多重PCR引物、試劑盒及用途的制作方法

相關申請本申請是申請日為2015年11月4日，名稱為“一種基于下一代測序技術檢測β-地中海貧血突變的多重pcr引物和方法及應用”的中國專利申請201510740909.5的分案。本發明屬于分子生物學領域，涉及引物，特別涉及多重pcr引物、試劑盒及用途。
背景技術：
：β-地中海貧血是一種由于β-珠蛋白基因(hbb)突變導致肽鏈表達失衡而產生的單基因遺傳血液病，多由β-珠蛋白基因點突變所致。β-地中海貧血是世界上最常見的遺傳性之一，據統計全世界約有1億多人攜帶β-地中海貧血基因。β-地中海貧血也是我國南方各省最常見、危害最大的遺傳病之一，我國部分省份的β-地中海貧血攜帶率見表1。地中海貧血基因主要為點突變，在中國南方人群中β-地中海貧血基因覆蓋了46種點突變。表1中國南方β地貧的人群攜帶率地區β地貧攜帶率(％)廣州2.54廣西6.78四川2.18貴州4.72臺灣1.10香港3.41β-地中海貧血的基因診斷方法主要有：sanger測序法、限制性片段長度多態性(rflp)、反向點雜交(rdb)、等位基因特異性pcr(arms-pcr)。sanger測序方法操作較繁瑣，極大地限制了其在臨床診斷中的應用，測序的檢測通量也有限，并且對檢測結果需要人工分析，分析耗時耗力。rflp是通過識別特異性序列位點進行酶切反應，方法簡便成本低廉，但其局限性是只能對有限的可產生酶切位點的突變進行檢測，由于不完全或部分酶切反應還會導致假陽性或假陰性結果。反向點雜交技術的結果是用肉眼判讀，失誤率高，往往造成一份樣本反復檢測。arms-pcr需針對每個突變設計相應引物，每一對引物擴增條件都需優化，若需同時檢測多種突變時則操作繁瑣，而且也會出現假陽性或假陰性結果。基于地中海貧血缺陷基因的市場和社會檢測需求，以及目前地中海貧血缺陷基因檢測現狀的落后，利用高通量測序技術開發地中海貧血基因突變位點檢測試劑盒勢在必行。技術實現要素：鑒于此，本發明提供了一種基于下一代測序技術檢測β-地中海貧血突變的多重pcr引物和方法及應用。第一方面，本發明提供了一種多重pcr引物。根據本發明的實施例，所述多重pcr引物由三對引物對組成：所述三對引物為與seqidno:1和seqidno:2所示引物對、seqidno:3和seqidno:4所示引物對以及seqidno:5和seqidno:6所示引物對分別對應的引物序列，所述三對引物對中的至少一條引物序列比seqidno:1-6中的相應序列的3’端多或者少0～3個核苷酸。該多重pcr引物由三對引物組成，即六條序列組成，該六條序列與seqidno：1-6一一對應，所稱的“對應”表現在：該六條序列中的一條、兩條、三條、四條、五條或者全部六條與seqidno:1-6中的相應序列，在3’端多或者少0～3個核苷酸。所稱序列的3'端和5'端是相對的，在本文中，3'端和5'端照本領域常規定義或者本領域技術人員常規理解。發明人基于目標序列特點多次設計，以及多次組合試驗篩選，確定了這一組多重pcr引物，該組引物均針對相同的基因hbb，序列具有接近的tm值以及gc比例，利于在同一反應體系同一條件下進行有效擴增。而且，利用該組引物擴增獲得的擴增產物的長度接近，利于后續擴增產物的分離提取操作以及進一步分析。利用該多重pcr引物，能夠一次性獲得高保真的hbb基因序列的至少一部分，繼而能夠用于一次性高效地檢測hbb基因上的多個突變位點。所稱的三對引物，與seqidno:1和seqidno:2引物對相對應的引物對，能夠在同一反應體系中不受其它引物對的影響地實現目標區域的至少一部分的擴增，同樣地，與seqidno:3和seqidno:4引物對對應的引物對、以及與seqidno:5和seqidno:6引物對對應的引物對也能夠在同一反應體系中不受其它引物對干擾或影響地實現目標區域的至少一部分的擴增。本發明提供的多重pcr引物能夠用于高效的獲取hbb基因序列，以及用于β-地中海貧血突變多樣性的高效檢測，可覆蓋中國南方人群β-地中海貧血突變的多個點突變位點。根據本發明的實施例，上述多重pcr引物還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：根據本發明的實施例，所述三對引物對為seqidno:1和seqidno:2所示引物對、seqidno:3和seqidno:4所示引物對以及seqidno:5和seqidno:6所示引物。根據本發明的實施例，所述多重pcr引物還包括以下引物對中的一對、兩對和全部三對：seqidno:7和seqidno:8所示引物對、seqidno:9和seqidno:10所示引物對、以及seqidno:11和seqidno:12所示引物對。seqidno:7和seqidno:8所示引物對、seqidno:9和seqidno:10所示引物對、和/或seqidno:11和seqidno:12所示引物對分別/均能夠在同一反應體系中不受其它引物對的影響地高保真地實現hbb基因序列的至少一部分的擴增，以及用于β-地中海貧血突變多樣性的高效檢測。本領域技術人員可以理解，一組能夠在同一反應體系同一條件下實現目標區域準確、高保真擴增的引物對序列，其中的任一部分引物對序列的組合，也同樣能夠在同一反應體系同一條件下實現目標區域的有效擴增；反之也成立。第二方面，本發明提出了前面第一方面或者任一實施例中的多重pcr引物在獲得和/或檢測hbb基因序列中的用途。第三方面，本發明提出了一種試劑盒。根據本發明的實施例，所述試劑盒包括前面第一方面或者任一實施例中的多重pcr引物。前述對本發明一方面或者任一實施例中多重pcr引物的優點和技術特征的描述，同樣適用本發明這一方面的試劑盒，在此不再贅述。第四方面，本發明提出了所稱的試劑盒在下列至少之一中的用途：獲得和/或檢測hbb基因序列；檢測β-地中海貧血癥；檢測β-地中海貧血突變多態性。第五方面，本發明提出了一種獲得hbb基因序列的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括利用前面任一實施例中的多重pcr引物進行擴增的步驟。前述對本發明一方面或者任一實施例中多重pcr引物的優點和技術特征的描述，同樣適用本發明這一方面的試劑盒，在此不再贅述。該方法能夠高效地獲得高保真的hbb基因序列，利于hbb基因序列的后續檢測分析。第六方面，本發明提出了一種檢測hbb基因序列的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：(1)利用前面的獲得hbb基因序列的方法對待測樣品中的至少一部分核酸進行擴增，獲得擴增產物；(2)分析所述擴增產物，以獲得hbb基因檢測結果。根據本發明的實施例，上述hbb基因檢測的方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：根據本發明的實施例，所述核酸為dna和/或rna。根據本發明的具體實施例，當所述核酸為dna時，進行多重pcr的體系可參照普通pcr體系進行配置。根據本發明的實施例，所述核酸為rna，步驟(1)包括：(1-1)利用所述多重pcr引物中的上游或下游引物將所述rna反轉錄為cdna；(1-2)利用所述多重pcr引物中相應的下游或上游引物對所述cdna進行擴增，獲得雙鏈dna；(1-3)利用所述多重pcr引物對所述雙鏈dna進行擴增，獲得所述擴增產物。根據本發明的具體實施例，當所述取核酸為rna時，要先進行逆轉錄合成cdna，再合成第二鏈dna，獲得雙鏈dna，以獲得后續多重pcr的模板。逆轉錄合成cdna的步驟可看作是一個循環的多重pcr(只采用上游引物組或下游引物組)，合成第二鏈dna的步驟也可看作是一個循環的多重pcr(只采用下游引物組或上游引物組)。根據本發明的實施例，所述多重pcr反應的體系中，上游引物組中的各上游引物等摩爾混合；下游引物組中的各下游引物等摩爾混合。根據本發明的具體實施例，所述多重pcr反應的體系中，模板量50ng～1μg/50μl體系。根據本發明的具體實施例，所述多重pcr反應的程序為：上述程序具體為：95℃預變性15min，95℃變性15s，60℃退火2min，72℃延伸3min，循環30～40次(優選為35次)，最后72℃后延伸10min。根據本發明的再一具體實施例，所述多重pcr反應結束后，電泳，割膠回收片段長度為240-270bp的dna片段。如本發明所述的，“上游引物組”或“下游引物組”為如第一方面所述的多重pcr引物中各引物對的上游引物或下游引物組成的上游引物組或下游引物組；具體地，本發明用“f”表示上游引物，用“r”表示下游引物，如表2所示。根據本發明的實施例，步驟(2)包括：(2-1)對所述擴增產物進行測序；以及(2-2)將測序結果與hbb基因野生型序列比對，以確定hbb基因的突變位點。第七方面，本發明提出了一種檢測β-地中海貧血癥的方法。根據本發明的實施例，所述方法包括：利用前面所述的hbb基因檢測方法進行hbb基因檢測，獲得檢測結果，所述待測樣品來自受檢者；以及依據檢測結果，評估受檢者的患β-地中海貧血癥風險。根據本發明的實施例，上述檢測β-地中海貧血癥的方法還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：根據本發明的實施例，利用前面所述的hbb基因檢測方法進行hbb基因檢測，獲得檢測結果是通過如下方式實現的：將所得多重pcr產物進行建庫，進行高通量測序，并通過生物信息學分析獲得高通量測序結果。進而依據測序結果，分析β-地中海貧血突變，評估受檢者的患β-地中海貧血癥風險。根據本發明的具體實施例，所述檢測結果具有表3所示的突變位點的至少之一，是患者患有β地中海貧血癥的指示。本發明提供的基于下一代測序技術檢測β-地中海貧血突變的多重pcr引物及方法的有益效果為：1)覆蓋了南方人群幾十種點突變位點；2)平均擴增產物的長度在250bp左右，擴增的產物可用于所有的下一代測序平臺。本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發明的實踐了解到。附圖說明本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：圖1為本發明實施例提供的單獨引物pcr的瓊脂糖凝膠電泳圖；圖2為本發明實施例提供的多重pcr的瓊脂糖凝膠電泳圖；以及圖3為本發明實施例提供的測序深度的生物信息學分析結果。具體實施方式下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。材料及試劑說明：β地中海貧血患者：來源于深圳市人民醫院，患者知情同意。非特殊說明，本發明實施例采用的試劑均為市售商品，本發明實施例采用的數據庫均為公開的在線數據庫。具體地，本發明引物如表2所示：表2：多重pcr引物序列設計引物：采用oligo7.0和mfeprimer-2.0對引物二聚體以及莖環錯配進行分析，在包含突變位點的外顯子兩端設計引物，擴增的序列平均長度在250bp左右，且6對引物的退火溫度基本一致。本實施例提供的引物組覆蓋了南方人群46個點突變位點。由于很小的序列變化將導致引物擴增效果顯著降低，發明人分別針對不同目的區域的不同區段設計了多組多重pcr引物組，在經過預實驗篩選后，綜合產物片段長度和點突變覆蓋范圍，本發明選取了擴增效果最佳的引物組，如表2所示。表3為46種見于中國南方人群導致表達降低的β地中海貧血點突變及對應的本發明的引物。表3實施例1實施例1提供了一種β-地中海貧血突變待測dna樣品的制備方法，包括如下步驟：收集的新鮮外周血樣本各2毫升(ml)，采用qiaampdnaminikit(qiagen,cat.no:51304)試劑盒提取基因組dna，并用nanodrop2000(thermo)測定dna的濃度及純度，然后保存基因組dna。實施例2實施例2提供了一種采用檢測β-地中海貧血突變的多重pcr引物構建β-地中海貧血突變測序文庫的方法，包括如下步驟：1、多重pcr：以實施例1所得基因組dna為擴增模板，采用seqidno:1～seqidno:12所示共6對引物對，再采用qiagen公司multiplexpcr試劑盒(貨號：206143)，按試劑盒說明書配置多重pcr體系。反應體系如表4所示：表4：多重pcr緩沖液(multiplexbuffer,2×)25μlq溶劑(qsolution,5×)10μl引物5μldna10μltotal50μl各引物等摩爾混合，引物總濃度是10微摩爾，模板量可以調整，本實施例中采用200ng。再按下述多重pcr的條件設置pcr儀器程序，進行多重pcr：pcr結束后，4℃保存pcr產物并電泳檢測，在紫外下切下約240-270bp左右的目的片段。直接回收剩余的pcr產物，得到27ul純化后的產物，回收步驟采用qiagen公司qiaquick膠純化試劑盒，按常規實驗室操作進行)。為充分說明書本發明實施例的有益效果，本發明單獨對表2中的6對引物進行pcr預實驗，pcr體系和循環參數等均與上述多重pcr一樣，除引物分別替換為表2的p1(hbb-1f和hbb-1r)、p2(hbb-2f和hbb-2r)、p3(hbb-3f和hbb-3r)、p4(hbb-4f和hbb-4r)、p5(hbb-5f和hbb-5r)和p6(hbb-6f和hbb-6r)共6對引物。6對引物單獨pcr的擴增產物電泳圖譜如圖1所示。6對引物的退火溫度基本一致，擴增效率一致，擴增產物長度基本接近，平均長度在250bp左右。6對引物的擴增產物覆蓋了β-地中海貧血突變的46種點突變位點。2、加尾：取純化后的pcr產物，在產物3’末端加a尾，配置體系如表5所示(其中，klenowexo-購自neb，貨號：m0212)：表5：10×neb2buffer5μldatp(1mm)10μlklenowexo-3μldna32μltotal50μl將該體系置于37℃下30min。利用qiagen公司qiaquick膠純化試劑盒純化加a尾的pcr產物。3、加接頭：在dna兩端加上測序用的接頭，配置體系如表6所示(其中，quickligase購自neb，m2200l)：表6：5×quickligasebuffer10μladaptor1μlquickligase5μl加a尾的pcr產物25μlh2o9μltotal50μl其中，adaptor的序列如seqidno：13所示：5’-/5phos/gatcggaagagcacacgtctgaactccagtc/ideoxyu/acactctttccctacacgacgctcttccgatc*t-3’(seqidno：13)。隨后將該體系置于20℃下15min。然后加入3μl的user，37℃放置15min。最后通過qiagen公司qiaquick膠回收試劑盒純化連接產物。4、產物上加入測序用的標簽序列，配置體系如表7所示(具體步驟參照illumina高通量測序文庫構建說明書)表7：5×q5solutionbuffer10μldntp(10mm)1μlp1(p5序列+common序列+接頭序列)1μlindex(p7序列+標簽序列index+接頭序列)1μlq5酶0.5μl純化后的連接產物36.5μltotal50μl將配置的體系按下述程序進行pcr反應：pcr結束后，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳驗證pcr產物富集片段的大小，選取370bp的目的片段進行切膠回收，并純化至30μl。瓊脂糖凝膠電泳結果圖2所示。在圖2中，t1泳道可以明顯看到在300bp-400bp之間有一條帶，為加上接頭的片段(370bp，箭頭所指處)，與理論相符。5、將步驟4獲得的純化產物直接用miseq平臺測序進行測序。測序結果是fastq格式的數據，通過生物信息學分析獲得β地中海貧血點突變情況。測序深度見圖3。本實施例使用pe150試劑盒進行測序，即片段兩端各測序150bp。生物信息學分析測序深度如圖3所示，橫坐標是利用每對引物得到的擴增產物，縱坐標是測序深度。由圖3可知，本實施例測序結果中覆蓋了所有引物對的擴增產物，并且分布比較平均。效果實施例1采用實施例2的方法，對14例樣品分別進行多重pcr、加a尾、加接頭、加標簽序列、高通量測序及生物信息學分析，獲得如下結果，部分結果如表8所示：表8：β-地中海貧血突變檢測結果如表8所示，在14例樣品中，共檢測到11處突變。特別值得注意的是，經過對樣品測序的數據分析，證實所設計的目標序列在每個dna樣品中均得到有效的擴增，從而反映出所提供的檢測方案具有較好的特異性和適用性。在本發明的描述中，除非另有說明，“多個”的含義是兩個或兩個以上。在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示意性實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的范圍由權利要求及其等同物限定。sequencelisting<110>深圳市瀚海基因生物科技有限公司<120>多重pcr引物、試劑盒及用途<130>pi2015018_1<160>13<170>patentinversion3.3<210>1<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-1f）<400>1gtccaactcctaagccagt19<210>2<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-1r）<400>2cctcaggagtcagatgcac19<210>3<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-2f）<400>3agaagtctgccgttactgc19<210>4<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-2r）<400>4gacagatccccaaaggact19<210>5<211>16<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-3f）<400>5caagacaggtttaagg16<210>6<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-3r）<400>6ccaggtgagccaggccat18<210>7<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-4f）<400>7caacctcaagggcaccttt19<210>8<211>25<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-4r）<400>8agcaaataaaagaaactaaaacgat25<210>9<211>25<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-5f）<400>9aacagtgataatttctgggttaagg25<210>10<211>18<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-5r）<400>10ccaaagtgatgggccagc18<210>11<211>19<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-6f）<400>11caggctgcctatcagaaag19<210>12<211>21<212>dna<213>artificial<220><223>多重pcr引物（hbb-6r）<400>12atgcactgacctcccacattc21<210>13<211>65<212>dna<213>artificial<220><223>adaptor的序列<220><221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>磷酸化修飾<220><221>misc_feature<222>(32)..(32)<223>脫氧修飾<220><221>misc_feature<222>(65)..(65)<223>硫代磷酸酯修飾<400>13gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcuacactctttccctacacgacgctcttcc60gatct65當前第1頁12