配水的體積比例范圍為20％、40％、60％、80％；
第三類為100％體積的雙酚f含氮配水；
將配好的三類液體培養基進行滅菌處理；
(1.4)將需要復壯的菌種進行逐步馴化培養，首先使用第一類液體培養基，馴化培養1d；再按80％體積的液體培養基i與20％體積的滅菌雙酚f含氮配水組成的培養基、60％體積的液體培養基i與40％體積的滅菌雙酚f含氮配水組成的培養基、40％體積的液體培養基i與60％體積的滅菌雙酚f含氮配水組成的培養基、20％體積的液體培養基i與80％體積的滅菌雙酚f含氮配水組成的培養基的順序更換第二類液體培養基，每更換一次馴化培養1d；最后更換第三類液體培養基，馴化培養1d；
馴化培養的具體步驟為：在無菌條件下，首先用磷酸鹽緩沖液將需要復壯的異養硝化好氧反硝化菌種清洗并離心2次，去掉上清液，接著加入磷酸鹽緩沖液進行震蕩重懸，得到均勻菌液，移取菌液接種至步驟(1.3)配制的液體培養基中，使得初始菌種的濃度為od600＝0.1，最后將液體培養基置于無菌、35℃、150rpm的條件下進行馴化培養；其中，磷酸鹽緩沖液中各物質的濃度配比為：k2hpo4·2h2o5.5g/l、kh2po42.6g/l，將磷酸鹽緩沖液ph調節至7.0；離心條件為：10000×g、5min、4℃；od600為在600nm波長下測得的細菌濃度；
(2)對馴化培養后的細菌進行分離純化：
配制固體培養基，各種物質的濃度配比為：(nh4)2so40.3g/l、檸檬酸鈉2g/l、乙酸鈉2g/l、k2hpo4·2h2o5.5g/l、kh2po42.6g/l、mgso4·7h2o0.2g/l、cacl20.02g/l、瓊脂20g/l，ph調節至7.0；
用平板劃線法將馴化培養后的細菌接種至滅菌固體培養基，將平板倒置于35℃恒溫培養箱中培養2d以得到單一菌落；
(3)對有效菌種進行初篩：
a.挑取平板中的haw1-12共12個單菌落分別接種至第一類液體培養基中，將接種后的第一類液體培養基置于35℃、150rpm條件下恒溫震蕩培養1d，取樣測定氨氮及總氮去除率；
b.對測定的氨氮及總氮去除水平達到菌種正常去除水平80％以上的菌株haw2-4、haw6、haw8-10，以od600為0.1的接種量分別接種至第三類液體培養基中，將接種后的第三類液體培養基置于35℃、150rpm條件下恒溫震蕩培養2d，取樣測定雙酚f、氨氮及總氮去除率；
重復步驟b，直到篩選出雙酚f、氨氮及總氮去除率分別達到99％、96％及90％并保持穩定的兩個菌株haw3、haw6。
(4)對有效菌種進行氮平衡分析。將步驟(3)中得到的菌株haw3和haw6分別以od600為0.1的接種量接種至雙酚f含氮配水中，并接入由氧氣和氦氣組成的混合氣(體積比3/7)進行曝氣，待曝氣10min之后將反應體系進行密封處理，于35℃培養箱中靜止培養2d。產生的氣體用氣相色譜法(gc)測定，得到n2和n2o的濃度；測定液體部分總氮、氨氮、硝態氮及亞硝態氮的濃度，用冷凍干燥法處理菌體部分，測定菌體細胞內有機氮的濃度，通過對氮素的定量計算確定菌株對氨氮的代謝特性，得到的菌株haw6能夠將47％以上的初始氨氮轉化為n2，與退化之前的正常菌株功能相同。