試劑盒及試劑在制備試劑盒中的用途的制作方法

本發明涉及生物領域，具體地，本發明涉及用于診斷急性冠脈綜合征的試劑盒及試劑在制備試劑盒中的用途。

背景技術：

急性冠脈綜合征主要包括不穩定型心絞痛、急性心肌梗死和心源性猝死。急性冠脈綜合征的主要病理基礎是冠狀動脈斑塊發生破裂、繼發血栓形成所致。盡早識別發生斑塊破裂的患者，及時給予抗血栓治療，對于預防和阻止這些患者發生惡性不良心血管事件(如急性心肌梗死)具有非常重要的臨床意義。然而現在并沒有很好的診斷手段或標志物，用于識別發生冠狀動脈斑塊破裂的患者。對于臨床上最常見的急性心肌梗死患者，往往在斑塊破裂、繼發血栓形成后，出現血液中心肌肌鈣蛋白升高時方可診斷，這時患者心肌已經發生不可逆損害。如果能夠尋找到可用于早期診斷斑塊破裂的循環標志物，那么這部分心肌梗死患者會因為及早得到相應的治療，而避免發生不可逆的心肌壞死。

雖然現在也有一些關于斑塊破裂標志物的研究，如一些細胞因子、生長因子、酶等，但這些標志物距離臨床應用還有很遠的距離。

因此，冠狀動脈斑塊發生破裂的及早診斷仍是科研工作者拭待解決的關鍵問題。

技術實現要素：

本申請是基于發明人對以下事實和問題的發現和認識作出的：

mirnas是長約20-22nt、單鏈、非編碼rna，在轉錄后水平負向調節基因表達。研究表明，mirnas通過調控多個生物信號通路，參與動脈粥樣硬化起始、發展及斑塊破裂的全過程。血液中的mirnas因與轉運蛋白結合，或包裹在微顆粒或外泌體內，不易被降解而穩定存在于血液循環中。大量試驗數據表明，循環mirnas可能是診斷冠心病的新型生物標志物。并且發明人發現，經皮冠脈介入治療的患者，會因球囊擴張和置入支架而出現斑塊損傷、破裂。基于上述研究背景和發現，發明人利用經皮冠脈介入治療所造成的斑塊破裂這特點，作為研究人體冠狀動脈斑塊破裂標志物的天然模型，篩選了球囊擴張前(0h組，即對照組)和擴張后1h(1h組，即斑塊破裂組)差異表達的循環mirnas。發明人驚喜地發現，mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a在球囊擴張前(0h組，即對照組)和擴張后1h(1h組，即斑塊破裂組)具有顯著的差異表達，mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a可作為臨床診斷急性冠脈綜合征和冠狀動脈斑塊發生破裂早期的可靠指標。

為此，在本發明的第一方面，本發明提出了試劑在制備試劑盒中的用途，所述試劑盒用于診斷診斷急性冠脈綜合征，所述試劑用于檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一。發明人通過實驗驚喜地發現，mir-155-5p、mir-483-5p或mir-451a在斑塊破裂前后具有顯著的表達差異，其在冠狀動脈斑塊發生破裂的早期診斷中有較好的診斷價值。用于檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的試劑制備的試劑盒可有效用于診斷急性冠脈綜合征，具有敏感性高、特異性強的特點。

根據本發明的實施例，上述用途還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，所述試劑盒用于診斷冠狀動脈斑塊發生破裂早期。用于檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的試劑制備的試劑盒可更加有效地用于診斷冠狀動脈斑塊發生破裂早期，具有敏感性更高、特異性更強的特點。

根據本發明的實施例，所述早期是指冠狀動脈斑塊發生破裂后的1小時內。發明人經過實驗發現，用于檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的試劑制備的試劑盒可有效用于診斷在1小時內發生破裂的冠狀動脈斑塊的破裂，具有高敏感性的特點。

根據本發明的實施例，所述早期是指冠狀動脈斑塊發生破裂后的0.5小時。發明人發現，在冠狀動脈斑塊發生破裂后的0.5小時，單獨檢測mir-155-5p、mir-483-5p或mir-451a，其auc均大于0.7，其敏感性分別為89.66,89.66,62.07，特異性分別為44.83,79.31,82.76，表明在冠狀動脈斑塊發生破裂后的0.5小時，單獨檢測mir-155-5p、mir-483-5p或mir-451a具有較好的診斷價值；且發明人發現，聯合診斷mir-155-5p/mir-483-5p或mir-483-5p/mir-451a,診斷價值更高，其auc分別為0.948，0.982，敏感性分別為79.31，96.55，特異性分別為96.55，89.66。

根據本發明的實施例，所述早期是指冠狀動脈斑塊發生破裂后的1小時。發明人發現，在冠狀動脈斑塊發生破裂后的1小時，單獨檢測mir-155-5p或mir-483-5p，其auc均大于0.7，其敏感性分別為72.41，82.76，特異性分別為68.97，82.76，表明在冠狀動脈斑塊發生破裂后的1小時，單獨檢測mir-155-5p或mir-483-5p具有較好的診斷價值；且發明人發現，聯合診斷mir-155-5p/mir-483-5p或mir-483-5p/mir-451a診斷價值更高，其auc分別為0.898，0.891，敏感性分別為89.66，82.76，特異性分別為75.86，79.31。

根據本發明的實施例，所述試劑為用于識別mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的探針、抗體、活性因子或用于擴增mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的引物。用于識別mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a至少之一的的探針、抗體或活性因子能夠特異性識別mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一，用于擴增mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的引物能夠特異性擴增mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一，從而通過pcr，檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的表達量，其中mir-155-5p、mir-483-5p的表達量增加或mir-451a的表達量下降，是早期冠狀動脈斑塊發生破裂的指示。

根據本發明的實施例，所述探針具有seqidno：1～6所示的核苷酸序列，所述引物具有seqidno：7～12所示的核苷酸序列。具有seqidno：1～6所示的核苷酸序列的探針可通過堿基互補配對與mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一特異性結合，具有seqidno：7～12所示的核苷酸序列的引物能夠特異性擴增mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一，獲得的擴增條帶清晰，雜帶少。

acccctatcacgattagcattaa(seqidno：1)。

ctcccttctttcctcccgtctt(seqidno：2)。

aactcagtaatggtaacggttt(seqidno：3)。

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacccct(seqidno：4)。

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctccct(seqidno：5)。

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaactca(seqidno：6)。

gcgcgcgttaatgctaatcgtgat(seqidno：7)。

atccagtgcagggtccgagg(seqidno：8)。

gcgcgaagacgggaggaaaga(seqidno：9)。

atccagtgcagggtccgagg(seqidno：10)。

cgcgcgaaaccgttaccattac(seqidno：11)。

atccagtgcagggtccgagg(seqidno：12)。

其中，特異性識別mir-155-5p的探針具有seqidno：1或4所示核苷酸序列；特異性識別mir-483-5p的探針具有seqidno：2或5所示核苷酸序列；特異性識別mir-451a的探針具有seqidno：3或6所示核苷酸序列；seqidno：7和8是用于擴增mir-155-5p的特異性引物；seqidno：9和10是用于擴增mir-483-5p的特異性引物；seqidno：11和12是用于擴增mir-451a的特異性引物。

本發明的第二方面，本發明提出了一種用于診斷急性冠脈綜合征的試劑盒。根據本發明的實施例，所述試劑盒包括試劑，所述試劑用于檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一。發明人通過實驗驚喜地發現，mir-155-5p、mir-483-5p或mir-451a在斑塊破裂前后具有顯著的表達差異，其在冠狀動脈斑塊發生破裂的早期診斷中有較好的診斷價值。包括用于檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的試劑的試劑盒可有效用于診斷急性冠脈綜合征，具有敏感性高、特異性強的特點。

根據本發明的實施例，上述試劑盒還可以進一步包括如下附加技術特征至少之一：

根據本發明的實施例，所述試劑盒用于診斷冠狀動脈斑塊發生破裂早期。包含用于檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的試劑的試劑盒可更加有效地用于診斷冠狀動脈斑塊發生破裂早期，具有敏感性更高、特異性更強的特點。

根據本發明的實施例，所述早期是指冠狀動脈斑塊發生破裂后的1小時內。發明人經過實驗發現，包含用于檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的試劑的試劑盒可有效用于診斷在1小時內發生破裂的冠狀動脈斑塊的破裂，具有高敏感性、高特異性的特點。

根據本發明的實施例，所述早期是指冠狀動脈斑塊發生破裂后的0.5小時。發明人發現，在冠狀動脈斑塊發生破裂后的0.5小時，單獨檢測mir-155-5p、mir-483-5p或mir-451a，其auc均大于0.7，其敏感性分別為89.66,89.66,62.07，特異性分別為44.83,79.31,82.76，表明在冠狀動脈斑塊發生破裂后的0.5小時，單獨檢測mir-155-5p、mir-483-5p或mir-451a具有較好的診斷價值；且發明人發現，聯合診斷mir-155-5p/mir-483-5p或mir-483-5p/mir-451a,診斷價值更高，其auc分別為0.948，0.982，敏感性分別為79.31，96.55，特異性分別為96.55，89.66。

根據本發明的實施例，所述早期是指冠狀動脈斑塊發生破裂后的1小時。發明人發現，在冠狀動脈斑塊發生破裂后的1小時，單獨檢測mir-155-5p或mir-483-5p，其auc均大于0.7，其敏感性分別為72.41，82.76，特異性分別為68.97，82.76，表明在冠狀動脈斑塊發生破裂后的1小時，單獨檢測mir-155-5p或mir-483-5p具有較好的診斷價值；且發明人發現，聯合診斷mir-155-5p/mir-483-5p或mir-483-5p/mir-451a診斷價值更高，其auc分別為0.898，0.891，敏感性分別為89.66，82.76，特異性分別為75.86，79.31。

根據本發明的實施例，所述試劑為用于識別mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的探針、抗體、活性因子或用于擴增mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的引物。用于識別mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a至少之一的的探針、抗體或活性因子能夠特異性識別mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一，用于擴增mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的引物能夠特異性擴增mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一，從而通過pcr，檢測mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一的表達量，其中mir-155-5p、mir-483-5p的表達量增加或mir-451a的表達量下降，是早期冠狀動脈斑塊發生破裂的指示。

根據本發明的實施例，所述探針具有seqidno：1～6所示的核苷酸序列，所述引物具有seqidno：7～12所示的核苷酸序列。具有seqidno：1～6所示的核苷酸序列的探針可通過堿基互補配對與mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一特異性結合，具有seqidno：7～12所示的核苷酸序列的引物能夠特異性擴增mir-155-5p、mir-483-5p以及mir-451a的至少之一，獲得的擴增條帶清晰，雜帶少。

附圖說明

圖1是根據本發明實施例的在治療前(0h)和球囊擴張術后1h(1h)循環mirnas的表達水平；

圖2是根據本發明實施例的在治療前(0h)和cag結束后1h(1h)循環mirnas的表達水平；以及

圖3是根據本發明實施例的在治療前(0h)和球囊擴張后0.5h(0.5h)和1h(1h)循環mirnas的表達水平。

具體實施方式

下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。

(1)研究對象：擇期行經皮冠脈介入治療、僅放入1個支架的穩定冠心病患者，冠心病診斷參照2014年acc/aha/aats/pcna/scai/sts指南。

(2)研究設計

研究依次分三個階段：篩查mirnas差異表達譜(n＝10)、驗證芯片中所有差異表達mirnas(n＝10)、擴大人群進一步驗證第二階段得到的差異表達mirna(n＝29)。

1)篩查mirnas差異表達譜：分別留取患者行球囊擴張前(0h組，即對照組)和擴張后1h(1h組，即斑塊破裂組)的血，提取血漿rna，采用lowdensitytaqmanwhumanmicrornacarda(version2.0)和b(version3.0)array(appliedbiosystems,fostercity,ca)進行mirna表達譜篩查，可檢測754個mirnas表達水平。通過significanceanalysisofmicroarrays(sam)法，分析得到斑塊破裂組相對于破裂前，有24個差異表達mirnas。該24個mirnas隨后進入第二研究階段。

2)驗證芯片中所有差異表達mirnas：為了驗證芯片結果的正確性，將篩查出的24個mirnas在另一組患者中進行real-timepcr檢測。為了除外造影劑對循環mirnas表達水平的影響，發明人還留取了10例僅行造影檢查患者的血液(對照組：造影前，實驗組：造影結束后1h)。最后僅6個mirnas進入第三個研究階段。

3)擴大驗證階段：分別留取患者行球囊擴張前(0h組，即對照組，斑塊破裂前)和擴張后0.5h、1h(實驗組，即斑塊破裂后0.5h和1h)的血，提取血漿rna后，通過real-timepcr檢測上述6個mirnas在另一組患者中的表達水平。最終對斑塊破裂前后表達水平有差異的mirna，進行受試者工作曲線分析，判斷這些mirna作為斑塊破裂標志物的診斷價值。

實施例1斑塊破裂后1h相比于破裂前的mirnas差異表達譜

所有入選患者的基線資料見表1。留取10例患者球囊擴張前(即斑塊破裂前)和球囊擴張后(即斑塊破裂后)1h的血漿標本，提取rna后，進行芯片檢測，發現與斑塊破裂前相比，斑塊破裂1h后出現差異表達的mirna共24個，7個上調mirnas，14個下調mirnas，見表2。

表1：研究人群基線資料

表2：斑塊破裂后差異表達mirnas

以上是兩組間差異表達倍數(foldchange)>2倍，錯誤發現率(falsediscoveryrate)＜0.0001％的mirnas

實施例2驗證上述芯片中24個差異表達mirnas：

在另外10個患者中，留取球囊擴張前(即斑塊破裂前)和球囊擴張后(即斑塊破裂后)1h的血漿標本，提取rna后，通過real-timepcr，檢測由芯片篩查出的24個mirnas表達水平，發現8個仍存在差異表達mirnas，包括mir-155-5p、mir-212-3p、mir-483-5p、mir-1233-3p、mir-20b-5p、mir-122-5p、mir-451a、mir-486-5p，見圖1。此外，由于mir-376a表達豐度很低，在前3個近乎檢測不到，故放棄后續驗證。

由于收取的球囊擴張前后的標本均存在造影劑，故為了消除造影劑對mirna水平的影響，發明人收取了10例患者造影前和造影結束后1h的血漿，檢測上述8個差異表達mirnas的水平，結果發現造影前后，mir-212-3p和mir-1233-3p存在差異表達，見圖2。故總的來說，斑塊破裂后1h和破裂前，差異表達mirna是mir-155-5p、mir-483-5p、mir-20b-5p、mir-122-5p、mir-451a、mir-486-5p。

實施例3擴大人群驗證上述6個差異表達mirnas，并確定這些mirna對斑塊破裂的診斷能力

為了進一步驗證上述6個差異表達的mirnas，最終確定可用于診斷斑塊破裂的mirnas，發明人在另外29例患者中，留取球囊擴張前和擴張后0.5h、1h的血漿標本，提取rna后，對mir-155-5p、mir-483-5p、mir-20b-5p、mir-122-5p、mir-451a、mir-486-5p的水平進行real-timepcr檢測，結果如下：球囊擴張后0.5h，較球囊擴張前，差異表達mirna為mir-155-5p、mir-483-5p、mir-451a；球囊擴張后0.5h，較球囊擴張前，差異表達mirna為mir-155-5p、mir-483-5p，見圖3。

為了評估mir-155-5p、mir-483-5p、mir-451a診斷斑塊破裂的能力，利用上述29例患者real-timepcr數據，發明人進行了受試者工作特征曲線分析(roccurveanalyses)。發現mir-483-5p在斑塊破裂后0.5h和1h的曲線下面積(auc)均最高，分別是0.937(ci：0.841-0.984)和0.894(ci：0.785-0.960)。mirna聯合診斷分析結果顯示，斑塊破裂后0.5h，mir-483-5p和mir-451a的auc最高，為0.982(ci：0.907-0.999)。斑塊破裂后1h，mir-483-5p和mir-155-5p的auc較單個mir-483-5p的auc僅輕度增高，聯合診斷的auc為0.898(ci：0.790-0.962)。三個mirnas單一診斷和聯合診斷斑塊破裂的auc見表3。

通過上述三個階段研究，最終確定mir-155-5p、mir-483-5p、mir-451a是斑塊破裂早期的潛在診斷標志物，用于早期識別高危冠心病患者。

表3：受試者工作特征曲線(receiveroperatingcharacteristiccurves)分析

在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。

盡管上面已經示出和描述了本發明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發明的限制，本領域的普通技術人員在本發明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。

sequencelisting

<110>北京大學人民醫院

<120>試劑盒及試劑在制備試劑盒中的用途

<130>pidc3170001

<160>12

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>23

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>特異性識別mir-155-5p的探針具有的核苷酸序列

<400>1

acccctatcacgattagcattaa23

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>特異性識別mir-483-5p的探針具有的核苷酸序列

<400>2

ctcccttctttcctcccgtctt22

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>特異性識別mir-451a的探針具有的核苷酸序列

<400>3

aactcagtaatggtaacggttt22

<210>4

<211>50

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>特異性識別mir-155-5p的探針具有的核苷酸序列

<400>4

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacacccct50

<210>5

<211>50

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>特異性識別mir-483-5p的探針具有的核苷酸序列

<400>5

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacctccct50

<210>6

<211>50

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>特異性識別mir-451a的探針具有的核苷酸序列

<400>6

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaactca50

<210>7

<211>24

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>用于擴增mir-155-5p的特異性引物

<400>7

gcgcgcgttaatgctaatcgtgat24

<210>8

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>用于擴增mir-155-5p的特異性引物

<400>8

atccagtgcagggtccgagg20

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>用于擴增mir-483-5p的特異性引物

<400>9

gcgcgaagacgggaggaaaga21

<210>10

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>用于擴增mir-483-5p的特異性引物

<400>10

atccagtgcagggtccgagg20

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>用于擴增mir-451a的特異性引物

<400>11

cgcgcgaaaccgttaccattac22

<210>12

<211>20

<212>dna

<213>artificial

<220>

<223>用于擴增mir-451a的特異性引物

<400>12

atccagtgcagggtccgagg20