深州蜜桃中活性化合物及其制備方法和應用與流程

本發明涉及醫藥技術領域，尤其涉及深州蜜桃中的兩種活性化合物及其制備方法和應用。

背景技術：

根據最新統計數據，全世界60歲及以上老齡人口在2014年已經達到了9.01億，預計到2050年這個數字將會超過20億。世界已進入老齡化社會，隨之而來的與衰老相關的疾病已成為日益顯著的問題，包括阿爾茨海默病、帕金森在內的神經退行性疾病是世界性的醫學難題之一。僅在中國，阿爾茨海默病的患者數量在2010年已增加至569萬。在醫藥學領域，尋找防治老年性疾病的藥物已經成為當務之急。

經過對衰老機制的長期研究，本領域內已形成多種衰老學說，包括程序衰老說、體細胞突變說、錯誤成災說，自由基說、神經內分泌說、免疫衰老說等等。由此可見，衰老是一個十分復雜的過程，即便是同一類抗衰老藥物，其發揮藥效的方式也不盡相同，彼此之間無必然聯系。

深州蜜桃來源于河北省深州市，此地具有獨特的地理環境和土壤條件，盛產蜜桃，特色鮮明。深州市也被國家林業局命名為“中國蜜桃之鄉”。深州蜜桃個頭碩大、果型獨特、色澤絢麗、果頂凸尖、縫合線深、皮薄肉細、汁甜如蜜、香味濃郁等獨特的風味特色，被譽為桃中之王，又稱魁桃。歷經兩千多年，一直作為皇室貢品，是獨有的名貴品種，史稱“貢桃”。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種深州蜜桃中的活性化合物1(化合物szmt01)和化合物2，所述的深州蜜桃中的活性化合物為倍半萜苷類化合物，其中化合物1為倍半萜酯苷類新結構化合物，兩種活性化合物具有較強的抗衰老能力。其結構式如下：

上述深州蜜桃活性化合物1的理化性質為：無色粉末；(c0.16,meoh)；分子式為c21h34o8；高分辨率質譜esi-tof-msm/z437.2151[m+na]⁺,理論值：：c21h34o8na⁺437.2151；¹h和¹³cnmr如表1所示。

活性化合物2的理化性質為：無色粉末；(c0.2,meoh)；分子式為c21h36o7；高分辨率質譜esi-tof-msm/z423.2368[m+na]⁺,理論值：c21h36o7na⁺423.2359；¹³cnmr(125mhz,cd3cd)數據如下：δc14.1(c-13),16.0(c-14),23.7(c-8),27.4(c-4),27.6(c-15),40.3(c-5),43.4(c-9),62.8(c-6′),71.8(c-4′),73.9(c-10),75.1(c-2′),76.0(c-1),77.9(c-5′),78.2(c-3′),102.6(c-1′),112.0(c-12),126.0(c-7),129.9(c-3),132.9(c-2),135.7(c-6),146.4(c-11)。

本發明的另一個目的是提供深州蜜桃中兩個活性化合物1(化合物szmt01)和化合物2的制備方法，通過以下步驟實現：

(1)取深州蜜桃果實，粉碎后，置于甲醇中浸提，過濾濃縮，獲得浸提物；

(2)對浸提物進行分離純化，獲得所述深州蜜桃活性化合物1和化合物2。

作為優選，步驟(1)中，所述浸提的溫度為25～30℃，時間為0.5～24h。更優選，所述浸提的溫度為25℃室溫，時間為24h。

進一步地，步驟(2)中，所述分離純化的過程包括：

(a)以甲醇:水溶劑系統作洗脫劑，對浸提物進行第一次分離，獲得目標餾分i；

(b)以甲醇:水溶劑系統作洗脫劑，對所述目標餾分i進行第二次分離，獲得活性餾分ii和活性餾分iii；

(c)以甲醇水溶液為流動相，利用反相hplc對活性餾分ii和活性餾分iii進行第三次分離，獲得所述深州蜜桃活性化合物1和化合物2；

其中：步驟(a)中，采用十八烷基鍵合硅膠開口柱進行分離；甲醇：水溶劑系統按體積比30:70,50:50,70:30,100:0依次洗脫，體積比70:30洗脫的餾分為目標餾分i。

步驟(b)中，采用十八烷基鍵合硅膠開口柱進行分離；甲醇：水溶劑系統按照體積比50:50,55:45,60:40,65:35,70:30,80:20,100:0依次洗脫，體積比60:40和65:35洗脫的餾分為活性餾分ii和活性餾分iii。

步驟(c)中，所述流動相為63％甲醇水溶液；分離過程中，取保留時間為13.9分鐘的餾分，得到深州蜜桃活性化合物1。

步驟(c)中，所述流動相為65％甲醇水溶液；分離過程中，取保留時間為14.5分鐘的餾分，得到深州蜜桃活性化合物2。

本發明的再一個目的是提供所述深州蜜桃活性化合物在制備抗衰老藥物或保健品中的應用，例如將深州蜜桃制成抗衰老蜜桃飲品等。由深州蜜桃活性化合物和藥學上可接受的載體制成。研究表明，化合物szmt01和化合物2在抗衰老化合物的體外篩選模型中，均可以顯著延長酵母細胞的復制性壽命。

所述藥學上可接受的載體是指藥學領域常規的藥物載體，如填充劑、粘合劑、濕潤劑、吸收促進劑、表面活性劑等。

所述填充劑可采用淀粉、蔗糖或微晶纖維素；所述粘合劑可采用淀粉漿、羥丙纖維素、明膠或聚乙二醇；所述濕潤劑可采用硬脂酸鎂、微粉硅膠或聚乙二醇類；所述吸收促進劑可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述表面活性劑可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外還可以加入其它輔劑如香味劑、甜味劑等。

所述抗衰老藥物或保健品的劑型可以是片劑，丸劑，粉劑，分散片，小藥囊劑，酏劑，混懸劑，乳劑，溶液劑，糖漿劑，氣霧劑，軟膠囊，硬膠囊，無菌注射液，搽劑或栓劑；可制成常規、速釋、緩釋或延遲釋放制劑。

本發明的抗衰老藥物可通過各種途徑給予，包括口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射、靜脈注射等。

為了進一步探究化合物szmt01在抗衰老方面的作用機理，我們通過氧化應激實驗對化合物szmt01進行了抗衰老機理初步研究，發現該化合物szmt01在雙氧水存在的條件下可以提高酵母的生存率，同時也發現該化合物是通過調節sod基因的表達，提高酵母的抗氧化能力，從而實現酵母細胞復制性壽命的延長的。

根據氧化自由基學說，氧化壓力是導致衰老的主要原因。即使在正常條件下線粒體也會產生有害的代謝產物—活性氧(ros)，這些物質會破壞細胞膜和生物大分子，例如蛋白和核酸，進而破壞細胞的功能，引起衰老和死亡。

sod是一個與抗氧化應激相關的基因。化合物szmt01不能延長sod敲除后的酵母的復制性壽命，進而證明szmt01是通過調節sod基因的表達，從而實現酵母細胞復制性壽命的延長的。

與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：

(1)在酵母衰老模型k6001釀酒酵母細胞中，本發明從深州蜜桃中提取出的化合物szmt01和2能夠顯著延長酵母細胞的復制性壽命，具有很強的抗衰老能力。

(2)本發明深州蜜桃活性化合物對延緩衰老及治療衰老性疾病方面的新藥研發進行基礎性研究，具有重要的現實意義。

附圖說明

圖1為實施例2中制備獲得的深州蜜桃活性化合物1(a)和化合物2(b)對酵母k6001復制性壽命的影響結果；其中，control表示陰性對照；res(resveratrol)為陽性對照白藜蘆醇(10μm)；17.5μm表示濃度為7.5μm的化合物1，125μm表示濃度為25μm的化合物1；27.5μm表示濃度為7.5μm的化合物2，225μm表示濃度為25μm的化合物2。

圖2為實施例3中活性化合物1對酵母突變菌株δsod1(a)和δsod2(b)復制性壽命的影響結果；其中，control(k6001)表示未添加活性化合物1的k6001酵母；control(δsod1)和control(δsod2)分別表示未添加活性化合物1的k6001酵母突變菌株δsod1和δsod2；17.5μm(δsod1)和17.5μm(δsod2)分別表示添加7.5μm活性化合物1的k6001酵母突變菌株δsod1和δsod2。

圖3為實施例3中活性化合物1氧化應激實驗結果；其中，control(k6001)表示未添加活性化合物1的k6001酵母；control表示陰性對照；res(resveratrol)為陽性對照白藜蘆醇(10μm)；17.5μm表示濃度為7.5μm的化合物1，125μm表示濃度為25μm的化合物1。

具體實施方式

本發明結合附圖和實施例做進一步的說明。

實施例1

1、深州蜜桃中活性化合物1和化合物2的制備，具體步驟如下：

(1)將3.0kg深州蜜桃置于甲醇(工業級)中，室溫下浸提24小時(震蕩)；經抽濾濃縮后，得到甲醇浸提物100.0g。

(2)將甲醇浸提物用十八烷基鍵合硅膠開口柱進行分離，以甲醇：水溶劑系統作洗脫劑，按甲醇：水的體積比＝30:70,50:50,70:30,100:0，依次洗脫，取體積比70:30洗脫的餾分0.7g。

(3)將步驟(2)所取餾分用十八烷基鍵合硅膠開口柱進行純化，以甲醇∶水溶劑系統作洗脫劑，按甲醇∶水的體積比＝50:50,55:45,60:40,65:35,70:30,80:20,100:0依次洗脫，取體積比60:40和65:35分別洗脫的餾分3.7mg和2.3mg。

(4)取步驟(3)所取餾分，用反向hplc純化，色譜條件：色譜柱ods-hg-5(10/250mm)，流速3ml/min，檢測波長210nm，流動相為63％甲醇水溶液，得到活性化合物11.1mg(保留時間為13.9min)；流動相為65％甲醇水溶液，得到活性化合物21.8mg(保留時間為14.5min)。2、活性化合物1和化合物2的理化特征及化學結構分析

經¹³cnmr、¹hnmr、hrms、hsqc、hmbc、noesy分析，結果如下：

化合物1的理化性質：無色粉末，分子式為c21h34o8，高分辨率質譜esi-tof-msm/z437.2151[m+na]⁺。¹hnmr和¹³cnmr的數據見下表1。

表11¹hnmr和¹³cnmr數據(cd3od；δ/ppm,j/hz).

^a500mhz，^b125mhz

化合物2的理化性質：無色粉末，分子式為c21h36o7；高分辨率質譜esi-tof-msm/z423.2368[m+na]⁺。¹³cnmr(125mhz,cd3cd)數據如下：δc14.1(c-13),16.0(c-14),23.7(c-8),27.4(c-4),27.6(c-15),40.3(c-5),43.4(c-9),62.8(c-6′),71.8(c-4′),73.9(c-10),75.1(c-2′),76.0(c-1),77.9(c-5′),78.2(c-3′),102.6(c-1′),112.0(c-12),126.0(c-7),129.9(c-3),132.9(c-2),135.7(c-6),146.4(c-11)。

化合物1和化合物2的結構式如下；

實施例2深州蜜桃中活性化合物1(szmt01)和化合物2的抗衰老活性分析

目前，用于抗衰老研究的生物模型主要有老鼠，線蟲，果蠅和酵母。本實施例選擇釀酒酵母作為抗衰老研究的活性系統；因為酵母是單細胞的真核生物，生命周期短，已獲其完整的基因組數據，是目前常用的衰老模型生物。

與此同時，以白藜蘆醇作為陽性對照，白藜蘆醇是目前眾所周知的、在多種動物模型上顯示抗衰老作用的小分子化合物。

分析方法的步驟如下：

(1)從-30℃冰箱取出k6001酵母菌株，用pbs洗滌三次，每次5ml，除去其中的甘油；再加入1mlpbs，吹打，使其懸浮后加入到5ml液體培養基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中；28℃振搖(160r/min)培養24小時。

(2)培養結束后，用5mlpbs洗滌三次，除去其中的液體培養基，用血球計數板計數，計算酵母的濃度。

(3)采用無水乙醇作溶劑，配制7.5μm，25μm的1和2，10μm的白藜蘆醇，備用。

(4)在滅菌的培養皿中加入5ml的固體培養基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的瓊脂粉)，待培養基凝固后，向其中分別加入步驟(3)中配制好的樣品，溶劑揮發后加入4000個酵母，用涂布器涂抹均勻，28℃恒溫培養48小時。

(5)顯微鏡下每皿隨機數出40個母細胞分別產生的子細胞個數，并記錄、作圖分析，結果見圖1。

由圖1可知，陰性對照(未添加樣品，control)的平均壽命為7.10±0.34，陽性對照(添加10μm的白藜蘆醇，resverstrol)是8.40±0.47*；7.5μm，25μm濃度的1分別是8.87±0.53**,8.37±0.51*；7.5μm，25μm濃度的2分別是8.40±0.54*,8.20±0.41*。(*p<0.05,**p<0.01).

因此，化合物1和化合物2能延長酵母的復制性壽命。

實施例3深州蜜桃中活性化合物1抗衰老機制分析

1、測試1在7.5μm的活性濃度下是否能夠延長敲除了sod基因的k6001酵母突變菌株δsod1和δsod2的復制性壽命。

分析方法的步驟如下：

(1)從-30℃冰箱取出k6001酵母菌株和k6001酵母突變菌株δsod1和δsod2，用pbs洗滌三次，每次5ml，除去其中的甘油；再加入1mlpbs，吹打，使其懸浮后加入到5ml液體培養基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，3％的半乳糖)中；28℃振搖(160r/min)培養24小時。

(2)培養結束后，用5mlpbs洗滌三次，除去其中的液體培養基，用血球計數板計數，計算酵母的濃度。

(3)采用無水乙醇作溶劑，配制7.5μm的1，備用。

(4)在滅菌的培養皿中加入5ml的固體培養基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％的瓊脂粉)，待培養基凝固后，向其中分別加入步驟(3)中配制好的樣品，溶劑揮發后。加入4000個酵母(k6001酵母菌株或者k6001酵母突變菌株δsod1和δsod2，用涂布器涂抹均勻，28℃恒溫培養48小時。

(5)顯微鏡下每皿隨機數出40個母細胞分別產生的子細胞個數，并記錄、作圖分析，結果見圖2。

由圖2可知，k6001菌株上陰性對照(未添加樣品，control)的平均壽命為6.85±0.42，陽性對照(添加10μm的白藜蘆醇，resverstrol)是8.70±0.48**，7.5μm濃度的1是8.40±0.48*；k6001酵母突變菌株δsod1上陰性對照(未添加樣品，control)的平均壽命為6.55±0.33，陽性對照(添加10μm的白藜蘆醇，resverstrol)是6.95±0.32，7.5μm濃度的1是7.05±0.37；k6001酵母突變菌株δsod2上陰性對照(未添加樣品，control)的平均壽命為6.65±0.36，陽性對照(添加10μm的白藜蘆醇，resverstrol)是7.17±0.46，7.5μm濃度的1是7.25±0.32。(*p<0.05,**p<0.01)

因此，化合物1在7.5μm的活性濃度下不能夠延長敲除了sod基因的k6001酵母突變菌株δsod1和δsod2的復制性壽命。

實施例5szmt01提高酵母生存率的活性分析

測試szmt01能否提高酵母的生存率，測試方法如下：

(1)將-30℃保存的野生型酵母by4741用5mlpbs洗滌三次，除去其中的甘油；加入1ml無菌水，吹打使其懸浮，加入到5ml葡萄糖培養基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖)中；將其放入搖床，28℃振搖(160r/min)培養24小時，使其恢復生長能力。

(2)將by4741接種到25ml新的葡萄糖培養基，調整od600值為0.1，然后分別與7.5μm、25μm的膽固醇和陽性對照品(10μm的白藜蘆醇，resverstrol)孵育12小時。

(3)取各組含有相同酵母細胞的培養液5μl滴在含有9mmh2o2的葡萄糖固體培養基(1％的酵母粉，2％的蛋白胨，2％的葡萄糖，2％瓊脂)上；28℃培養3天后觀察酵母的生長狀況并照相，觀察結果見圖3。

由圖3可見，與陰性對照相比，在含有9mmh2o2的葡萄糖固體培養基上，7.5μm、25μm的szmt01明顯提高了酵母的生存率。